Topi esposti a LPS intraperitoneali secernono esosomi nel fluido di lavaggio (BAL) bronco-alveolare che sono confezionati con Mirna. Utilizzando un sistema di co-coltura, indichiamo che esosomi rilasciati nel liquido di BAL perturbare l'espressione delle proteine di giunzione stretta in cellule epiteliali bronchiali ed aumentano l'espressione delle citochine pro-infiammatorie che accentuano la ferita di polmone.
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Articolo metodologico
Il lavaggio broncoalveolare esosomi in lesioni polmonari settici Lipopolysaccharide indotta
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lesioni polmonari acute (ALI) e sindrome da distress respiratorio (ARDS) rappresentano un gruppo eterogeneo di malattie polmonari che continua ad avere un'alta morbosità e mortalità. Patogenesi molecolare delle ALI è essere meglio definiti; Tuttavia, a causa della natura complessa della malattia terapie molecolari devono ancora essere sviluppato. Qui usiamo un modello di topo indotta lipopolysaccharide (LPS) di danno polmonare acuto settica di delineare il ruolo degli esosomi nella risposta infiammatoria. Utilizzando questo modello, siamo stati in grado di dimostrare che i topi che sono esposti a LPS intraperitoneali secernono esosomi nel fluido di lavaggio (BAL) di bronco-alveolare dai polmoni che sono confezionati con miRNA e citochine che regolano la risposta infiammatoria. Ulteriormente utilizzando un sistema di modello di co-coltura, mostriamo che gli esosomi rilasciati dai macrofagi interrompono espressione delle proteine di giunzione stretta in cellule epiteliali bronchiali. Questi risultati indicano che 1) cross-talk tra cellule innate immune e strutturali attraverso la marcia exosomal contribuiscono alla risposta infiammatoria e rottura della barriera strutturale e 2) targeting questi miRNA può fornire una nuova piattaforma per trattare ALI e ARDS.
Introduzione
ALI e ARDS sono le forme pericolose di insufficienza respiratoria con ipossiemia severa causata da edema polmonare non cardiogeno che colpisce circa 1 milione di persone nel mondo ogni anno1. L'eziologia di ARDS include ferita diretta ai polmoni da infezioni o aspirazione e una varietà di insulti indiretti. Nell'ultimo decennio c'è stata una maggiore comprensione della patogenesi molecolare di ARDS, tuttavia, trattamenti specifici mirati per ARDS sono ancora essere sviluppato2,3.
Sono stati sviluppati diversi modelli animali di danno polmonare acuto che forniscono un ponte per la traduzione di terapie sperimentali per studi umani4,5. I modelli comunemente usati includono installazione locale di acido oleico, batteri, LPS e bleomicina. Altri approcci includono ischemia-riperfusione, puntura cecal legatura, lesione elasticizzato indotta da ventilazione meccanica, l'iperossia o somministrazione sistemica di batteri e LPS5. Questi modelli forniscono un sistema biologico utile per testare le ipotesi cliniche e per lo sviluppo di potenziali terapie. Per simulare umano ARDS, modelli animali dovrebbero riprodurre l'infiammazione e lesione acuta alle cellule epiteliali ed endoteliali con difetti nella funzione di barriera nei polmoni.
Gli esosomi sono vescicole di membrana con 20-200 nanometro di diametro, il cui contenuto molecolare contiene proteine, DNA, RNA e lipidi, e facilitano la comunicazione intercellulare nel microambiente del tessuto tramite trasferimento composizione molecolare. Gli esosomi sono secreti da più tipi di cellule, quali cellule endoteliali, cellule epiteliali, cellule muscolari lisce e cellule del tumore e presenti nel fluido del corpo umano. Studi indicano che gli esosomi regolano cross-talk tra le cellule immunitarie e le cellule stromali durante malattie infiammatorie, infettive e sterile, e loro rilascio anormale sembra essere regolata da vari stimoli naturali e sperimentali durante fisiologico e processi patologici6. Tale rete di comunicazione può svolgere un ruolo importante nella patogenesi di malattie polmonari e può influenzare la progressione fisiopatologico7,8. Come 18-22 nucleotidi RNA non codificanti, Mirna esiste nel siero sia dei tessuti e fluidi corporei, al plasma e modula l'espressione di mRNA a livello post-traduzionale9,10.
