Indagando su rappresentazioni di oggetti nel macaco dorsale Visual flusso utilizzando registrazioni unitario

Summary

Un protocollo dettagliato per analizzare la selettività di oggetto di parieto-frontale neuroni coinvolti nelle trasformazioni visuomotorie è presentato.

Abstract

Studi precedenti hanno dimostrato che i neuroni in aree parieto-frontale del cervello macaco possono essere altamente selettivi per oggetti del mondo reale, superfici curve definite disparità e immagini di oggetti del mondo reale (con e senza disparità) in un modo simile come descritto in visual ventrale. Inoltre, aree parieto-frontale sono creduti per convertire le informazioni oggetto visivo in uscite motore appropriati, quali la presagomatura della mano durante afferrare. Per meglio caratterizzare la selettività di oggetto nella rete corticale coinvolti nelle trasformazioni visuomotorie, mettiamo a disposizione una batteria di test intende analizzare la selettività di oggetto visivo dei neuroni nelle regioni parieto-frontale.

Introduction

Primati umani e non umani condividono la capacità di eseguire azioni complesse di motore tra cui afferrare oggetti. Per eseguire correttamente queste attività, il nostro cervello ha bisogno completare la trasformazione della proprietà dell'oggetto intrinseco in comandi motori. Questa trasformazione si basa su una sofisticata rete di aree corticali dorsale situato nella corteccia premotoria ventrale e parietale^1,2,3 (Figura 1).

Dagli studi di lesione in scimmie ed in esseri umani^4,5, sappiamo che il flusso visivo dorsale - originari della corteccia visiva primaria e diretto verso la corteccia parietale posteriore - è coinvolto nella pianificazione del motore e visione spaziale azioni. Tuttavia, la maggior parte delle zone di flusso dorsale non è dedicata a un unico tipo di elaborazione. Per esempio, l'area intraparietale anteriore (AIP), una delle zone fine fase nel flusso visivo dorsale, contiene una varietà di neuroni che il fuoco non solo durante afferrare^6,7,8, ma anche durante la visual ispezione del oggetto^7,8,9,10.

Simile a AIP, neuroni nell'area F5, situato nella corteccia premotoria ventrale (PMv), rispondono anche durante la fissazione visiva e oggetto afferrare, che rischia di essere importante per la trasformazione delle informazioni visive in azioni motore¹¹. Parte anteriore di questa regione (sottosettore F5a) contiene neuroni blocca selettivamente a tridimensionale (3D, disparità-definito) immagini^12,13, mentre il sottosettore situato nella convessità (F5c) contiene neuroni caratterizzata da specchio proprietà^1,3, sparando sia quando un animale esegue o osserva un'azione. Infine, la regione posteriore di F5 (F5p) è un campo correlate a mano, con una proporzione elevata dei neuroni visuomotorie reattivi all'osservazione sia e afferrare oggetti 3D^14,15. F5, area 45B, situato a ramus inferiore del solco arcuato, può anche essere coinvolti nell'elaborazione forma^16,17 e afferrare¹⁸.

Test di selettività oggetto nella corteccia parietale e frontale è impegnativo, perché è difficile determinare quali caratteristiche questi neuroni rispondono a e quali sono i campi ricettivi di questi neuroni. Ad esempio, se un neurone risponde ad una piastra ma non ad un cono, che dispongono di questi oggetti sta guidando questa selettività: il contorno 2D, la struttura 3D, l'orientamento in profondità o una combinazione di molte caratteristiche differenti? Per determinare le caratteristiche oggetto critico per i neuroni che rispondere durante la fissazione di oggetto e di cogliere, è necessario impiegare vari test visivi utilizzando immagini di oggetti e versioni ridotte delle immagini stesse.

