Valutare il ruolo della funzione mitocondriale in affaticamento legato al cancro

Summary

Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo pratico per valutare la disfunzione mitocondriale è associata con affaticamento nei pazienti oncologici. Questo innovativo protocollo è ottimizzato per uso clinico che coinvolge phlebotomy solo standard e procedure di laboratorio di base.

Abstract

L'affaticamento è un comune e debilitante che colpisce la maggior parte dei malati di cancro. Fin qui, resti di affaticamento scarsamente caratterizzati con nessuna diagnostica di test per misurare obiettivamente la gravità di questa condizione. Qui descriviamo un metodo ottimizzato per la valutazione della funzione mitocondriale di PBMCs raccolti dai malati di cancro affaticato. Usando un sistema compatto flux extracellulare e iniezione sequenziale di inibitori respiratori, abbiamo esaminato lo stato funzionale mitocondriale di PBMC misurando la respirazione mitocondriale basale, ricambio capacità respiratoria ed il fenotipo di energia, che descrive la via di energia preferita di rispondere allo stress. PBMCs fresco sono prontamente disponibili in ambito clinico utilizzando standard flebotomia. L'intera analisi descritto nel presente protocollo può essere completato in meno di 4 ore senza il coinvolgimento di tecniche biochimiche complesse. Inoltre, descriviamo un metodo di normalizzazione che è necessario per ottenere dati riproducibili. La semplice procedura e normalizzazione metodi presentati consentono per raccolta di campioni ripetuti dallo stesso paziente e generazione di dati riproducibili che possono essere confrontati tra intervalli di tempo per valutare i potenziali effetti del trattamento.

Introduction

La fatica è una condizione prevalente e angosciante che ha un impatto negativo sulla qualità della vita dei pazienti di cancro¹. A questa data, la fatica di cancro rimane definita male e si basa solo su segnalazione soggettiva da pazienti². Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di identificare un test di laboratorio diagnostico facilmente adattabile per caratterizzare obiettivamente fatica in ambiente clinico^3,4.

I meccanismi sottostanti multipli, compreso disfunzione di mitocondri, sono state proposte per causare affaticamento⁵. I mitocondri sono gli organelli di centrale elettrica, fornendo il 95% del fabbisogno energetico cellulare tramite fosforilazione ossidativa e svolgono un ruolo importante nella segnalazione del calcio, apoptosi, segnalazione immuni e regolamento di altri di eventi di segnalazione intracellulare⁶ . Di conseguenza, bioenergetica mitocondriale alterata e difetti nella produzione di energia possono contribuire alla fatica. Supporto di questa ipotesi, gli studi precedenti hanno osservato le mutazioni nel DNA mitocondriale in pazienti con la sindrome di stanchezza cronica⁷. Mentre rimane poco chiaro se l'origine patofisiologica della fatica si trova all'interno del sistema nervoso centrale o i tessuti periferici, come i muscoli scheletrici^8,9, attualmente non esiste un metodo diretto per valutare con precisione disfunzione mitocondriale legata alla stanchezza in live, contenenti cellule.

