Articolo metodologico

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

DOI:

10.3791/57731

⸱

13 settembre 2018

 ,  , 
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce ai ricercatori con un nuovo strumento per monitorare la fedeltà della trascrizione in molteplici organismi di modello.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trascrizione accurata è necessaria per la fedele espressione dell'informazione genetica. Sorprendentemente, però, piccolo è conosciuto circa i meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione. Per colmare questa lacuna nella conoscenza scientifica, abbiamo recentemente ottimizzato il dosaggio di cerchio-sequenziamento per rilevare errori di trascrizione in tutto il trascrittoma di Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Questo protocollo di fornire ai ricercatori con un nuovo potente strumento per mappare il paesaggio di errori di trascrizione nelle cellule eucariotiche, in modo che i meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione possono essere chiariti in dettaglio senza precedenti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il genoma fornisce un preciso progetto biologico della vita. Per implementare correttamente questo programma d'azione, è importante per il genoma deve essere trascritto per primo con grande precisione. Tuttavia, la trascrizione è improbabile che sia privo di errori. Ad esempio, RNA polimerasi lungamente sono state conosciute per essere soggetta a errori in vitro1,2, e recentemente è stato indicato che commettono errori in vivo come pure3,5,6, specialmente quando si confronta con DNA danni7,8,9,10. Prese insieme, queste osservazioni indicano che gli errori di trascrizione avviene con continuità in tutte le cellule viventi, suggerendo che potrebbe essere una potente fonte di proteine mutate.

Questo processo, chiamato mutagenesi trascrizionale, differisce dal classica mutagenesi in due modi. In primo luogo, in contrasto con le mutazioni genetiche, gli errori di trascrizione interessano sia in cellule post-mitotiche che mitotiche, come essi non dipendono dalla replicazione del DNA. Lo studio dei meccanismi che influenzano la fedeltà della trascrizione, pertanto, fornirà informazioni preziose sul carico mutazione di cellule post-mitotiche e mitotiche. È interessante notare che, gli errori di trascrizione recentemente sono stati implicati nella promozione di proteina aggregazione11,12,13 e sono stati supposti per contribuire a entrambi di carcinogenesi10 e la sviluppo di resistenza agli antibiotico nei batteri14.

In secondo luogo, in contrasto con le mutazioni genetiche, gli errori di trascrizione sono natura transitori. Loro esistenza temporanea è particolarmente impegnativo, perché rende gli errori di trascrizione estremamente difficile da rilevare. Ad esempio, mentre diversi laboratori hanno messo a punto saggi reporter prezioso per lo studio di mutagenesi trascrizionale, queste analisi sono solo in grado di misurare gli errori di trascrizione in un numero limitato di contesti e organismi modello4,15. Per superare queste limitazioni, molti ricercatori si sono rivolti a tecnologia di sequenziamento di RNA (RNA-seq), che permette teoricamente gli errori di trascrizione da registrare in tutto il trascrittoma di qualsiasi specie. Tuttavia, questi studi sono facilmente confusi dai manufatti di costruzione di libreria, quali errori di trascrizione inversa, errori di amplificazione di PCR e la natura soggetta a errori di impostazione della sequenza stessa. Per esempio, reverse transcriptases commit circa un errore ogni ~ 20.000 basi, mentre la RNA polimerasi (RNAPs) sono tenute a compiere un solo errore ogni 300.000 basi5,6. Poiché il tasso di errore di trascrizione d'inversione da solo nani il tasso di errore della polimerasi del RNA all'interno delle cellule, è praticamente impossibile distinguere gli errori di trascrizione vera da artefatti causati dalla preparazione libreria in dati di RNA-Seq tradizionali ( Figura 1a).

Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una versione ottimizzata del cerchio-sequenziamento (Cirseq, o C-seq d'ora in poi) dosaggio5,16. Questo test consente di rilevare gli errori di trascrizione e altre rare varianti nel RNA in tutto il trascrittoma5. L'analisi di sequenziamento circolare porta questo nome perché un passo fondamentale in questa analisi ruota intorno circularization di RNA. Una volta che gli obiettivi del RNA sono circolarizzazione, sono inverso trascritto in una rotolamento cerchio moda, per produrre molecole di cDNA lineare che contengono numerose copie dello stesso modello di RNA. Se un errore era presente in uno di questi modelli, questo errore potrebbe anche essere presente in ogni singola ripetizione contenute all'interno della molecola di cDNA. Al contrario, gli errori introdotti dal trascrizione inversa, amplificazione di PCR o sequenziamento tendono a verificarsi in modo casuale e così sarà presenti in solo uno o due ripetizioni. Così, generando una sequenza di consenso per ogni molecola di cDNA e distinguere errori casuali da errori che si verificano in tutte le ripetizioni, manufatti di costruzione di libreria possono essere separati in modo efficace da errori di trascrizione vera (Figura 1b).