Mirna confezionati in esosomi influenzano la differenziazione e la funzione di più tipi di cellule, e livelli eccessivi sono associati con una varietà di malattie, compreso il cancro, malattie polmonari, obesità, diabete e malattia cardiovascolare11, 12,13,14,15,16. Entrata in cellule del destinatario e la spola di Mirna exosomal facilitare comunicazioni intercellulari modificando l'emostasi del microambiente17,18. Ferita di polmone acuta è un processo complesso, che prevedono più tipi di cellule con vasta comunicazione intercellulare attraverso esosomi8. miR-155 e miR-146a condividere il comune meccanismo di regolazione trascrizionale e contribuire alla risposta infiammatoria e la tolleranza immunitaria19,20. Gli studi recenti indicano che entrambi modulano la risposta infiammatoria via exosomal Mirna spola tra cellule immunitarie21. Tuttavia, i meccanismi molecolari sottostanti effetti modulatory di Mirna exosomal alveolare risposta all'endotossina rimangono poco chiari, senza dubbio la potenziale rilevanza clinica e traslazionale implicazione merito ulteriore indagine.
Modelli di co-coltura sono impiegati per definire l'interazione dei tipi cellulari specifici nell'ambiente complesso, quali l'infiammazione e cancro22,23. Queste piattaforme forniscono una strategia alternativa per interrogare i cross-talk tra tipi cellulari in particolare per le cellule immuni e strutturali.
Endotracheale, amministrazione aerosolizzato, intraperitoneale o sistemica di LPS sono ampiamente usati per indurre sperimentale del polmone lesioni24,25,26e hanno dimostrato di indurre permeabilità epiteliale ed endoteliale difetti. Qui usiamo LPS intraperitoneale per indurre un modello settico della ferita acuta del polmone in topi. Entro 24 h dalla somministrazione intraperitoneale di LPS, difetti di permeabilità sono indotte nei polmoni con il reclutamento di cellule infiammatorie. Inoltre, mostriamo che esosomi da BAL contengono miRNA-155 e miR-146a, ed esosomi da liquido di BAL inducono l'espressione di citochine pro-infiammatorie in cellule epiteliali destinatario, compreso IL-6 e TNF-α. Questi dati sono il primo a mostrare che i miRNA exosomal vengono secreti nel BAL in questo modello di danno polmonare acuto settico.
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Protocollo
Il protocollo generale richiede 2 giorni, inclusi il primo giorno di induzione di sepsi e l'isolamento del liquido di BAL dall'animale e il secondo giorno per l'isolamento di esosomi dal mouse BALF. Tutte le procedure sono state esaminate e approvate dal comitato di uso Atlanta VA medical center e istituzionali Animal Care.
1. Mouse polmone settica acuta lesioni modello
- Utilizzare 6-8 settimane - topi di C57BL/6J wild-type maschi vecchi (peso g 20-22) per l'animale modello ed eseguire tutte le procedure usando tecniche asettiche e strumenti. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici, tra cui pinze e le forbici per 20 minuti a 121 ° C.
- Distribuire in modo casuale topi in sperimentale e gruppo di controllo. Trattenga i topi su una tavola chirurgica. Trattamento di topi con il lipopolysaccharide di Escherichia coli (LPS, 15 mg/kg) per via intraperitoneale. Secondo il peso corporeo individuale, diluire appropriati dosaggi di LPS a 0,1 mL di PBS per topo, quindi iniettare la soluzione di LPS usando una siringa da 1 mL con ago 27G e iniettare un volume equivalente di PBS agli animali di controllo.