Usando cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) per studiare la funzione mitocondriale offre diversi vantaggi. In primo luogo, PBMC sono prontamente disponibili in ambito clinico utilizzando flebotomia standard e possono essere isolati rapidamente utilizzando tecniche di laboratorio di base. In secondo luogo, la raccolta del sangue è meno dilagante che raccogliendo altri tessuti quali una biopsia del muscolo. Così, i campioni di sangue possono essere raccolti dallo stesso paziente ripetutamente nel corso del tempo, che facilita la valutazione longitudinale degli effetti del trattamento. Interessante, la funzione mitocondriale in PBMCs ha sembrato essere ben correlato con Rene stato mitocondriale in un modello animale¹⁰. Inoltre, i mitocondri delle cellule immuni sono stati utilizzati come proxy per la rilevazione di cambiamenti sistemici sotto condizioni differenti di malattia^11,12. I mitocondri in cellule immuni circolanti sono particolarmente sensibile ai cambiamenti nelle funzioni immuni e immuni segnalando le molecole quali le citochine^13,14,15. Ad esempio, si è osservato che PBMCs da pazienti con malattie infiammatorie reumatiche acute presentano basale elevato consumo dell'ossigeno,¹⁴. Al contrario, il consumo di ossigeno è stato ridotto in PBMC isolati dai pazienti con le circostanze infiammatorie sistemiche comprese sepsi¹⁶. Nelle circostanze infiammatorie, radicali liberi prodotti dai mitocondri disfunzionali possono contribuire ulteriormente ad elevati stress ossidativo e infiammazione prolungata¹⁷. Il ruolo centrale dei mitocondri nella produzione di energia anche come stress ossidativo suggerisce l'utilità potenziale di usando la funzione mitocondriale come un proxy per lo studio della fatica in cancro pazienti ¹³.

Precedenti studi hanno esaminato la funzione mitocondriale utilizzate tecniche biochimiche, misura del potenziale di membrana mitocondriale o l'isolamento di popolazioni di cellule specifiche che non possono essere facilmente adattabile nella regolazione clinica^{5, 14,18}. Negli ultimi anni, lo sviluppo di analisi di flusso extracellulare ha permesso ai ricercatori di facilmente e accuratamente esaminare i cambiamenti nel tasso di consumo di ossigeno (OCR) in risposta alle iniezioni automatizzate di inibitori respiratori^{19,20 , 21 , 22}. Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono progettata per tipi cellulari specifici e il grande formato di alto-rendimento potrebbe non essere applicabile in una regolazione clinica. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo ottimizzato per esaminare la funzione mitocondriale per uso clinico.

Protocol

Lo studio corrente (NCT00852111) è stato approvato da Institutional Review Board (IRB) di istituti nazionali di salute (NIH), Bethesda, Maryland. I partecipanti arruolati in questo studio erano uomini euthymic, 18 anni di età o più anziani, che sono state diagnosticate con cancro alla prostata non-metastatico con o senza prostatectomia priore e sono stati programmati per ricevere la radioterapia esterna del fascio (EBRT). Potenziali partecipanti sono stati esclusi se avevano una malattia progressiva che potrebbe causare notevole affaticamento, hanno avuti malattia psichiatrica negli ultimi cinque anni, ha avuto non riveduta ipotiroidismo o anemia, o ha avuto una seconda malignità. Gli individui che sedativi, steroidi o agenti anti-infiammatori non steroidei utilizzati anche sono stati esclusi. I campioni di sangue di controllo in buona salute sono stati ottenuti presso la medicina NIH dipartimento di trasfusione da donatori sani sotto un protocollo approvato IRB (NCT00001846). Tutti i partecipanti sono reclutati al Magnuson Clinical Research Center al NIH. Prima della partecipazione allo studio sono stati ottenuti consensi scritti firmati.

1. mitocondriale funzione misurazione preparazione (giorno 1 dell'esperimento)

1. Idratare la cartuccia sensore (Vedi Tabella materiali; durata approssimativa: 5 min).
   1. Rimuovere la cartuccia sensore dal pacchetto. Aggiungere 200 μL di soluzione di calibratore in ciascun pozzetto della piastra utilità, quindi riempire ogni fossato con 400 μL di soluzione di calibratore.
   2. Piatto di sensore ritorno alla piastra di utilità, che ora ha calibratore soluzione in esso. Idratare la cartuccia in un incubatore a 37 ° C non-CO₂ durante la notte.
      Nota: Cartuccia sensore deve essere idratata per un minimo di 4 ore e un massimo di 72 ore.