Se usato correttamente, il dosaggio di C-seq può essere utilizzato per rilevare con precisione il tasso di base sostituzioni, inserimenti ed eliminazioni in RNA in tutto il trascrittoma di qualsiasi specie (ad esempio, Vedi Traverse e Ochman17). Ad esempio, abbiamo usato il test C-seq per fornire misurazioni di genoma del tasso di errore di trascrizione in Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans con una sola risoluzione base5 (osservazioni non pubblicate). Originariamente utilizzato per accuratamente sequenza RNA virus popolazioni, questa versione ottimizzata del dosaggio C-seq è stata semplificata per minimizzare condizioni difficili durante la preparazione di libreria che contribuiscono agli elementi di costruzione di libreria. Inoltre, utilizzando una serie di kit disponibili in commercio, la velocità effettiva del dosaggio è notevolmente migliorata, così come la facilità d'uso. Se usato correttamente, questo test è in grado di rilevare con precisione migliaia di errori di trascrizione per replica, migliorando così notevolmente il precedente studi6. Nel complesso, questo metodo fornisce un potente strumento per lo studio di mutagenesi trascrizionale e permetterà all'utente di acquisire nuove conoscenze sui meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione in una vasta gamma di organismi.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparazione

  1. RNasi sono onnipresenti; Pertanto, pulire accuratamente l'area di lavoro spruzzando giù con un reagente di decontaminazione (ad esempio, RNasi via) ed etanolo al 70%. Spruzzo giù qualsiasi pipette, penne o tubo rack per rimuovere potenziali fonti di contaminazione RNasi.
  2. Per impedire ulteriore RNAsi di contaminare i campioni, indossare un camice da laboratorio o t-shirt manica lunga durante la sperimentazione. Evitare il contatto tra i guanti e l'interno di qualsiasi tubi che verrà utilizzato, soprattutto quando il loro recupero da una scatola o busta.
  3. Prima la trascrizione d'inversione, cambiare spesso i guanti.
    Nota: Per risultati ottimali, non mettere in pausa l'esperimento prima della trascrizione d'inversione.

