Sfidando i neuroni giovani in nuove regioni del cervello possa rivelare importanti intuizioni come l'ambiente scolpisce maturazione e destino neuronale. Questo protocollo descrive una procedura per raccogliere precursori Interneurone da regioni specifiche del cervello e trapiantarli o homotopically o heterotopically nel cervello dei cuccioli postnatali.
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Articolo metodologico
Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce
In questo articolo
Sommario
Abstract
Maturazione e la determinazione di destino neuronale richiede un gioco intricato tra programmi genetici e segnali ambientali. Tuttavia, districare i ruoli di intrinseca vs estrinseche meccanismi che regolano questo processo di differenziazione è un enigma per tutti i neurobiologi inerente allo sviluppo. Questo problema è amplificato per interneuroni GABAergici, una popolazione incredibilmente eterogenee delle cellule che è nato da strutture embrionali transitorie e sottoposti a una prolungata fase migratoria per disperdere tutto il telencefalo. Per esplorare come i diversi ambienti di cervello influenzano interneurone destino e maturazione, abbiamo sviluppato un protocollo per la raccolta dei precursori Interneurone immaturo fluorescente contrassegnati da regioni specifiche del cervello in topi neonati (P0-P2). A questa età, migrazione Interneurone è quasi completa e queste cellule risiedono nei loro ambienti di riposo finale con relativamente poca integrazione sinaptica. Dopo il prelievo delle soluzioni di singola cellula tramite citometria a flusso, questi precursori Interneurone sono trapiantati in P0-P2 wildtype postnatali cuccioli. Eseguendo entrambi omotope (per esempio, corteccia di corteccia) o eterotopica (ad es., corteccia di ippocampo) trapianti, si può valutare come impegnativo immaturi interneuroni in nuovi ambienti di cervello colpisce il loro destino, la maturazione e l'integrazione di circuito. Cervelli possono essere raccolte in topi adulti e analizzati con una vasta gamma di analisi posthoc su cellule innestate, compreso immunohistochemical, elettrofisiologici e transcriptional profiling. Questo approccio generale fornisce gli investigatori con una strategia di test come distinti ambienti di cervello possono influenzare numerosi aspetti dello sviluppo del neurone e identificare se caratteristiche specifiche di un neurone sono principalmente guidate da programmi genetici hardwired o stimoli ambientali.
Introduzione
La funzione corticale appropriata richiede un equilibrio tra neuroni di proiezione eccitatori e inibitori GABAergici, una popolazione estremamente eterogenea con morfologie distinte, proprietà elettrofisiologiche, connettività e neurochimici marcatori. Sviluppo anormale e funzione di interneuroni (e sottogruppi specifici Interneurone) è stato collegato a pathobiology di disturbi psichiatrici come la schizofrenia, autismo ed epilessia1,2,3. Inoltre, molti geni implicati in questi disordini del cervello sono fortemente arricchiti in interneuroni giovane4....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state condotte secondo le linee guida del National Institutes of Health e sono state approvate dal NICHD Animal Care e uso Comitato (ACUC). Il protocollo descritto di seguito utilizza NKX 2.1-CreC / +; Ai9+ /- cuccioli per la raccolta dei precursori Interneurone MGE-derivato, ma può essere eseguita su qualsiasi linea di topo reporter fluorescente desiderata. Sia maschili che femminili primi topi postnatali (P0-P2) sono stati utilizzati indiscriminatamente per il tessuto donatore e host.
1. soluzione preparazione
- Preparare il liquido cerebrospinale artificiale di ....
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Risultati
Questo protocollo viene illustrato come raccogliere regioni specifiche del cervello dal cervello postnatale precoce (Figura 1-2), raccogliere dissociazioni singola cella dei precursori Interneurone e trapianto di queste cellule in varie regioni del cervello in ingenuo WT cuccioli postnatali (Figura 3). Per l'analisi posthoc, cervelli che hanno ricevuto gli innesti Interneurone precursore sono state raccolte tra P.......
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Discussione
Un aspetto critico di questo protocollo è massimizzare le possibilità di sopravvivenza delle cellule. Garantire che i tessuti e le cellule siano sempre in ghiaccio freddo carboxygenated sACSF è necessario promuovere la sopravvivenza delle cellule. Ciò richiede una strategia di dissociazione per ridurre al minimo la lunghezza del tempo che le cellule spendono in varie soluzione e all'esterno dell'ambiente di cervello e di dissezione efficiente. A seconda del numero di regioni del cervello essere sezionato e trapiantato, p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (K99MH104595) e il programma di ricerca intramurale NICHD a T.J.P. Ringraziamo Gord Fishell, nel cui laboratorio questo approccio originalmente è stato stabilito.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | Sigma | S7653 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S6297 | |
| Cloruro di potassio | Sigma | P9541 | |
| Fosfato di sodio monobasico | Sigma | S0751 | |
| Cloruro di calcio | Sigma | C5080 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma | M2670 | |
| Glucosio | Sigma | G7528 | |
| Saccarosio | Sigma | S7903 | |
| Matrici cerebrali | Roboz | SA-2165 | Necessario solo se si raccoglie lo striato |
| Punta fine Dumont Pinze | Roboz | RS-4978 | |
| Forbici per microdissezione | Roboz | RS-5940 | |
| Lamette da barba | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pipette Pasteur | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manipolatore manuale con supporto | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| Provette da 5 ml a fondo tondo in plastica | ThermoFisher | 149591A | |
| Piastre di Petri da 60 mm | ThermoFisher | 12556001 | |
| Piastre di Petri da 100 mm | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| Filtri DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um | Sysmex | 04-0042327 | |
| Tripano blu | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Emocitometro | ThermoFisher | 02-671-6 |
Riferimenti
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A.
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Ristampe e permessi