2. preparazione del campione clinica (giorno 2 dell'esperimento)

1. Affaticamento di misura utilizzando il 13-elemento funzionale valutazione di malattia la terapia cronica - affaticamento (FACIT-F)^2,23,24 al basale (prima di iniziare la radioterapia esterna), punto medio e completamento della radioterapia esterna e 1 anno post-radioterapia esterna.
   1. Utilizzare un 0 - 4 scala per ogni elemento risposta, dove 0 rappresenta "non è affatto" e un 4 indica che il convenuto si riferisce all'istruzione del corrispondente "molto." Punteggi totali dovrebbero variare da 16-53, con punteggi più bassi che riflette intensità alte di affaticamento.
   2. Definire fatica come un punteggio FACIT-F inferiore a 43, con un punteggio di FACIT-F di ≥43 che indica assenza di o non clinicamente significativo affaticamento².
      Nota: Un punteggio FACIT-F di 43 migliori divide fatica decine di malati di cancro e la popolazione generale².
   3. Includono i seguenti 13 elementi della scala di affaticamento FACIT: 1) mi sento affaticato; 2) mi sento debole tutto; 3) mi sento svogliata ("lavato fuori"); 4) mi sento stanco; 5) ho problemi con l'avvio di cose perché sono stanco; 6) ho difficoltà a finire le cose perché sono stanco; 7) ho energia; 8) sono in grado di fare le mie solite attività; 9) ho bisogno di dormire durante il giorno; 10) sono troppo stanco per mangiare; 11) ho bisogno di aiuto facendo la mia solita attività; 12) sono frustrato di essere troppo stanchi per fare le cose che voglio fare; e 13) devo limitare la mia attività sociali perché sono stanco.
2. Isolare i PBMC dai campioni di sangue appena prelevato (durata approssimativa: 1 h).
   1. Raccogliere 8 mL di sangue in una provetta di preparazione di cellule mononucleari (Vedi Tabella materiali).
      Nota: I campioni di sangue devono essere elaborati entro 2 h dalla raccolta. La qualità di PBMCs può essere compromessa se i campioni di sangue vengono elaborati più di 2 ore dal prelievo.
   2. Centrifugare a 1.750 x g per 30 min a temperatura ambiente (18-25 ° C). Trasferire lo strato nuvoloso per un tubo conico da 15 mL. Aggiungere fino a 15 mL di PBS e capovolgere 5 volte.
   3. Centrifugare a 300 x g per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere con cautela e scartare il supernatante senza pellet inquietante. Risospendere il pellet con l'aggiunta di fino a 10 mL di PBS e capovolgere 5 volte.
   4. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il liquido surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS. Trasferire i PBMCs in una provetta di microfuge 1,5 mL.
   5. Centrifugare a 610 x g per 10 minuti. Con attenzione rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in completo RPMI-1640 (RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10mm penicillina/streptomicina).
3. Cappotto cella piastre per cellule non aderenti (durata approssimativa: 30 min).
   1. Preparare la soluzione di adesivo di cellule e tessuti (Vedi Tabella materiali) diluendo la soluzione di riserva in bicarbonato di sodio 0,1 M a pH 8.0. La soluzione di lavoro dovrebbe essere a 3,5 µ g/cm² di superficie.
      Nota: Questa soluzione contiene polifenolici proteine estratte dal mitilo marino, Mytilus edulis. Queste proteine sono componenti chiave della colla secernuta dalla cozza per ancorarsi alle superfici. Troviamo che la cella-Tak funziona meglio con PBMCs.
   2. Aggiungere 100 μL della soluzione adesiva diluita in ciascun pozzetto e incubare per almeno 20 min a temperatura ambiente. Lavare tre volte con acqua deionizzata e aria secca.

