Un saggio di Neurosphere per valutare l'attivazione delle cellule staminali neurali endogene in un modello murino di ferita del midollo spinale Minimal

Sommario

Qui, noi dimostrare le prestazioni di un modello di lesione minima del midollo spinale in un topo adulto che risparmia la nicchia di canale centrale alloggiamento cellule staminali neurali endogene (NSC). Vi mostriamo come l'analisi di neurosphere può essere usata per quantificare l'attivazione e migrazione delle CSN definitivo e primitiva dopo la lesione.

Abstract

Cellule staminali neurali (NSC) nel midollo spinale adulto dei mammiferi sono una popolazione relativamente mitoticamente quiescente di periventricular celle che può essere studiato in vitro facendo uso dell'analisi di neurosphere. Questo saggio di formazione di colonie è un potente strumento per studiare la risposta di NSC a fattori esogeni in un piatto; Tuttavia, questo utilizzabile anche per studiare l'effetto delle manipolazioni in vivo con la corretta comprensione dei punti di forza e i limiti del dosaggio. Una manipolazione di interesse clinico è l'effetto della ferita sull'attivazione endogena di NSC. I modelli attuali di ferita del midollo spinale rappresentano una sfida di studiare questo come la gravità di modelli comuni di contusione, la compressione e il transection causano la distruzione della nicchia NSC presso il sito della ferita dove risiedono le cellule staminali. Qui, descriviamo un modello minima ferita che provoca danni localizzati sulla superficie dorsolateral superficiale del più basso livello toracico (T7/8) del midollo spinale di topo adulto. Questo modello di lesione Risparmia il canale centrale a livello della lesione e consente di analizzare il NSC che risiedono a livello della lesione a vari tempi dopo la lesione. Qui, ci mostrano come il saggio di neurosphere può essere utilizzato per studiare l'attivazione di due popolazioni distinte, lineally-correlati, di NSC che risiedono nella regione periventricular del midollo spinale - NSC primitiva e definitiva (pNSCs e dNSCs, rispettivamente). Dimostriamo come isolare e cultura questi NSCs dalla regione a livello della ferita e il sito di lesione della materia bianca periventricular. Nostro post-chirurgica del midollo spinale le dissezioni Visualizza numeri aumentati di pNSC e neurosfere dNSC-derivato dalla regione delle corde feriti rispetto ai controlli, parlando loro attivazione tramite lesioni periventricular. Inoltre, a seguito di infortunio, neurosfere dNSC-derivato può essere isolato dal sito di lesione — che dimostra la capacità di NSC per migrare da loro nicchia periventricular a siti della lesione.

Introduzione

Il sistema nervoso centrale contiene una sottopopolazione di cellule staminali multipotenti, autorinnovabile che hanno la capacità di dare origine a tutte le diverse cellule neurali maturo tipi^1,2,3,4. Queste cellule staminali neurali (NSC) risiedono in nicchie specializzate nel cervello e nel midollo spinale e può essere attivate a seguito di infortunio per proliferare, migrare e differenziarsi in cellule neurali mature. NSC e la loro progenie sono stati indicati a migrare verso il sito di lesione lesione corticale modelli^5,6. Nel cervello, NSC sono state indicate per eseguire la migrazione da ventricoli laterali al sito della ferita dove si differenziano in astrociti che contribuiscono alla formazione di cicatrice gliale⁷. Nel midollo spinale, tuttavia, pochi studi sono stati fatti per chiedere se queste stesse NSC endogena può essere sfruttata per promuovere il recupero dopo la lesione del midollo spinale. Infatti, c'è attualmente un dibattito su se l'attivazione del pool di cellule staminali nel midollo spinale richiede un danno fisico diretto della nicchia periventricular fodera il canale centrale⁸ o se il danno al midollo spinale cavo di parenchima (lasciando il gambo nicchia delle cellule intatta) è sufficiente attivare endogeno NSCs⁹.