Una frazione consistente dei neuroni in AIP e F5 non solo risponde alla presentazione visiva di un oggetto, ma anche quando l'animale afferra questo oggetto al buio (cioè, in assenza di informazioni visive). Tali neuroni non risponda a un'immagine di un oggetto che non può essere compresa. Quindi, componenti visive e motorie della risposta sono intimamente connessi, che rende difficile indagare la rappresentazione dell'oggetto di un neurone in queste regioni. Poiché i neuroni visuomotorie possono essere verificati solo con oggetti del mondo reale, abbiamo bisogno di un sistema flessibile per la presentazione di diversi oggetti in posizioni diverse nel campo visivo e a diversi orientamenti se vogliamo determinare quali caratteristiche sono importanti per questi neuroni. Quest'ultimo può essere raggiunto solo mediante un robot capace di presentare oggetti diversi in luoghi diversi in uno spazio visivo.

Questo articolo intende fornire una guida sperimentale per i ricercatori interessati allo studio dei neuroni parieto-frontale. Nelle sezioni che seguono, vi forniremo il protocollo generale utilizzato nel nostro laboratorio per l'analisi delle risposte di oggetto per afferrare e visual in scimmie sveglio Macaco (Macaca mulatta).

Protocol

Tutte le procedure tecniche sono state eseguite in conformità con guida del National Institute of Health per la cura e l'uso di animali da laboratorio e la direttiva europea 2010/63/UE e ha approvate il comitato etico di KU Leuven.

1. generalità metodi per registrazioni extracellulari in scimmie comportarsi sveglio