3. mitocondriale funzione misurazione

1. Preparazione di analisi Media (durata approssimativa: 10 min).
   Nota: La media di analisi dovrà essere preparate il giorno dell'esperimento.
   1. Aggiungere L-glutamina, piruvato e glucosio alla base media (i costituenti stessi come per volta Eagle di Dulbecco Medium (DMEM), ma senza bicarbonato di sodio, glucosio, glutamina o sodio piruvato) per realizzare un supporto di analisi. Riscaldare la media di 37 ° C, quindi regolare il pH a 7,4.
      Nota: Le concentrazioni di L-Glutammina, piruvato ed il glucosio sono solitamente le stesse concentrazioni nei media di crescita normale, ma possono essere regolate in base il dosaggio.
2. PBMCs di preparare per il test di Stress di Mito (durata approssimativa: 2 h).
   1. In ogni pozzetto per raggiungere confluency di 80-90% del piatto abbastanza PBMCs dal passaggio 2. Nella nostra esperienza, 1.5 x 10⁵ cellule/pozzetto ha prodotto i risultati più coerenti.
      Nota: Wells A e H sono pozzi di sfondo e deve contenere solo analisi media con nessuna cellula. In pozzi da B a G, si consiglia di almeno 3-6 pozzetti per paziente campione di placcatura per tenere conto di valori anomali.
   2. Rallentare piastre a 200 x g per 2 minuti per permettere che le cellule di aderire al fondo dei pozzetti. Lavare le cellule una volta con media di dosaggio. Questo passaggio rimuove il bicarbonato di sodio e del siero dal supporto di crescita.
      Nota: Nella nostra esperienza, la fase di lavaggio rimuove in genere 20-30% delle cellule.
   3. Aggiungi media di dosaggio 180 μL in ogni pozzetto, tra cui sfondo pozzi A e H. Incubare in un incubatore a 37 ° C non-CO₂ per 45-60 min.
3. Esecuzione del Test di Stress di Mito
   1. Ricostituire i farmaci nel Mito Stress Kit con media di test come segue:
      1. Oligomycin: Aggiungi 252 μL analisi media nel flaconcino per generare una soluzione di riserva a 50 μM.
      2. FCCP: Aggiungere 288 μL di media di dosaggio nel flaconcino per generare una soluzione di riserva a 50 μM.
      3. Antimycin A / Rotenone: aggiungere 216 μL di media di dosaggio nel flaconcino per generare una soluzione di riserva a 25 μM.
   2. Vortice ricostituito farmaci per circa 1 minuto. Diluire in soluzioni di lavoro.
      Nota: Le concentrazioni delle soluzioni di lavoro dovrebbero essere titolate e pre-determinate prima dell'esperimento a seconda del tipo di cella. Per PBMCs, troviamo quel 1 μM di Oligomycin, 1 μM FCCP e 0,5 μM antimycin A / Rotenone funzionare al meglio.
   3. Dispensare i farmaci in ogni porta nella cartuccia sensore in sequenza:
      1. R: Porta pipetta 20 μL 10 μm Oligomycin, per una concentrazione finale in ciascun pozzetto di 1 μM.
      2. Porta b: pipetta 22 μL 10 μm FCCP, per una concentrazione finale in ciascun pozzetto di 1 μM.
      3. C: Porta pipetta 25 μL di 5 μM antimycin A / rotenone per una concentrazione finale in ciascun pozzetto di 0,5 μM.
4. Selezionare "Test di Stress di Mito" su uno strumento di cambiamento continuo extracellulare. Seguire il prompt dei comandi dello strumento e inserire la cartuccia sensore. Lo strumento eseguirà automaticamente la calibrazione del sensore. Inserire la piastra di cella dopo calibrazione del sensore e lo strumento si concluderà il resto del saggio. Dinamica dell'ossigeno è misurata a 530 nm (eccitazione) / 650nm (emissione), e concentrazione di protoni viene misurata a 470 nm (eccitazione) / 530 nm (emissione).