2. cella e cultura animale e collezione

  1. Raccolta e crescita di saccharomyces cerevisiae
    1. Se una libreria di C-seq è desiderata da lievito, innanzitutto inoculare una singola colonia di S. cerevisiae in 3 mL di medium contenente Estratto di lievito, adenina, peptone e destrosio (YAPD) e incubare per una notte a 30 ° C in un tamburo di rotolamento.
    2. Al mattino, a ri-inoculare la cultura in 50 mL di terreno YAPD a una densità ottica (OD) di 0,1 e crescere le cellule fino a raggiungere un OD di 0,5 – 0,7 (~ 7 x 106 cellule/mL).
    3. Raccogliere la cultura intera 50 mL (circa 350 x 106 cellule) in una provetta conica da 50 mL e girare le celle in basso per 3 min a 2.100 x g. Rimuovere il mezzo YAPD con cautela e lavare la pallina una volta con PBS 1X.
    4. Quindi, risospendere il pellet in 480 µ l di tampone di Lisi, 48 µ l di 10% SDS e 480 µ l di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1), pH 6,8. Vortexare il campione alla massima velocità per 5 s e il trasferimento di un tappo a vite 1,5 mL tubo con 750 µ l di microsfere di zirconio ghiacciata (in dotazione con il kit). Passare al punto 3 del presente protocollo per la lisi delle cellule e l'estrazione del RNA totale.
      Nota: Tutti i reagenti necessari per passo 2.1.4 sono forniti nel kit di estrazione di RNA lievito consigliato. Questi reagenti funzionano ugualmente bene per lieviti, vermi e Vola in modo che dopo la raccolta del lievito (punto 2.1), vermi (punto 2.2) o mosche (punto 2.3), un approccio unificato può essere utilizzato per generare librerie C-seq (fase 3 – 10).
  2. Cultura di Caenorhabditis elegans e collezione
    1. Se una libreria di C-seq è desiderata da worms, deposito di 30 vermi adulti su un piatto fresco di agar notata con OP50 batteri.
      Nota: Cinque piastre sono sufficienti per 1 replicare.
    2. I vermi della coltura per 4 giorni e raccogliere i vermi lavando delicatamente le piastre con 5 mL di M9 media e piscina i vermi in un tubo conico di singolo 50 mL.
    3. Girare i vermi giù a 100 x g per 2 minuti creare un pellet. Decelerare la centrifuga alla minima velocità possibile, in modo da non disturbare il pellet.
    4. Delicatamente spostare i vermi in una provetta da 1,5 mL, lavarli due volte in 1,5 mL di terreno di M9 e centrifugare la provetta a 100 x g per 1 min rimuovere batteri e generare un pellet pulito 100 µ l di vermi.
    5. Risospendere i vermi in 480 µ l di tampone di Lisi, 48 µ l di 10% SDS e 480 µ l di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico. Vortexare il campione alla massima velocità per 5 s e il trasferimento di un tappo a vite 1,5 mL tubo contenente 750 µ l di microsfere di zirconio ghiacciata. Passare al punto 3 del presente protocollo per la lisi di vermi e l'estrazione di RNA totale.
  3. Collezione e della coltura di drosophila melanogaster
    1. Se una libreria di C-seq è desiderata da mosche, mosche di 20 – 25 in flaconcini contenenti destrosio o un supporto basato su melassa della coltura. Aliquotare le mosche oltre 3 fiale, così che ogni flaconcino contiene circa 8 mosche.
    2. Per raccogliere le mosche, collocare il flaconcino in un secchio di ghiaccio fino a quando le mosche sono sedate. Poi, raccoglierli con un pennello in una provetta da 1,5 mL. Non raccogliamo le mosche dal trattamento di CO2 .
    3. Lasciate che le mosche calde a temperatura ambiente (TA) e di aggiungere rapidamente una miscela premade di 500 µ l di tampone di Lisi, 50 µ l di 10% SDS e 500 µ l di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico al tubo. Utilizzare un micropestle per macinare le mosche con circa 15 colpi, accompagnate da un forte movimento di torsione quando il pestello raggiunge il fondo del tubo.
    4. Versare il composto di mosche e supporto di lisi nel tappo a vite 1,5 mL tubo contenente 750 µ l di microsfere di zirconio ghiacciata e vortice e alla massima velocità per 5 s. procedere al punto 3 del presente protocollo per la lisi delle mosche e l'estrazione di RNA totale.

3. purificazione di RNA totale

Nota: A questo punto, tutti i tre protocolli convergono, e un approccio unificato può essere utilizzato per generare le librerie C-seq.

  1. Avvitare bene il tappo e fissare il tubo di un Vortex con un adattatore o un nastro adesivo. Vortice il tubo alla massima velocità per 10 min a lisare i campioni. Quindi, centrifugare il campione a 16.100 x g per 5 min separare i solventi organici dalla fase acquosa.
  2. Con attenzione rimuovere 400 – 500 µ l della fase acquosa senza disturbare l'interfase bianco, nuvoloso e aggiungerlo a un tubo conico da 15 mL contiene 1,9 mL di tampone di associazione. Li mescolare nel Vortex.
  3. Aggiungere 1,25 mL di etanolo al 100% e mescolare il campione nel Vortex. Trasferire 700 µ l del campione una cartuccia di filtro montata in un tubo di raccolta e spin il campione a 14.500 x g per 30 s. Ripetere fino a quando tutti del campione viene passato attraverso la cartuccia.
    Nota: A questo punto, il campione può girare leggermente opaco. Se troppe celle, vermi o mosche sono state lisate, precipitati potrebbero apparire che possono intasare il filtro.
  4. Lavare il filtro una volta con 700 µ l di soluzione di lavaggio 1 e due volte con 500 µ l di soluzione di lavaggio 2 o 3. Finire i lavaggi facendo girare i campioni a 14.500 x g per 2 minuti rimuovere qualsiasi etanolo in eccesso.
  5. Trasferire la cartuccia di filtro in una provetta di delfino di 1,5 mL e aggiungere 108 µ l di soluzione per eluizione preriscaldato (65 ° C).
    Nota: Non esporre mai i campioni di RNA a temperature superiori a 65 ° C prima di una trascrizione inversa, come fare così provocherà citosina agli eventi di deaminazione di uracile che sono impossibili da distinguere da errori di trascrizione.
  6. Degradare la contaminazione del DNA in RNA isolato (vedere passaggi 2.1 – 3.4) con l'aggiunta di 11 µ l di 10 x dnasi buffer, 2 µ l di inibitore di RNAsi e 4 µ l di dnasi I (8 U) e li Incubare a 37 ° C per 30 min.
  7. Dopo la digestione, aggiungere 11 µ l di reagente di inattivazione della dnasi. Vortice la miscela e lasciare riposare a temperatura ambiente per 5 min. Quindi, centrifugare il campione a 15.000 x g per 3 min a pellet il reagente di inattivazione e raccogliere 110 µ l del surnatante senza disturbare il pellet. Trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 mL.
    Nota: Il reagente di inattivazione della dnasi può essere abbastanza difficile da dispensare correttamente, così visivamente la punta della pipetta dopo ogni azione di pipettaggio. Se il reagente di inattivazione diventa troppo viscoso a dispensare, aggiungere 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) pari a 1/5 del volume residuo.
  8. (Controllo qualità) Misurare la concentrazione di RNA totale usando uno spettrofotometro. Quindi mettere da parte 1 µ l di RNA totale e diluirla a una concentrazione di 10 ng / µ l in acqua (NF) priva di nucleasi. Eseguire il RNA su uno strumento di analisi del nucleotide appropriato con un nastro di RNA ad alta sensibilità per garantire che il RNA non è degradato e ha un valore di eRIN di almeno 8.5 o superiore (Figura 2B).