Un numero di modelli di lesione (sic) del midollo spinale è stato usato per studiare la fisiopatologia delle lesioni acute e croniche. Questi modelli sono stati utilizzati anche per testare potenziali terapie per il trattamento di SCI attraverso il neuroprotection, immunomodulazione e sviluppo delle cellule trapianto/sostituzione strategie^10,11,13. Modelli correnti includono lesioni compressione e/o contusione, che causano i deficit funzionali su larga scala, nonché vaste lesioni e cavitazioni nel cavo^14,15. Le cicatrici gliali risultante possono estendersi su diversi segmenti spinali insieme alla maggioranza della circonferenza/larghezza del midollo spinale¹⁶. Così, mentre questi modelli sono clinicamente rilevanti, permettersi sfide significative per studiare la risposta di NSC endogena dopo la lesione. Ci sono modelli chimici di lesioni che possono essere adattate per causare lievi forme di pregiudizio che può risparmiare il canale centrale¹⁷. Tuttavia, questi tipi di lesioni concentrano sul demyelination connesso con SCI e non sono modelli clinicamente rilevanti per il danno fisico e/o meccanico connesso con sci traumatico.

Per risolvere le limitazioni degli attuali modelli di lesione, abbiamo adattato un ago pista SCI modello minimo, originariamente sviluppato nel ratto⁹, per l'applicazione in un modello di topo adulto. Il nostro modello adattato ferita può creare una lesione coerenza della regione dorsolateral del midollo spinale del mouse e il canale centrale presso i livelli della ferita di ricambio. Il vantaggio di questo modello è che consente lo studio della cinetica di NSC dopo lesioni e della loro potenziale espansione radiale al sito della ferita. L'uso di un modello del mouse consente anche l'utilizzo di topi transgenici che consentono il rilevamento di lignaggio di NSC endogena e la loro progenie dopo la lesione. Le proprietà di NSC possono essere valutate ulteriormente utilizzando una forma modificata del test in vitro neurosphere che è stato introdotto in questo protocollo.

Il dosaggio di neurosphere è un in vitro formanti colonie test che consente l'isolamento delle CSN in presenza di mitogeni. Alle densità clonale placcatura, NSC individuali proliferano per dare origine a colonie sferiche digalleggiante di cellule che sono costituite da una piccola sottopopolazione delle CSN e una stragrande maggioranza di progenitori^18,19. Nel nostro protocollo, dimostriamo l'isolamento di due distinti, lineally senile NSCs dalla regione periventricular del midollo spinale — in condizioni basali e dopo il nostro modello SCI minimo. Definitivo neurale staminali nestina espressa in cellule (dNSCs) e la proteina silicea fibrillare glial (GFAP) e sono coltivate in presenza di fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita del fibroblasto (FGF) e l'eparina (insieme definito come EFH)²⁰. Questi dNSCs sono rari nel midollo spinale ingenuo, dando vita a pochissimi neurosfere in vitro. Tuttavia, mostriamo che dNSCs sono attivati dopo SCI minimal, espandendo i numeri di neurosfere isolato dal regione periventricular²¹. Cellule staminali neurali primitive (pNSCs) sono a Monte del dNSCs del lignaggio delle cellule staminali neurali. pNSCs sono rapidi, eccessivamente rari bassi livelli del marcatore pluripotenza Oct4 e sono la leucemia fattore inibitorio (LiF) reattivo²². pNSCs non fanno neurosfere quando isolato dal midollo spinale di topo adulto a causa della presenza della proteina basica della mielina (MBP) in colture primarie; Tuttavia, pNSC neurosfere possono essere isolate da topi deficienti di MBP e i loro numeri sono estesa lesione seguente — simili a dNSCs²¹. Infine, mostrare che neurosfere dNSC-derivato può essere isolato dal sito della lesione a presto volte seguito minimo SCI. Questi risultati dimostrano che il nostro modello di lesione e saggi possono valutare le caratteristiche di attivazione di periventricular NSC come la loro capacità di proliferare e migrare in risposta alla lesione.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal comitato di cura animale presso l'Università di Toronto ed è in conformità con la "Guida per la cura e uso di animali da esperimento" (2^nd Edition, Consiglio canadese su Animal Care, 2017).