4. normalizzazione dei dati la funzione mitocondriale

1. Preparare la soluzione di saggio di proliferazione cellulare (durata approssimativa: 5 min).
   1. Aggiungere 48 μL acido nucleico macchia (500 x) e soppressore di sfondo 240 µ l a 11,7 mL di PBS (2x). La macchia di acido nucleico è un colorante di legame al DNA cellulare-permeante e il soppressore di sfondo è un colorante di mascheramento che blocca le cellule morte o cellule con l'integrità della membrana cellulare compromessa da essere macchiato. La combinazione del colorante DNA-legantesi e il soppressore di sfondo assicura che solo dal vivo cellule sono macchiate.
   2. Una volta completata la prova di sforzo di Mito, aggiungere uguale volume di soluzione di lavoro (180 μL): 2x direttamente nel mezzo in ciascun pozzetto.
2. Incubare le cellule in presenza di soluzione di saggio di proliferazione delle cellule in un incubatore a 37 ° C per 45-60 min. quantificare il numero di cellule vive (fluorescenti) su un lettore alla 508 nm (eccitazione) / 527 nm (emissione) e normalizzare i dati OCR (durata approssimativa: 10 min) .
   Nota: oltre a numero cellule vive, gli utenti possono anche scegliere normalizzare i dati con il numero totale delle cellule, la quantità di acido nucleico, concentrazioni di proteine, ecc.

Results

Il Test di Stress di Mito si basa sul tasso di consumo di ossigeno (OCR) di misura dopo iniezione sequenziale di vari inibitori respiratori per mappare un profilo mitocondriale completo. Misurazioni di OCR dopo ogni iniezione di droga può essere utilizzato per calcolare i seguenti parametri relativi alla salute mitocondriale: OCR basale prima viene misurata prima di ogni iniezione di droga per valutare il consumo di ossigeno necessario per soddisfare la domanda di livello...

Discussion

Affaticamento in malati di cancro è una condizione debilitante che non è ben definito o caratterizzato¹. Diagnosi di affaticamento si basa interamente su una relazione soggettiva e non c'è nessuna corrente standard diagnostico o trattamento per questa circostanza, in gran parte a causa di una mancanza di comprensione nella sua pathobiology². Dei meccanismi proposti affaticamento nei pazienti oncologici, danno nella funzione mitocondriale è una delle vie più terapeuticamente...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta per la preparazione delle cellule mononucleate CPT	BD Biosciences	362761	Per isolare le PBMC dopo flebotomia
RPMI-1640	Corning	10-040	Per la produzione di terreni di crescita per PBMC
Siero fetale bovino (FBS)	Corning	35-010-CV	Per la produzione di terreni di crescita per PBMC
Penicillina/streptomicina	ThermoFisher	15140122	Per la produzione di terreni di crescita per PBMC
Cell-Tak	Corning	354240	Soluzione adesiva per cellule e tessuti; consente alle cellule in sospensione di aderire alla superficie
Seahorse XF Calibrant Solution	Agilent	103059-000	Per cartucce idratanti
XFp Fluxpak (minipiastre e cartucce per sensori)	Agilent	103022-100	Contiene minipiastre per colture cellulari XFp e cartucce per sensori
Terreni di base XF	Agilent	103335-100	Per la produzione di terreni di analisi XF
45% coltura cellulare Soluzione D-(+)-glucosio	Corning	25-037-CI	Per la produzione di XF terreni di analisi
Soluzione di piruvato di sodio	Corning	25-000-CI	Per la produzione di terreni di prova XF
L-glutammina	ThermoFisher	25030081	Per la produzione di terreni di prova XF
Kit per test da sforzo Mito Seahorse XFp	Agilent	103010-100	Contiene oligomicina, FCCP, antimicina A/rotenone
CyQUANT Saggio di proliferazione cellulare diretta	ThermoFisher	C35011	Per la quantificazione di cellule vive e la normalizzazione
dei datiSeahorse XFp Analyzer	Agilent	S7802AEA	Per misurare la funzione mitocondriale in cellule vive
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (o qualsiasi strumento in grado di quantificare le cellule fluorescenti in una piastra)	BioTek	BTCYT5PV	Per la quantificazione di cellule vive e la normalizzazione dei dati