4. mRNA arricchimento

  1. Eseguire l'arricchimento di mRNA con un miniprep mRNA kit (Vedi Tabella materiali). Aggiungere 140 µ l di acqua di NF al campione per un volume totale di 250 µ l. Quindi, aggiungere 250 µ l di buffer di associazione: 2x, mescolare accuratamente il campione nel vortex e 15 µ l di perle di oligo (dT).
  2. Mescolare il campione pipettando su e giù e incubare a 65 ° C per 2 min. Quindi, posizionare il campione a temperatura ambiente per 10 min. Infine, centrifugare il campione a 16.100 x g per 2 min a pellet i complessi di perlina: mRNA.
  3. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 500 µ l di soluzione di lavaggio. Trasferire la soluzione in una colonna di spin e girarla per 1 min a 15.000 x g. Scartare il flusso continuo e lavare il campione con un ulteriori 500 µ l di soluzione di lavaggio. Poi, girare il campione per 2 min a 15.000 x g per rimuovere qualsiasi etanolo in eccesso dai filtri spin.
  4. Trasferire il filtro spin in una provetta di delfino e risospendere il pellet in colonna con 80 µ l di soluzione per eluizione preriscaldato (65 ° C). Incubare il campione per 1,5 minuti a 65 ° C ed eluire esso di filatura per 1 min a 15.000 x g.
  5. Misurare la concentrazione di RNA purificato mediante un spettrofotometro o strumento simile che permette per la quantificazione della concentrazione di RNA e di qualità.

5. RNAsi III frammentazione e RNA ripulire

Nota: (Importante) per la preparazione di molecole di RNA circolare appropriati per la generazione di librerie C-seq, il RNA deve essere frammentato per circa 60 – 80 basi di lunghezza. Mentre i metodi precedenti hanno usato una frammentazione chimica al frammento di RNA, frammentazione chimica con metalli pesanti introduce danni per i campioni di RNA che possono essere erroneamente interpretati come errori di trascrizione durante l'analisi finale. Per aggirare questo problema, si basano invece su una frammentazione utilizzando RNAsi III per generare piccoli frammenti. Un ulteriore vantaggio di questo approccio enzimatico è che crea estremità compatibile necessaria per la legatura, prevenente l'esigenza di una fine-riparazione dopo la frammentazione chimica.

  1. Impostare la reazione di frammentazione di RNA con 1 µ g di RNA purificato, 10 µ l di tampone di reazione, 5 µ l di RNAsi III e abbastanza NF acqua per portare il volume fino a 100 µ l (Vedi Tabella materiali). Aggiungere l'enzima Ultima e dispensare la miscela su e giù almeno 10 volte per mescolare. Incubare il campione a 37 ° C per 25 min, che tende a produrre frammenti di RNA di circa 60-80 basi di lunghezza.
  2. Una volta completata l'incubazione di 25 min, ripulire la reazione immediatamente con un oligo clean-up e concentratore kit (Vedi Tabella materiali) per prevenire qualsiasi ulteriore digestione. Aggiungere 200 µ l di tampone di oligo-associazione per il campione, mescolare nel vortex e 800 µ l di etanolo al 100%. Mescolare il campione nel vortex e trasferirlo in una colonna di spin fornito in una provetta di raccolta.
  3. Centrifugare il campione a 10.000 x g per 30 s e lavare con 750 µ l di tampone di lavaggio per rimuovere RNAsi III. Centrifugare il campione a 10.000 x g per 30 s, scartare il flusso continuo e lavare il campione ancora una volta con 750 µ l di tampone di lavaggio come descritto sopra. Dopo il secondo passaggio è stato scartato, centrifugare la colonna a 15.000 x g per 2 minuti rimuovere qualsiasi etanolo in eccesso.
  4. Trasferire la colonna ad un tubo fresco 1,5 mL ed eluire il campione in 24 µ l di acqua NF di girare a 10.000 x g per 1 min.
  5. Controllo di qualità: Prendere 2 µ l dei frammenti di RNA purificati e diluirla 2 volte aggiungendo 2 µ l di acqua NF ad esso. Eseguire il RNA frammentato su un nastro di schermo per garantire che il RNA frammentato è nella gamma di 50 – 100 basi in lunghezza (Figura 2C).