1. minima del midollo spinale lesioni chirurgia

Nota: Prima dell'intervento, assicurarsi che tutti i materiali e gli strumenti chirurgici sono sterilizzati con metodi appropriati (Figura 1A).

1. Costruire un arco di supporto toracico di roll-up 4 – 5 quadrati di garza e taping loro insieme in mezzo per ottenere un fisso rotolo di garza.
2. Posizionare il mouse nella camera di induzione e avviare l'anestesia con isoflurano 5%. Verificare l'assenza di un riflesso di pizzico di punta prima di procedere, così come in tutta la procedura. Come la chirurgia può prendere verso l'alto di 30 min per completare, ottimizzare per l'esposizione minima isoflurano (5 min a 5%) e il tempo rimanente al 2 – 3%.
3. Trasferire il mouse ad un cono di naso attaccato alla macchina anestetica a dose di mantenimento di 2 – 3% isoflurane. Utilizzare Tosatrici per rimuovere pelliccia dal dorso dell'animale da metà schiena fino al collo/orecchie per esporre un'area ampia rettangolare di pelle per la chirurgia.
4. Trasferire il mouse a uno strumento stereotassica mettendo il naso nel cono di naso associato e stabilizzando il cranio con le barre di orecchio. Una volta che il mouse è garantito nel dispositivo stereotassica, mantenere isoflurano 5% durante il posizionamento delle barre dell'orecchio e inferiore al 2 – 3%.
5. Somministrare i farmaci analgesici preoperatori intraperitonealmente — Meloxicam (2,0 mg/kg). Applicare generosamente la lubrificazione dell'occhio sugli occhi aperti del mouse per evitare disidratazione corneale quando si è sotto anestesia.
6. Posizionare l'arco di supporto toracico sotto l'addome del mouse mentre raddrizzare il corpo del mouse e la colonna vertebrale tirando leggermente la base della coda. Utilizzare laboratorio etichettatura nastro per fissare la coda e tutti gli arti estesi in una posizione di stella-come. Una volta sicuro, spingere l'arco di supporto toracico rostralmente, dall'addome del mouse verso il torace superiore — al fine di puntellare la spina dorsale toracica (Figura 1B).
7. Preparare un campo operatorio sterile di disinfettare la zona di pelle pelliccia-ritagliato preparata al punto 1.3 con etanolo al 70%, seguita da povidone-iodio. Ripetere due volte. Applicare un telo chirurgico sterile per mantenere un campo ampio sterile.
8. Utilizzando una lama per bisturi #10, praticare un'incisione verticale parallelo all'asse longitudinale dell'animale dal punto di equidistanza di entrambi scapole alla curvatura della spina dorsale toracica. Ritrarre la pelle per l'esposizione dei tessuti molli e il contorno della colonna vertebrale (Figura 1).
9. Identificare il bordo inferiore del rilievo grasso suprascapular (questo delimita il livello vertebrale di T4/5). Con la stessa lama #10, con attenzione, ma con forza, tagliare lungo entrambi i lati dell'osso vertebrale 9 – T8/T5 per staccare i tendini di retro-muscolare dalla colonna.
10. Inserire i denti dei riavvolgitori i siti di incisione su entrambi i lati della spina dorsale. Regolare l'esposizione espandendo Divaricatori per elevare sufficientemente la colonna vertebrale senza troppo sforzo per gli strati di muscolo retratto (Figura 1).