- Tenere topi nella struttura BSL2 animale, che consiste di gabbie pulite a temperatura appropriata.
- 24 ore più tardi, eutanasia topi con inalazione di CO2 .
- Selezionare l'area chirurgica nel centro del collo del mouse. Praticare una piccola incisione (circa 5 mm) e separare delicatamente i muscoli per l'accesso alla trachea con forcipe smussato fino a quando la trachea è esposto.
- Ritirare il liquido di BAL del mouse con siringa sterile da 10 mL con un ago da 27 G. In primo luogo, delicatamente, inserire l'ago nella trachea e iniettare 1 mL di PBS sterile lentamente nella trachea, quindi disegnare BALF in una siringa monouso da 3 mL con ago 27G. Al termine della procedura, smaltire siringhe e aghi in contenitore di sharps di biohazard.
- Trattare gli strumenti chirurgici con biossido di cloro, come descritto in precedenza da Chauret et al. 27e quindi sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave per 20 minuti a 121 ° C.
2. esosomi isolamento-serie Ultra-centrifugazione e caratterizzazione
- Raccogliere il liquido di BAL del mouse in provette coniche da 15 mL. Per raccogliere le cellule alveolari, centrifugare i campioni per 10 min a 1.000 g, a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante nuove provette coniche da 15 mL, quindi centrifugare i campioni per 30 min a 4.000 x g a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari.
- Raccogliere il surnatante in ultracentrifuga tubi e centrifugare i campioni per 60 min a 10.000 x g a 4 ° C per rimuovere le particelle più grandi di cellulare.
- Trasferire il surnatante in nuove provette coniche, quindi filtrare i campioni attraverso 0,2 µm siringa-filtro per rimuovere i restanti particelle più grandi.
- Raccogliere campioni in tubi ultracentrifuga e l'equilibrio di tubi. Centrifugare i campioni per 2 h a 140.000 x g a 4° C a pellet gli esosomi.
Nota: La dimensione di esosomi varia 20-200 nanometro. 0,2 µm filtro viene utilizzato per la rimozione di particelle più grandi che sono più di 200 nm in dimensione. - Scartare i surnatanti delicatamente. Dissolva la pallina con 100 µ l PBS o soluzione di lisi e trasferimento esosomi campioni per provette da 1,5 mL e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Microscopio elettronico a trasmissione è consigliabile verificare gli esosomi isolati. - Seguire il campione TEM standard elaborazione protocollo28. Analisi di campioni di esosomi usando microscopia elettronica di trasmissione e prendere immagini, scala bar 200 nm.
3. preparazione del miRNA e Performing miRNA-q-RT-PCR
Nota: miRNA-q-RT-PCR si raccomanda di analizzare il livello di espressione dei miRNA.
- Seguire il protocollo di isolamento standard Mirna e assicurarsi di utilizzare una quantità uguale di RNA purificato nella trascrizione inversa single-strand24.
- Seguire il protocollo standard di PCR in tempo reale per rilevare il livello di microRNA exosomal in liquido di BAL. Utilizzare specifici iniettori di PCR in tempo reale contro miR-155, miR-146a e SnRNA U6. Eseguire la reazione di PCR con apparato PCR quantitativa e normalizzare i valori di espressione per controllo interno U6 snRNA.
Nota: Ogni gruppo è costituito da campioni triplici24.
4. esosomi etichettatura e purificazione
- Sospendere gli esosomi pellet con 100 µ l di soluzione di sospensione in una provetta di polipropilene da 1,5 mL, quindi aggiungere 0,4 µ l della tintura esosomi nell'altro tubo con 100 µ l della soluzione di sospensione.
- Aggiungere esosomi nella soluzione per la soluzione colorante e mescolare accuratamente pipettando rapidamente. Conservare i campioni per 5 min a temperatura ambiente, proteggere dalla luce.