6. RNA Circularization e cerchio di rotolamento trascrizione inversa

  1. Per circolarizzare i frammenti di RNA, calore-denaturare 20 µ l di campione a 65 ° C per 1 min e posizionarlo sul ghiaccio immediatamente per 2 min. Quindi, aggiungere 4 µ l di 10 x T4 RNA ligasi buffer, 4 µ l di 10 mM ATP, 1 µ l di inibitore di RNasi, 1 µ l di acqua di NF e 8 µ l di 50% glicole polietilenico (PEG).
  2. Mescolare accuratamente il campione nel Vortex, quindi aggiungere 2 µ l di 10 U / µ l di T4 RNA ligasi I. Mix il campione nuovamente pipettando esso e viene quindi incubato a 25 ° C per 2 h in un termociclatore con la temperatura del coperchio fissato a 30 ° C.
  3. Dopo 2 h, aggiungere 10 µ l di acqua di NF al campione e pulire il campione con un kit di pulizia e concentrazione di oligo secondo le specifiche del produttore. Eluire il campione in 20 µ l di acqua di NF.
  4. Per invertire trascrivere le molecole di RNA circolare, aggiungere 4 µ l di 10 mM dNTPs, 4 µ l di 50 ng / µ l random esameri e 9 µ l di acqua di NF a 9 µ l di RNA. Mescolare il tutto accuratamente pipettando, denaturare il campione a 65 ° C per 1 min e posizionarlo sul ghiaccio per 2 min Store il rimanente RNA come back-up.
  5. Aggiungere 8 µ l di tampone di sintesi del primo-filo x 5, 2 µ l di 0,1 mM DTT e 4 µ l di transcriptase d'inversione di 200 U / µ l e mescolare il tutto di pipettaggio. Incubare il campione a 25 ° C per 10 minuti, seguito da un'incubazione di 20 min a 42 ° C con il coperchio fissato a 5 ° C superiore alla temperatura di incubazione.
    Nota: Una trascrittasi inversa con le capacità del dislocamento di filo deve essere utilizzata in questa fase per consentire una rotolamento trascrizione inversa di cerchio.
  6. Aggiungere 10 µ l di acqua di NF al campione e ripulirlo con il kit di clean-up e concentrazione di oligo secondo le raccomandazioni del produttore. Eluire il campione in 42 µ l di soluzione per eluizione.
  7. Controllo di qualità: Diluire 2 µ l del singolo filamento cDNA in 2 µ l di acqua NF ed eseguire l'esempio su uno strumento di analisi del nucleotide con un nastro di RNA ad alta sensibilità. Se la trascrizione d'inversione ha funzionato correttamente, una libreria di cDNA molecole, che vanno da circa il 60 – 1.500 basi di lunghezza, deve essere visibile. Idealmente, la maggior parte cDNA è nella gamma di 500 – 1.000 basi (figura 2d).

7. seconda sintesi del cDNA del filo e fine riparazione

  1. Utilizzare un secondo kit di sintesi strand per generare una libreria di cDNA double-stranded. I campioni su ghiaccio e aggiungere 30 µ l di acqua di NF a 38 µ l di campione. Aggiungere 8 µ l di 10 x secondo Strand Buffer e 4 µ l di secondo Strand enzima, quindi mescolare il campione pipettando delicato prima sua incubazione a 16 ° C per 2,5 h.
  2. Ripulire i campioni con l'oligo clean-up e concentrazione kit secondo le raccomandazioni del produttore per le reazioni di 100 µ l ed eluire i campioni in 38 µ l di acqua di NF.
  3. Impostare la reazione di fine-riparazione aggiungendo 20 µ l di acqua NF a 35,5 µ l di cDNA double-stranded, 6,5 µ l di tampone di reazione di riparazione di fine e 3 µ l di fine Prep enzima Mix. Attentamente controllare il buffer di reazione per precipitati bianchi e dissolverli di scaldamani se presente.
  4. Miscelare la reazione di fine-riparazione pipettando e incubare a 20 ° C per 30 min, seguita da una seconda incubazione di 30 minuti a 65 ° C. Impostare la temperatura del coperchio termociclatore a 5 ° C superiore alla temperatura di incubazione.