1. Addestrare gli animali per eseguire le attività visive e motorie necessarie per rispondere alla sua domanda di ricerca specifici. Assicurarsi che l'animale sia in grado di passare in modo flessibile tra le attività durante la stessa sessione di registrazione al fine di testare il neurone estesamente e ottenere una migliore comprensione delle caratteristiche di guida la risposta neurale (Figura 2-3).
   1. Addestrare l'animale nel Visually-Guided afferrare (VGG; afferrare 'nella luce') per valutare le componenti visuomotorie della risposta. Nota: indipendentemente dal compito scelto, gradualmente limitare l'assunzione di liquidi almeno tre giorni prima dell'inizio della fase di formazione.
      1. Trattenere la testa della scimmietta per tutta la durata della sessione sperimentale.
      2. Nella prima sessione, tenere la mano controlaterale alla camera di registrazione presso la posizione di riposo e aiutare l'animale a raggiungere e afferrare l'oggetto, dando manuale ricompensa dopo ogni tentativo.
      3. Rimettete la mano della scimmia sulla posizione di riposo alla fine di ogni prova.
      4. Ogni paio di prove, rilasciare la mano della scimmia e attendere qualche secondo per osservare se l'animale avvia il movimento spontaneamente.
      5. Applicare manuale ricompensa ogni volta che la scimmia raggiunge verso l'oggetto.
      6. Quando la fase di raggiungimento viene acquisita correttamente, aiuta l'animale a sollevare (o tirare) l'oggetto e la ricompensa manualmente.
      7. Come 1.1.1.4 e 1.1.1.5, lasciare la mano della scimmia e attendere qualche secondo per osservare se l'animale avvia il movimento spontaneamente. Dare ricompensa ogni volta che il movimento viene eseguito correttamente.
      8. Correggere il raggiungimento, posizione e l'orientamento di polso come tante volte quanto necessario durante la procedura a mano.
      9. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando l'animale esegue automaticamente la sequenza.
      10. Caricare l'attività automatica. L'animale viene premiato automaticamente quando esegue i movimenti da raggiungere e afferrare per un tempo predeterminato.
      11. Aumentare gradualmente il tempo di mantenimento dell'oggetto.
      12. Introdurre il laser che proietta il punto di fissazione alla base dell'oggetto. Aggiungere quindi l'inseguitore dell'occhio per controllare la posizione dell'occhio intorno l'oggetto-per-essere-afferrato.
   2. Addestrare l'animale in Memory-Guided afferrare (MGG) per indagare il motore componente della risposta, non risentito la componente visiva dello stimolo.
      1. Trattenere la testa della scimmietta.
      2. Seguire la stessa procedura descritta per il VGG assicurandosi che l'animale mantiene la fissazione sul laser durante l'attività all'interno di una finestra definita elettronicamente. Per questa versione dell'attività, la luce si spegne alla fine del periodo di fissazione.
   3. Treno la scimmia a fissazione passiva all'indirizzo visual reattività e selettività di forma.
      1. Trattenere la testa della scimmietta.
      2. Presentare gli stimoli visivi alla scimmia utilizzando un CRT (fissazione passiva di stimoli 3D) o un monitor LCD (fissazione passiva di stimoli 2D).
      3. Presentare un punto di fissazione al centro dello schermo, sovrapposto su stimoli visivi.
      4. Premiare l'animale dopo ogni presentazione dello stimolo e gradualmente aumentare il periodo di fissazione fino a raggiungere gli standard dell'attività.
2. Eseguire un intervento chirurgico, utilizzando abiti, tende e strumenti sterili.
   1. Anestetizzare l'animale con la ketamina (15 mg/kg, intramuscolarmente) e medetomidina cloridrato (0.01-0.04 mL/kg per via intramuscolare) e confermare l'anestesia regolarmente controllando la risposta dell'animale a stimoli, frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e sangue pressione.
   2. Mantenere l'anestesia generale (propofol 10 mg/kg/h per via endovenosa) e somministrare ossigeno con un tubo tracheale. Utilizzare un unguento a base di lanolim per prevenire la secchezza dell'occhio mentre sotto anestesia.
   3. Fornire l'analgesia utilizzando 0,5 cc di buprenorfina (0,3 mg/ml per via endovenosa). In caso di aumento della frequenza cardiaca durante l'intervento chirurgico, può essere somministrato un dosaggio supplementare.
   4. Impiantare un post di testa MRI compatibile con viti di ceramica e acrilico dentale. Eseguire tutti gli interventi chirurgici di sopravvivenza in condizioni di rigorose asepsi. Per una manutenzione adeguata del campo sterile, utilizzare guanti monouso sterili, maschere e strumenti sterili.
   5. Guidati da anatomico a risonanza magnetica (MRI; Coordinate Horsley-Clark), fare un craniotomy sopra l'area di interesse e la camera di registrazione sul cranio della scimmia di impianto. Utilizzare una camera di registrazione standard per registrazioni extracellulari della singola unità o un microdrive multielettrodo, per la registrazione simultanea di più neuroni.
   6. Dopo l'intervento chirurgico, interrompere la somministrazione endovenosa di propofol finché respiro riprende spontanea. Non lasciare incustodito l'animale fino a quando ha riacquistato coscienza e introdurre l'animale nel gruppo sociale solo dopo il recupero completo.
   7. Fornire l'analgesia post-operatoria come consigliato dal veterinario istituzionale; utilizzare ad esempio Meloxicam (5mg/ml per via intramuscolare).
   8. Attendere 6 settimane dopo l'intervento chirurgico prima di iniziare l'esperimento. Questo permette un migliore ancoraggio del post testa al cranio e garantisce che l'animale ha recuperato pienamente dall'intervento.
3. Localizzare l'area di registrazione usando MRI (per registrazioni extracellulari della singola unità) e la tomografia computata (CT; per registrazioni multielettrodo).
   1. Riempire i tubi capillari in vetro con una soluzione di solfato di rame di 2% e inserirli in una griglia di registrazione.
   2. Eseguire risonanza magnetica strutturale (spessore della fetta: 0,6 mm).
4. Monitoraggio dell'attività neurale.
   1. Utilizzare microelettrodi di tungsteno con un'impedenza di 0,8 – 1 MΩ.
   2. Inserire l'elettrodo attraverso la dura madre utilizzando un tubo di guida in acciaio inox 23G e un microdrive idraulico.
   3. Per la discriminazione di spike, amplificare e filtrare l'attività neurale da 300 a 5000 Hz.
   4. Per registrazioni (LFP) potenziali di campo locale, amplificare e filtrare il segnale tra 1 e 170 Hz.
5. Monitorare il segnale di occhio
   1. Regolare una termocamera ad infrarossi davanti gli occhi dell'animale per ottenere un'immagine adeguata della pupilla e del riflesso corneale.
   2. Utilizzare una telecamera infrarosso-basato per assaggiare la posizione della pupilla a 500 Hz.