- Mettere una colonna di esosomi spin in una provetta di eluizione da 1,5 mL. Trasferire la miscela di soluzione al centro della colonna di spin di esosomi.
- Girare la colonna per 2 min a 800 x g a temperatura ambiente.
- Scartare la colonna e conservare il campione eluito a-20 ° C fino all'utilizzo.
5. convalida di esosomi Up preso da cellule recettive
- Semi di 1 x 104 MLE 12 prodotto in una diapositiva di 8 pozzetti camera e cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO2.
- Aggiungere 10 µ l con etichetta fluorescente esosomi alle celle. Incubare per 1 h a 37 ° C.
- Rimuovere i mezzi di coltura e lavare le cellule con PBS, quindi fissare le cellule con paraformaldeide 1% per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Montare il vetrino in un mezzo di montaggio con DAPI.
- Analizzare i campioni attraverso un microscopio a fluorescenza e prendere le immagini, ingrandimento 40x.
6. Verifica dell'interazione tra esosomi e cellule recettive
- Seme 2 x 105 MLE12/pozzetto di una piastra di coltura 12-pozzetti contenenti terreno di coltura appropriato e cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO2.
- Aggiungere 20 µ g esosomi dal fluido del mouse BAL MLE12 celle e impostare ripetizioni per gruppo sperimentale.
- 24 ore dopo, lavare le cellule con PBS e aggiungere 600 µ l di tampone di lisi in pozzetto. Agitare la piastra delicatamente e raccogliere campioni di lisi in provetta da 1,5 mL con la pipetta.
- Seguire il protocollo di isolamento di RNA totale standard e protocollo di trascrizione d'inversione del cDNA, completare la trascrizione inversa del cDNA del singolo-filo29.
- Seguire il protocollo standard di PCR in tempo reale per rilevare il livello di espressione di mRNA in cellule recettive29. Utilizzare specifici iniettori di PCR in tempo reale contro TNF-α, IL-6 e ZO-1. Eseguire reazioni di PCR con apparato PCR quantitativa e normalizzare i valori di espressione per il controllo interno GAPDH.
Nota: Ogni gruppo è costituito da campioni triplici.
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Risultati
Per indurre il danno polmonare settico, i topi sono stati trattati con LPS intraperitoneali (15 mg/kg). Entro 24 h dalla amministrazione dei LPS, neutrophilic afflusso è stato visto nei polmoni, come mostrato in Figura 1A. Liquido di BAL del mouse è stato disegnato, seguita da isolamento e purificazione di esosomi. Morfologia di BALF esosomi è stata confermata da microscopia elettronica di trasmissione (Figura 1B).
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Discussione
Modelli murini di malattie sono comunemente utilizzati per valutare la funzione fisiologica dei geni specifici e per ridurre il costo della sperimentazione2. La ferita di polmone acuta settica descritta qui imita risposta infiammatoria visto in esseri umani con ARDS. Questo modello è rilevante per studiare la patogenesi molecolare, sviluppo di biomarcatori e per testare potenziali nuove terapie5.
Sistemi di co-coltura sono rilevanti per gli studi...
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Dichiarazioni
Questo lavoro è stato supportato da recensione di merito VA 2I01BX001786-06A1 finanziamenti a RS.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno dichiarato alcun conflitto di interessi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| lipopolisaccaride | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA kit di isolamento | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α( Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| terreno essenziale minimo (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Soluzione di Trysin-EDTA (0,05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| sono stati marcati con PKH67 attraverso PKH67 Mini Kit di collegamento per celle fluorescenti verdi. | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| (MW3000) | Ultracentrifuga Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP | ultra-trasparenti Beckman Coulter | L-100XP | |
| Beckman Coulter | 344058 | ||
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| microscopi elettronici a trasmissione (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscopio | Olympus | BX41 |
Riferimenti
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