Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un frazionamento cellulare semplice per la separazione subcellulare delle proteine citoplasmatiche e nucleari in biopsie intestinali umane fresche e congelate.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Frazionamento subcellulare dagli esemplari gastrointestinali freschi e surgelati
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo scopo del presente protocollo è quello di frazionare il tessuto intestinale umano ottenuto dall'endoscopia in compartimenti nucleari e citoplasmatici per l'analisi di localizzazione di specifiche proteine o complessi proteici in stati differenti del tessuto (cioè, sano vs malattia). Questo metodo è utile per il frazionamento di entrambi i campioni freschi e congelati di tessuto intestinale; è facilmente accessibile per tutti i laboratori e non richiede molto tempo.
Introduzione
Proteine partecipano a quasi tutte le funzioni biologiche all'interno di una cella e qualsiasi variazione nella loro struttura, la quantità o la posizione può portare a uno scenario di patogeno. Metodi di frazionamento dei campioni del tessuto sono un utile approccio per ridurre la complessità della malattia relative analisi di proteine. Alcuni studi utilizzano informazioni di localizzazione della proteina o arricchiscono una proteina da un compartimento cellulare specifico, quindi un protocollo per il frazionamento riproducibile di proteine intatte è utile per rispondere a taluni quesiti biologici. Determinare la localizzazione subcellulare delle proteine e monitorag....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Questo studio è stato approvato dal comitato di etica di Cruces University Hospital e analisi sono state eseguite dopo consenso informato è stato ottenuto da tutti gli oggetti o i loro genitori.
1. biopsia collezione
Nota: Gli esemplari di biopsia dal duodeno distale dei pazienti sono ottenuti durante l'endoscopia di diagnosi sistematica gestione biopsie comprese tra 2 e 10 mg di peso. Tessuto biopsiato è un tessuto complesso composto da diversi tipi cellulari tra cui cellule epiteliali, immuni ed endoteliali. I gastroenterologi clinici eseguire l'endoscopia segue stabilito linee guida cliniche.
- Posto l....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La figura 1 Mostra un ematossilina eosina di una sezione di biopsia intestinale con villi intatti e strutture della cripta.
Risultati rappresentativi del frazionamento nucleare e citoplasmatica usando questo protocollo sono mostrati nelle figure 2 e 3. Nell'esperimento mostrato in Figura 2, un fresco (Fh) e un congelato (Fz) biopsia son.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo descritto qui è usato per il frazionamento nucleare e citoplasmatico di biopsie intestinali. Le proteine purificate non sono denaturate e può essere utilizzate non solo nell'analisi di western blot come mostrato in Figura 2 e 3 , ma anche nelle analisi che richiedono nativo-piegato proteine quali immunoprecipitazione, analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA) o elettroforesi nativa del gel di poliacrilammide (PAGE).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Autori riconoscono l'assistenza di Ander Lopez e Miren Telletxea per la registrazione e l'editing dei video. ACR è finanziato da una borsa di studio Ikerbasque e un progetto di ricerca dal Asociación de Celiacos di Madrid (ACM). JRB è finanziato dal progetto ISCIII-PI16/00258 e co-finanziato dal FESR/FSE Unione europea "Un modo per fare dell'Europa". È è finanziata da una sovvenzione di progetto di ricerca 2015111068 del basco dipartimento della salute. IRG e AJM sono supportate da sussidi per la fellowship predoctoral da UPV/EHU e il basco Department of Education, rispettivamente.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Inibitori della proteinasi e della fosfatasi | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergente |
| Saggio BCA | Thermo Scientific | 23227 | Kit di quantificazione delle proteine |
| Pestelli monouso in plastica | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Omogeneizzatore a disca | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuga | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
Riferimenti
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