2. indagare oggetto selettività nelle aree dorsale

1. Eseguire guidata visivamente afferrare (VGG).
   1. Scegliere il giusto cogliere l'installazione a seconda l'obiettivo della ricerca: installazione di carosello o robot (Figura 3).
   2. Per l'installazione di carosello, eseguire l'attività VGG:
      1. Lasciate che la scimmia Poni la mano controlaterale all'emisfero registrato in posizione di riposo nella più completa oscurità per avviare la sequenza.
      2. Dopo un tempo variabile (intervallo intertrial: 2.000-3.000 ms), applicare un laser rosso (punto di fissazione) alla base dell'oggetto (distanza: 28 cm dagli occhi delle scimmie). Se l'animale mantiene lo sguardo all'interno di una finestra di fissazione elettronicamente definito (+ /-2,5 °) per 500 ms, illuminare l'oggetto dall'alto con una sorgente di luce.
      3. Dopo un ritardo variabile (300-1500 ms), programmare un oscuramento del laser (segnale visivo GO) istruire la scimmia per sollevare la mano dalla posizione di riposo e raggiungere, afferrare e tenere l'oggetto per un intervallo variabile (tempo di mantenimento: 300-900 ms).
      4. Ogni volta che l'animale venga eseguito correttamente l'intera sequenza, lo ricompensa con una goccia di succo di frutta.
   3. Utilizzare una simile sequenza di attività per il programma di installazione di robot.
      1. Per quanto riguarda l'installazione di carosello, lasciate che la scimmia Poni la mano controlaterale all'emisfero registrato in posizione di riposo nella più completa oscurità per avviare la sequenza.
      2. Dopo un tempo variabile (intervallo intertrial: 2.000-3.000 ms), si illuminerà il LED (punto di fissazione) l'oggetto (di dentro; distanza: 28 cm dagli occhi delle scimmie). Ancora una volta, se l'animale mantiene lo sguardo all'interno di una finestra di fissazione elettronicamente definito (+ /-2,5 °) per 500 ms, illuminare l'oggetto dall'interno con una sorgente di luce bianca.
      3. Dopo un ritardo variabile (300-1500 ms.), spegnere il LED (segnale visivo GO), istruendo la scimmia per sollevare la mano dalla posizione di riposo e raggiungere, afferrare e tenere l'oggetto per un intervallo variabile (tempo di mantenimento: 300-900 ms).
      4. Ogni volta che l'animale venga eseguito correttamente l'intera sequenza, lo ricompensa con una goccia di succo di frutta.
   4. Durante l'attività, quantificare le prestazioni della scimmia, prestando particolare attenzione al tempismo. Misura sia che il tempo trascorso fra il segnale di andare e l'inizio del movimento mano (tempo di reazione) e tra l'inizio del movimento e l'ascensore dell'oggetto (afferrare il tempo).
2. Eseguire memoria-guida afferrare (MGG; 'Afferrare al buio'). Utilizzare l'attività MGG per determinare se i neuroni sono visuomotorie o motore-dominante.
   Nota: La sequenza è simile a quello descritto per il VGG, ma l'oggetto viene afferrata nel buio più totale.
   1. Identico al compito VGG, lasciate che la scimmia Poni la mano controlaterale all'emisfero registrato in posizione di riposo nella più completa oscurità per avviare la sequenza.
   2. Dopo un tempo variabile (intervallo intertrial: 2.000-3.000 ms), applicare un laser/LED rosso (punto di fissazione) per indicare il punto di fissazione (alla base dell'oggetto per l'installazione di carosello, al centro dell'oggetto per l'installazione di robot; distanza: 28 cm dagli occhi delle scimmie) . Se l'animale mantiene lo sguardo all'interno di una finestra di fissazione elettronicamente definito (+ /-2,5 °) per 500 ms, illuminare l'oggetto.
   3. Dopo un tempo fisso (400 ms), spegnere la luce.
   4. Dopo un ritardo variabile periodo (300-1500 ms) seguendo la luce di offset, dim/spegnere il punto di fissazione (andare CUE) per indicare la scimmia per sollevare la mano e raggiungere, afferrare e tenere l'oggetto (tempo di mantenimento: 300-900 ms).
   5. Ogni volta che l'animale venga eseguito correttamente l'intera sequenza, è possibile dare una goccia di succo come ricompensa.
3. Eseguire fissazione passiva. Per quanto riguarda l'attività VGG, scegliere la più appropriata installazione (installazione carosello o robot) a seconda l'obiettivo della ricerca.
   Nota: Due differenti fissazione passiva attività possono essere eseguite: fissazione passiva di oggetti del mondo reale (utilizzando gli oggetti-per-essere-afferrato le configurazioni carosello e robot) e la fissazione passiva di immagini 3D/2D di oggetti.