11. Sotto il microscopio chirurgico, pulire accuratamente il residuo muscolo e altri tessuti molli che ricoprono la colonna vertebrale per esporre l'osso vertebrale (Figura 1E). Identificare le vertebre che verranno rimosso clasping le apofisi delle vertebre con forcipe dentato e spostandolo leggermente in alto e verso il basso.
    Nota: Questo dovrebbe consentire l'identificazione delle articolazioni intervertebrali ed esporre le piccole aperture (forami intervertebrali) sotto le vertebre di interesse.
12. Inserire una testa delle forbici curve smussate in entrambi i lati del forame intervertebrale esposto, caudale alla lamina vertebrale essere asportata e tagliare le giunzioni di collegamento intervertebrale bilateralmente.
13. Sollevare la lamina verso l'alto e tagliare l'attacco superiore della lamina per isolare e rimuovere l'osso.
    Nota: Questo esporrà il sac dural intatto contenente il midollo spinale (Figura 1F). Ci potrebbe essere eccessivo sanguinamento che può essere controllato posizionando pretagliato garza di 1 x 1 cm sulle zone interessate e/o lavaggio con PBS sterile.
14. Con la vena dorsale del midline che serve come punto di riferimento, è necessario inserire un albero piegato di 45° di una punta ad ago 30g (con ago smusso rivolto verso l'alto) la superficie dorsolateral del midollo spinale (circa 1 mm di profondità) a circa 0,5 mm laterale su entrambi i lati della linea mediana.
15. Spostare l'ago ~ 2 mm da caudale rostrale (parallelo alla linea mediana) in modo che l'intera lunghezza della smussatura dell'ago viene inserito il cavo. Rimuovere l'ago di ripercorrere attraverso il percorso di entrata (Figura 1).
    Nota: non ci dovrebbe essere Nessun sanguinamento ma gonfiore del tessuto spinale può essere visto in questo passaggio.
16. Per chiudere la ferita, è necessario rimuovere il riavvolgitore e suturare i muscoli della schiena su entrambi i lati della ferita insieme nel midline usando una sutura riassorbibile 6-0. Utilizzare una sutura seta sterile 4-0 per chiudere successivamente la pelle sovrastante.
17. Applicare pomata antibiotica sulla parte superiore della pelle superficiale suturata per prevenire l'infezione postoperatoria con la punta di un bastoncino di cotone. Somministrare un analgesico post-operatorio di 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea con fluidi (1 mL di soluzione di Ringer lattato).
18. Spegnere il vaporizzatore isoflurano e ossigeno. Rimuovere il mouse dal dispositivo stereotassica e posto in una gabbia pulita con alcuna biancheria da letto.
19. Posizionare il mouse nella gabbia circa 30 cm di distanza una lampada di calore per il recupero dall'anestesia e monitor un comportamento dopo il risveglio. Il mouse dovrebbe svegliarsi entro 5 – 10 min e hanno la funzione dell'arto posteriore con possibile paresi e/o debolezza di coda al risveglio.
20. Monitorare il comportamento del mouse sopra i prossimi giorni e fornire adeguata assistenza post-operatoria e analgesici (cioè, poltiglia, lattato soluzione fluida sottocutanea, 0,1 mg/kg la buprenorfina di Ringer 2 volte al giorno per via sottocutanea per 2 – 3 giorni e il peso adeguato monitoraggio ) in conformità ai regolamenti di struttura animale locale e su base individuale come recupero possono variare.