8. adattatore legatura e la selezione della dimensione delle librerie preparate

  1. Utilizzare un modulo di preparazione libreria multi-step per le preparazioni di biblioteca finale (Vedi Tabella materiali). In primo luogo, diluire gli adattatori per generazione sequenziamento 10 volte in 10 mM Tris-HCl a una concentrazione finale di 1,5 µM. Aggiungere 2,5 µ l di adattatore diluito e 1 µ l di potenziatore della legatura per ogni campione, quindi mescolare nel Vortex.
  2. Aggiungere 15 µ l di Blunt/TA ligasi Master Mix, mescolare pipettando e incubare a 20 ° C per 15 min. Aggiungere 3 µ l di enzima reagente l'asportazione uracile-specifici, quindi incubare a 37 ° C per 15 min. Dopo la legatura è completa, aggiungere 13,5 µ l di acqua di NF al campione per un volume totale di 100 µ l e procedere alla selezione dimensione.
    Nota: Si consiglia di dimensione-selezionare per molecole di cDNA che sono nella gamma di 600 – 800 basi di lunghezza. Se le molecole di RNA frammentate erano circa 60 – 80 basi di lunghezza, selezionando per molecole che sono 600 – 800 basi di lunghezza garantirà che la maggior parte delle molecole selezionate contengono almeno tre ripetizioni in tandem, che è ideale per la lavorazione a valle e analisi.
  3. Per selezionare per le molecole che sono 600 – 800 bp in lunghezza, aggiungere 30 µ l di sedimento biglie magnetiche (Vedi Tabella materiali), acclimatati alla RT, per ogni campione e Miscelare pipettando. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 mL e incubare a + RT 5 min.
  4. Il campione viene posto su un supporto magnetico per 5 min separare le perle dal surnatante. Trasferire il surnatante (che contiene le molecole di cDNA desiderato) per un nuovo 1,5 mL tubo e smaltire i branelli magnetici (che vengono associati alle molecole di cDNA grande).
  5. Aggiungere una nuova aliquota di 15 µ l di biglie magnetiche a ciascuno i campioni, mescolare accuratamente pipettando e incubare per 5 min a RT. posto i campioni su un rack magnetico e li Incubare per 5 minuti a TA. Quindi, rimuovere delicatamente e smaltire i surnatanti, facendo attenzione a non disturbare le perline.
    Nota: Non smaltire i branelli magnetici, che ora contengono il cDNA di destinazione desiderata.
  6. Aggiungere 200 µ l di 80% preparata etanolo a ciascuno dei campioni senza disturbare i branelli magnetici pellettati e incubare per 30 s. scartare l'etanolo e lavare i campioni ancora una volta con 80% di etanolo. Quindi, completamente rimuovere ogni traccia di etanolo dai campioni e asciugare le perline per 5 min ma fare attenzione a non asciugare troppo i branelli. Se le perle sono overdried, crepe apparirà in pellet.
  7. Per eluire i campioni dalle perline, rimuovere i tubi dal supporto magnetico e 19 µ l di 10 mM Tris-HCl. Dispensare su e giù più volte a risospese le perline e incubare i campioni per 5 min a TA. Se le perle erano overdried, incubare per > 10 min.
  8. Collocare i campioni nel supporto magnetico e incubare per 5 min separare le perle dal surnatante. 15 µ l del supernatante contenente le librerie di cDNA purificata, dimensione selezionata dai tubi di rimuovere delicatamente e trasferirlo in una provetta di fresco da 1,5 mL.