   1. Eseguire la fissazione passiva di oggetti del mondo reale.
      1. Presentare il punto di fissazione (laser rosso per l'installazione di carosello proiettata alla base dell'oggetto e LED rosso nel setup del robot).
      2. Se l'animale mantiene lo sguardo all'interno di una finestra di fissazione elettronicamente definito (+ /-2,5 °) per 500 ms, illuminare l'oggetto per 2.000 ms.
      3. Se l'animale mantiene lo sguardo all'interno della finestra per 1.000 ms, lo ricompensa con una goccia di succo.
   2. Eseguire la fissazione passiva di immagini 3D/2D di oggetti.
      1. Presentare tutti gli stimoli visivi su sfondo nero (luminanza di 8 cd/m²) utilizzando un monitor (risoluzione di 1.280 × 1.024 pixel) dotato di un veloce-decadimento P46-fosforo e operati a 120 Hz (distanza di visione: 86 cm).
      2. Nei test 3D, presentare gli stimoli stereoscopicamente alternando le immagini dell'occhio destro e sinistro su uno schermo (CRT monitor), in combinazione con due cristalli liquidi ferroelettrici persiane. Individuare queste persiane davanti gli occhi della scimmia, funzionare a 60 Hz e sincronizzare con il ritracciamento verticale del monitor.
      3. Iniziare la prova presentando una piccola piazza nel centro dello schermo (punto di fissazione; 0,2 ° × 0,2 °). Se la posizione dell'occhio rimane all'interno di una finestra quadrata elettronicamente definiti 1° (molto inferiore per oggetti del mondo reale) per almeno 500 ms, presente lo stimolo visivo sullo schermo, per un tempo totale di 500 ms.
      4. Quando la scimmia mantiene una fissazione stabile fino a quando l'offset di stimolo, la ricompensa con una goccia di succo di frutta.
      5. Per uno studio adeguato della selettività di forma, è necessario eseguire una batteria completa di test con immagini 2D durante attività di fissazione passiva, nella sequenza seguente.
      6. Eseguire un test di ricerca. Testare la selettività visual della cella utilizzando una vasta gamma di immagini (immagini di superficie; Figura 4A), incluse le immagini dell'oggetto che viene afferrata la VGG. Per questa e tutte le successive attività di visual, confrontare l'immagine che evoca la risposta più forte (chiamata 'preferito immagine') a una seconda immagine a cui il neurone sta rispondendo debolmente (chiamato ' immagine obbligatori'). Se il neurone sotto studio risponde anche alle immagini di oggetti, la ricerca di componenti di stimolo specifico Guida reattività della cella (contorno prova, prova di campo recettivo e riduzione).
      7. Eseguire un test di contorno. Dalle immagini originali delle superfici degli oggetti reali (immagini 2D o 3D contenente texture, ombreggiatura e prospettiva), ottenere versioni progressivamente semplificate della stessa forma di stimolo (sagome e contorni; Figura 4B). Raccogliere almeno 10 prove per patologia al fine di determinare se il neurone preferisce la superficie originale, la silhouette o la struttura dalla forma originale.
      8. Eseguire un test di campo ricettivo (RF). Per mappare la RF di un neurone, presentiamo le immagini di oggetti in posizioni diverse su un display (in questo esperimento, 35 posizioni; dimensione di stimolo del 3°), che copre il campo visivo centrale^19,20. Per raccogliere abbastanza ripetizioni di stimolo a tutte le posizioni possibili in un tempo ragionevole, ridurre la durata dello stimolo (stimoli flashed; durata dello stimolo: 300 ms, intervallo intertrial: 300 ms).
      9. Eseguire un test di riduzione. Eseguire un test di riduzione con contorno frammenti presentati al centro della RF per identificare il minimo efficace forma caratteristica (rete). Generare la serie di stimoli in Photoshop ritagliando il contorno di ciascuna delle forme di contorno originale lungo gli assi principali (Figura 3B). Progettare la rete come il più piccolo frammento di forma che evoca una risposta che è almeno il 70% della risposta struttura intatta e non significativamente più piccolo di quello di risposta⁸.
      10. Per una migliore stima della dipendenza di posizionamento (l'effetto della posizione di stimolo sulla selettività di frammento), è necessario eseguire due diversi test. Eseguire un Test di riduzione con i frammenti che si trova nella posizione occupata nella forma muta originale. Eseguire un Test di riduzione con i frammenti presso il centro di massa della forma.
      11. In questa fase, è necessario eseguire un nuovo mapping di RF utilizzando la rete.