2. Neurosphere Assay dissezione

Nota: Seguire le procedure di corretta sterili per coltura in tutto.

1. Preparazione di una soluzione enzimatica
   1. Aggiungere 32 mL di Earle bilanciato sale soluzione (EBSS) alla bottiglia in vetro contenente albumina ovomucoide inibitore e delicatamente vortice fino a completa dissoluzione.
   2. Aggiungere 5 mL di EBSS un flaconcino di vetro pre-porzionate papaina e posto in un bagno di acqua di 37 ° C per sciogliere. La soluzione diventerà chiaro (soluzione 1).
   3. Prendere 500 µ l di EBSS e aggiungere la dnasi pre-porzionata di vetro I flacone per ottenere una concentrazione di 1 mg/mL (soluzione 2). Mescolare molto delicatamente inclinando il flaconcino di avanti e indietro e aggiungere 250 µ l di questa miscela alla soluzione 1.
      Nota: Tutte le soluzioni realizzate (soluzione 1 e 2) sono sufficienti per l'elaborazione di due pezzi di tessuto. Se l'elaborazione di più pezzi di tessuto, accogliere con più preparazione di soluzione.
2. Dissezione e preparazione tessuto
   1. Posto un wipe di laboratorio imbevuto di isoflurane nella gabbia del mouse e lasciare 2-3 min per vapori ad anestetizzare completamente del mouse. Knockout seguente, rimuovere il mouse dalla gabbia e confermare l'assenza di una reflex di punta-pizzico.
   2. Eseguire dislocazione cervicale con un oggetto metallico (cioè, gabbia metallica card) per eutanasia animale. Spruzzare generosamente l'animale eutanasizzato dal suo collo al centro dietro con etanolo al 70%.
   3. Alla base del cranio, usare le forbici per tagliare la testa e gettare in un sacchetto di bio. Fare un'incisione del midline nella pelle lungo tutta la lunghezza della parte posteriore per esporre il muscolo e contorno ossea vertebrale (Figura 2A).
   4. Sollevare il lato mediale della ogni scapola (cioè., scapola — identificato dal sovrastante rilievo grasso) e usare le forbici per tagliare i tessuti molli (tra le scapole e vertebre). Separata completamente per esporre la colonna vertebrale sottostante.
   5. Seguendo la curvatura della colonna vertebrale, inserire lo stesso paio di forbici il diaframma toracico superiore e isolare la colonna vertebrale di tagliando allegati nervature, muscoli e organi interni (Figura 2B).
   6. Inserire la caudale forame vertebrale/apertura di forbici e tagliare le articolazioni intervertebrali su entrambi i lati delle lamine (superficie dorsale). Prestare particolare attenzione a non danneggiare il cavo intatto. Continuare questo processo fino al livello desiderato e/o lunghezza del cavo è esposto.
   7. Tagliare con cura il spinal nerve(s) che si estende lateralmente dal cavo prima di trasferire il tessuto del midollo spinale in una capsula di Petri con liquido cerebrospinale artificiale regolare. Mantenere il campione sul ghiaccio (Figura 2).
   8. Sotto un microscopio di dissezione, tagliare il tessuto del midollo spinale per includere ~ 2 mm rostrale e caudale al sito di lesione. Utilizzare due paia di pinze per separare delicatamente il cavo in 2 metà longitudinalmente lungo le fessure dorsali e ventrali (Figura 2').
   9. Con microforbici, tagliare fuori la questione di bianco dorsolateral ferita. Posizionare il pezzo in una provetta conica da 15 mL.
   10. Tenere in mano una metà del midollo spinale verso il basso con il forcipe, stuzzicare e rimuovere utilizzando un altro paio di una pinzetta lungo nella misura rostrocaudal del midollo spinale per isolare la regione desiderata periventricular della materia bianca. Ripetere per l'altra metà del midollo spinale.
   11. Inserire pezzi di tessuto periventricular in un provette coniche da 15ml separato. Utilizzare microforbici e tritare delicatamente il tessuto contro le pareti dei tubi conici.
       Nota: Le modifiche di dissociazione del tessuto sono da papaina dissociazione sistema protocollo²³ e tessuto precedentemente descritto preparazione procedure²⁴.