9. PCR amplificazione e purificazione finale perlina

  1. Aggiungere 5 µ l di primer universale e 5 µ l di primer indice univoco (Vedi tabella materiali) a ciascuno purificato libreria del cDNA e mescolarli accuratamente pipettando. Attentamente controllare il mix master della polimerasi per cristalli e altri precipitati e caldo il mix master a mano fino a sciogliere i precipitati.
    1. Aggiungere 25 µ l di mix master della polimerasi al campione, mescolare pipettando e seguire le condizioni in bicicletta sotto per l'amplificazione di PCR. Eseguire la denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 s e quindi eseguire un doppio passo reazione di PCR di denaturante i campioni a 98 ° C per 10 s e ricottura/estensione dei prodotti di PCR a 65 ° C per 75 s (12x), seguito da un'estensione finale a 65 ° C per 5 min e un'indefinita a 4 ° C.
  2. Pulire le librerie finale aggiungendo 45 µ l di sedimento biglie magnetiche direttamente per la reazione di PCR, mescolarli pipettando e li presso RT per 5 min, trasferimento Incubare il campione in una provetta da 1,5 mL e posizionarlo in un supporto magnetico. Incubare per 5 min, scartare il surnatante e lavare due volte con preparati 80% etanolo per 30 s.
  3. Dopo il secondo lavaggio, completamente rimuovere l'etanolo dall'esempio e asciugare all'aria il pellet perlina per 5 min ed eluire esso in 35 µ l di 0.1 x TE. Risospendere le perline pipettando li e li Incubare a RT per 5 min, posto il campione sul supporto magnetico e dopo 5 min, trasferire 30 µ l del surnatante in una provetta di fresco 1,5 mL. Memorizzare le librerie a-80 ° C.
  4. Controllo di qualità: Diluire 1 µ l della biblioteca finale a 9 µ l di acqua NF ed eseguire l'esempio su uno strumento di analisi del DNA dedicato con un chip di alto-sensibilità; la maggior parte dei cDNA dovrebbe essere nella gamma di 600 – 800 bp in lunghezza (Figura 2e).
  5. Dopo l'eluizione, spedire i campioni per il sequenziamento su una piattaforma di sequenziamento massivamente parallelo utilizzando 250 bp accoppiato-fine letture, o 300 bp single-end.

10. bioinformatica analisi del cerchio dati di sequenziamento

Nota: Analizzare ed interpretare i dati grezzi del dosaggio C-seq richiede una pipeline di bio-informatico dedicata. Un disegno schematico della pipeline che è stato utilizzato per le nostre analisi è raffigurato in Figura 3. Scarica questa pipeline a https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. In primo luogo, tagliare le letture per Rimuovi scheda sequenze e bassa qualità chiamate base con cutadapt18, utilizzando una soglia di Punteggio di qualità di 20.
  2. Quindi, identificare le ripetizioni codificate dalla molecola di RNA concatemerized usando un algoritmo appropriato per rilevare eventuali ripetizioni con una dimensione minima di 30 nucleotidi e un massimo di 2 mancate corrispondenze tra ripetizioni18. Derivare una sequenza consenso da queste ripetizioni e tenere traccia di tutte le chiamate di base e i punteggi di qualità associata ad ogni posizione.
    Nota: Perché la trascrizione d'inversione può iniziare in qualsiasi posizione sulla molecola di RNA circolare, l'inizio di una ripetizione non corrisponde necessariamente all'estremità 5 ' della molecola del RNA frammentata (in appresso denominato "il punto di legatura"). Di conseguenza, la sequenza di consenso non mapping continuamente contro il trascrittoma corrispondente, che richiede l'identificazione del punto di legatura.
  3. Per identificare il punto di legatura, mappare un concatemer della sequenza consenso contro il trascrittoma di riferimento utilizzando l'allineamento di scoppio-come strumento (BLAT)19.
    1. Concatenare due istanze della sequenza consenso per garantire che la sequenza mappata contenga almeno un'occorrenza ininterrotta completa della iniziale sequenza di frammento di RNA. Ruotare quindi la sequenza di consenso per avviare dalla posizione di punto di legatura predetto.
  4. Mappa le sequenze consenso ruotato contro il genoma utilizzando TopHat20 e utilizzare gli allineamenti per rilevare eventuali polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) che potrebbero essere scambiate per errori di trascrizione.
  5. Chiamare gli errori di trascrizione delle sequenze consenso ruotato mappata e verificare se gli errori del candidato superano quattro prove ulteriori.
    1. Innanzitutto, assicurarsi che un errore di trascrizione non coincide con un SNP (un requisito tipico è che almeno 20 letture devono coprire una particolare base e non più di 5% della legge può sostenere un'alternativa chiamata base).
    2. In secondo luogo, verificare che la sequenza di consenso è derivata da almeno 3 ripetizioni in tandem, ognuno dei quali chiama la stessa coppia di base; e in terzo luogo, assicurarsi che la somma dei punteggi di qualità di tale posizione deve essere oltre 100.
  6. Per un quarto e finale verifica, ruotare la sequenza di consenso in tutte le possibili combinazioni (simulando tutte le possibili posizioni del punto di legatura) e mappa ogni versione contro il genoma di riferimento utilizzando TopHat.
    Nota: Se una delle sequenze ruotate trova una perfetta corrispondenza nel genoma, il corrispondente punto di legatura è ora considerato quella corretta e la chiamata di errore di trascrizione dovrebbe essere respinta.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come tutti gli approcci di sequenziamento massivamente parallelo, ogni esperimento di C-seq produce un ingombrante, grandi set di dati. Per gli utenti di prima volta, può essere difficile gestire questi set di dati; Pertanto, si raccomanda che tutti gli utenti di contattare un esperto bio-pianista prima la sperimentazione. In media, l'aspettativa è che gli utenti genererà circa 55 – 70 Giga basi (Gbases) per eseguire su più piattaforme di sequenziamento massivamente parallelo. Per questo ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la preparazione delle librerie C-seq per il rilevamento di errori di trascrizione in Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Questo protocollo ha numerosi vantaggi rispetto ai protocolli esistenti, come pure le tecniche alternative.