Results

Figura 5 trame le risposte di un neurone di esempio registrato da zona F5p testato con quattro oggetti: due diverse forme - una sfera e una piastra-mostrato in due diverse misure (6 e 3 cm). Questo particolare neurone ha risposto non solo alla sfera grande (stimolo ottimo; pannello di sinistra superiore), ma anche per la grande piastra (pannello inferiore sinistro). In confronto, la risposta agli oggetti più piccoli era più debole (superiore e inferiore panne...

Discussion

Un approccio globale allo studio del flusso dorsale richiede un'attenta selezione delle mansioni comportamentistiche e visual test: paradigmi visivi e afferrare possono essere impiegati sia combinato o separatamente a seconda le proprietà specifiche della regione.

In questo articolo, forniamo gli esempi dell'attività neurale registrata in AIP e F5p in risposta a un sottoinsieme di attività visive e motorie, ma risposte molto simili possono essere osservate in altre aree frontali come area 45B ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Robot di presa	GIBAS Universal Robots	UR-6-85-5-A	Braccio robotico dotato di pinza
Motore a carosello	Siboni	RD066/&pugnale; 20 MV6, 35x23 F02	Motore da implementare in una giostra verticale su misura. Permette la rotazione della giostra.
Eye tracker	SR Research	EyeLink II	Sistema di telecamere a infrarossi campionamento a 500 Hz
Filtro	Wavetek Rockland	852	filtri elettronici svolgono una serie di funzioni di elaborazione del segnale con lo scopo di rimuovere i componenti di frequenza indesiderati di un segnale.
Preamplificatore	BAK ELECTRONICS, INC.	A-1	Il modello A-1 consente di ridurre la capacità di ingresso e la captazione del rumore e consente di testare l'impedenza per microelettrodi metallici
Elettrodi	FHC	UEWLEESE*N4G	Microelettrodi metallici (* = Impedenza, a scelta del ricercatore)
Monitor CRT	Vision Research Graphics	M21L-67S01	Il monitor CRT è dotato di un fosforo P46 a decadimento rapido funzionante a 120 Hz
Otturatori ferroelettrici a cristalli liquidi	Display Tech	FLC Pannello Otturatore; LV2500P-OEM	Gli otturatori funzionano a 60 Hz davanti alle scimmie e sono sincronizzati con il ritracciamento verticale del monitor