   12. Aggiungere 2,5 mL della nuova soluzione 1 (punto 2.1.3) per il campione di tessuto e posizionare su un rocker a 37 ° C per 30 min.
   13. Triturare delicatamente il tessuto nella soluzione con una punta di pipetta 1.000 µ l. Centrifugare la sospensione cellulare nuvoloso a 300 x g per 5 minuti a TA.
   14. Preparare soluzione 3 con 2,7 mL di soluzione salina di Earle bilanciato, 300 µ l di soluzione di inibitore ovomucoide (punto 2.1.1) e 150 µ l della dnasi ho soluzione (punto 2.1.3).
   15. Scartare il surnatante da passaggio (passaggio 2.2.13) e risospendere in 1,5 mL di soluzione 3 dal passaggio precedente (passaggio 2.2.14).
   16. Strato di questa nuova sospensione cellulare (passo 2.2.15) in cima a 5 mL di soluzione di inibitore di ovoimucoid (punto 2.1.1) in un tubo conico di 15 mL nuovo per creare un gradiente di densità discontinua. Centrifugare a 300 x g per 5 min a RT.
   17. Eliminare il surnatante e risospendere in 2 mL di terreno neurobasal. Centrifugare a 300 x g per 3 min a RT.
   18. Eliminare il surnatante e risospendere in 1 mL di neurobasal media. Filtrare la sospensione utilizzando un colino di cella di 20 µm seguito da 4 mL di media per un volume totale di 5 mL.
3. Placcatura
   1. Preparare terreni di coltura per la crescita neurosphere completando neurobasal media con fattore di crescita epidermico (20 ng/mL) / fattore di crescita del fibroblasto (20 ng/mL) / eparina (2 µ g/mL) [per NSC definitiva] o leukemina fattore inibitorio (10 ng/mL) [per primitiva NSC]. Aggiungere 10 mL di entrambi media in un matraccio di cultura del tessuto da 25 mL.
   2. Utilizzare un emocitometro e colorante Trypan blu per calcolare il numero di cellule in sospensione da (passo 2.2.18)²⁵. Una volta calcolato, è possibile aggiungere celle alla coltura del tessuto boccette preparate al (punto 2.3.1) ad una densità clonale di 10 cellule / µ l e luogo matraccio di cultura del tessuto con celle aggiunte in incubatrice per 24 h (37 ° C, umidità 95%, 5% CO₂).
      Nota: Un esempio della tecnica del conteggio è il seguente: prendete 10 µ l della sospensione cellulare e mix con 10 µ l di colorante blu di Trypan. Aggiungere 10 µ l di questa miscela in un emocitometro. Sotto un microscopio ottico di 10x, contare il numero di cellule vive e sommare tutte le celle conteggiate in 4 dei 4x4 quadranti. Utilizzare la formula: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] per dare il volume della sospensione di cellule piastrate in ciascuna beuta di coltura del tessuto 25 mL per garantire densità clonale (10 cellule / µ l).
   3. Dopo 24 h, delicatamente la boccetta di turbinio e versare il contenuto in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 300 x g per 5 min a RT.
   4. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 1 – 2 mL di terreno neurobasal fresco.
   5. Ripetere il punto 2.3.2 per contare il numero di cellule in sospensione e piastra cellule clonali densità in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti contenenti 500 µ l di loro mezzi rispettivi mitogene completate (EFH per definitiva crescita NSC) e LIF per crescita di NSC primitivo.
      Nota: Utilizzare la formula adattata (5.000 / [X cellule/4) x 2 x 10 x 1.000) per calcolare il volume della sospensione delle cellule per essere placcato in ciascuna contenente ben 500 µ l di media.
   6. Posizionare le piastre contenenti cellule nell'incubatrice (37 ° C, umidità 95%, 5% CO₂) a crescere per 7 giorni.
4. Conteggio
   1. Dopo 7 giorni nella cultura, rimuovere le piastre e mostra sotto un microscopio chiaro. Quantificare neurosfere contando colonie sferiche che sono > 80 µm di diametro per culture dNSCs e > 50 µm di diametro per culture pNSCs.
      Nota: Se lo si desidera, neurosfere può essere ulteriormente i²⁶ o differenziato. Se le cellule non sono più necessari, smaltire aggiungendo accelerato perossido di idrogeno ai pozzetti (circa 1 mL) per 20 min, in modo che il colore del mezzo diventa giallo. Poi scartare.