Negli ultimi 15 anni, sono stati sviluppati numerosi sistemi reporter che si basano su luciferase7,8...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa pubblicazione è stata resa possibile dai finanziamenti da parte di grant T32ES019851 (a C. Fritsch), R01AG054641 e un ricercatore giovane AFAR concedere (Vermulst M.).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di purificazione dell'RNA RiboPureThermoFisherAM1926Purificazione dell'RNA totale
Kit di purificazione dell'mRNAGenelute Sigma-AldrichMRN70-1KTPurificazione dell'mRNA
Acqua senza nucleasiAmbionAM9937Eluizione e diluizione
Ambion RNasi IIIThermoFisherAM2290Frammentazione dell'RNA
T4 RNA Ligasi 1 (ssRNA Ligasi)New England BiolabsM0204SCircolarizzazione dell'RNA
RibolockThermoFisherEO0381Inibitore dell'RNasi
SuperScript III Trascrittasi inversaThermoFisher18080044Trascrizione inversa del cerchio rotante
10 mM Miscela dNTPThermoFisher18427013Trascrizione inversa del cerchio rotante
Esameri casuali (50 ng/µ L)ThermoFisherN8080127Trascrizione inversa a cerchio rotante
NEB Modulo di sintesi del secondo filamentoNew England BiolabsE6111SSintesi del secondo filamento
NEBNext Kit di preparazione della libreria di DNA Ultra per IlluminaNew England BiolabsE7370SPreparazione della libreria di cDNA
NEB Next primer dell'indiceNEBE7335SMultiplex
PCROligo pulito & ConcentratoreZymo ResearchD4061Pulizia di campioni di RNA e DNA
DynaMag-2 MagneteThermoFisher12321DPurificazione di biglie
magnetiche Perle AMPure XPBeckman CoulterA63881Purificazione di microsfere magnetiche
Eppendorf 5424 MicrocentrifugaFisherScientific05-403-93
Agitatore INCU 10 LBenchmark ScientificH1010
Termociclatore T100 BIORAD1861096Condizioni di ciclo a temperatura medio-alta
Termociclatore PTC-200GMI8252-30-0001 Condizioni di ciclo a bassa temperatura
RNase AwayMolecular Bioproducts700S-11Sterilizzazione
Provetta da centrifuga da 50 mLCorning430290
Provetta da centrifuga da 15 mLCorning430052senza nucleasi
USA Scientific1615-5500senza nucleasi
AgilentG2991AAStrumento di analisi nucleotidica per il controllo di qualità di campioni di RNA e DNA a singolo filamento
Nastro per screening RNA ad alta sensibilitàAgilent5067-5579Controllo di qualità di campioni di RNA e DNA a singolo filamento
RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5577Controllo di qualità di campioni di RNA e DNA a singolo filamento
RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5578Controllo di qualità di campioni di RNA e DNA a singolo filamento
2100 Strumento bioanalizzatoreAgilentG2939BAControllo di qualità del DNA a doppio filamento
Kit DNA ad alta sensibilitàAgilent5067-4626Controllo di qualità per campioni di cDNA a doppio filamento
Bagno d'acquaVWR462-0244Incubazione
NanoDrop 2000/2000C SpettrofotometroThermoFisherND-2000CDeterminazione della concentrazione di RNA
senza nucleasi Provette Eppendorf Sistema di tapestation 4200

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484(2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065(2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36(2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Saggio di sequenziamento a cerchioFedelt della RNA polimerasiSaccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis elegansCircolarizzazione di frammenti di RNAT4 RNA ligasiTrascrizione inversaSintesi del secondo filamentoLigazione degli adattatoriSelezione della dimensione tramite microsfere magneticheAmplificazione PCRPurificazione della libreria

Articoli correlati