Risultati

A seguito della chirurgia, i topi dovrebbero sperimentare minimo deficit motori, che possono includere coda e possibile paresi dell'arto posteriore per fino a 24 h. Dopo questo tempo, i topi non dovrebbero verificarsi nessuna paralisi dell'arto posteriore e/o paresi e cambiamenti minimi nell'andatura.

La figura 3 Mostra i risultati rappresentativi del dosaggio di neurosphere 5 giorni che seguono la ...

Discussione

Durante la procedura chirurgica, ci sono pochi passaggi critici dove il ricercatore dovrebbe prestare particolare attenzione al fine di ottenere i risultati ottimali e ridurre al minimo la variabilità tra gli animali. Cura deve essere presa con l'anestesia per inalazione (isoflurano) durante la chirurgia come l'anestetico ha dimostrato di avere effetti neuroprotective con esposizione prolungata²⁷. Di conseguenza, quando si studia la capacità rigenerativa del midollo spinale dopo la ferita, fare un...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agricola Retractor	Fine Science Tools	17005-04
Moria Vannas-Wolff Forbici a molla (curve)	Fine Science Tools	15370-50	Personalizza al momento dell'ordine per ottenere punte smussate
Pinze Graefe (dritte, 1 x 2 denti)	Fine Science Tools	11053-10
Pinze Graefe extra fini (curve, seghettate)	Fine Science Tools	11152-10	O qualsiasi altra pinza per suturare
Hartman Hemostats (Straight)	Fine Science Tools	13002-10	O qualsiasi altro appropriato per suturare
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	O qualsiasi altro
tagliacapelli	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	o qualsiasi altro
stereotassico appropriato strumento	Stoeling	51500	o qualsiasi altro
appropriato Buprenorfina			o qualsiasi appropriato sanzionato la mia struttura di cura degli animali
Meloxicam			o qualsiasi appropriato sanzionato dalla struttura di cura degli animali
Tears Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	o qualsiasi altro
02225875 DIN		Baxter International Inc	o qualsiasi altro appropriato per anestesia
Q-tips Cottom Swabs	amazon.ca
Garza di cotone	Fisher Scientific	13-761-52
30 G Aghi	Becton Dickinson	305106	Per lesioni
25 G Aghi	Becton Dickinson	305122	Per iniezioni di farmaci
Siringhe da 1 ml Becton	Dickinson	3090659	per iniezioni di farmaci
Siringhe da 3 ml Siringhe	Becton Dickinson	309657	per iniezioni di fluidi
4-0 uoftmedstore.com di sutura		2297-VS881	per sutura cutanea
6-0	uoftmedstore.com	VS889	per sutura muscolare
Unguento alla polisporina	amazon.ca	102051
Vaporizzatore di isoflurano	VetEquip	901806
provette coniche da 15 mL	ThermoFisher ThermoFisher		ThermoFisher
	ThermoFisher		Trypan
Blue	ThermoFisher
Emocitometro	ThermoFisher
Centrifuga	ThermoFisher		Qualsiasi
strumento di dissezione standard	Strumenti per la
fine Microscopio di dissezione	Zeiss	Stemi 2000
Microscopio di conteggio	Olympus	CKX41
Neural Basal-A Medium	Invitrogen	10888-022
B27	Invitrogen	17404-044
Penicillina- Streptomicina	Gibco	15070
L- Glutammina	Gibco	25030
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	12700075
30% Glucosio	Sigma	G6152	1 M, 9,01 g in 100 mL dH2O
1 M Glucosio
7,5% NaHCO3	Sigma	S5761	155 mM, 1,30 g in 100 mL dH2O
155 mM NaHCO3
1 M HEPES	Sigma	H3375	23,83 g in 100 mL dH2O
Apo-Transferrina	R& D Systems	3188-AT
Putrescine	Sigma	P7505
Insulina	Sigma	I5500
Selenio	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Sistema di dissociazione della papaina	Worthington Biochemical Corporation	PDS	1 flaconcino di papaina può essere utilizzato per 2 campioni
Epidermal Growth Factor	Invitrogen	PMG8041	Powder ricostituito con 1mL di miscela ormonale e aliquotato in fiale da 20uL da conservare nel congelatore
Fibroblast Growth Factor	Invitrogen	PHG0226	Polvere ricostituita con 0,5 mL di Hormone Mix e aliquotata in 20 μ L fiale da conservare nel congelatore
Eparina	Sigma	H3149
Fattore inibitorio della leucemia	In casa
Emocitometro
a tripano blu
Piastre a 24 pozzetti	NUNC
2 M NaCl	Sigma	S5886	11,69 g in 100 mL dH2O
1 M KCL	Sigma	P5405	7,46 g in 100 mL dH2O
1 M MgCl2	Sigma	M2393	20,33 g in 100 mL dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1,59 g in 100 mL dH2O