Questo protocollo combina la caratterizzazione di un campione della proteina mediante elettroforesi capillare e uno screening rapido legante per ligandi caricate mediante elettroforesi capillare di affinità. È consigliabile per le proteine con una struttura flessibile, quali proteine intrinsecamente disordinati, per determinare eventuali differenze nell'associazione per diversi conformeri.
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Articolo metodologico
Analisi di AtHIRD11 intrinseco disordine e l'associazione verso gli ioni del metallo di elettroforesi capillare ed elettroforesi capillare di affinità
In questo articolo
Sommario
Abstract
Piante dipendono fortemente dal loro ambiente. Al fine di adeguarsi ai cambiamenti stressanti (per esempio, siccità e salinità elevata), piante superiori si evolvono classi di proteine intrinsecamente disordinate (IDP) per ridurre lo stress ossidativo e osmotico. Questo articolo utilizza una combinazione di elettroforesi capillare (CGE) e l'elettroforesi di mobilità MAIUSC affinità (ACE) al fine di descrivere il comportamento di associazione di diversi conformeri dell'AtHIRD11 di IDP da Arabidopsis thaliana. CGE viene utilizzato per confermare la purezza del AtHIRD11 e per escludere frammenti, modifiche di posttranslational e altre impurità come motivi per modelli complessi di picco. In questa parte dell'esperimento, i componenti differenti del campione sono separati da un gel viscoso all'interno di un capillare dalle loro diverse masse e rilevati con un rivelatore a serie di diodi. In seguito, il comportamento di associazione del campione verso vari ioni metallici è studiato da ACE. In questo caso, il ligando viene aggiunto alla soluzione tampone e lo spostamento nel tempo di espansione viene misurato per determinare se si è verificato un evento di associazione o no. Uno dei vantaggi di usando la combinazione di CGE e ACE per determinare il comportamento di associazione di un IDP è la possibilità di automatizzare l'elettroforesi del gel e l'analisi di associazione. Inoltre, CGE Mostra un limite inferiore di rilevamento rispetto la classica elettroforesi e ACE è in grado di stabilire la modalità di associazione di un ligando in maniera veloce. Inoltre, ACE può applicarsi anche ad altre specie cariche di ioni metallici. Tuttavia, l'uso di questo metodo per l'associazione di esperimenti è limitato nella sua capacità di determinare il numero di siti di legame. Tuttavia, la combinazione di CGE e ACE può essere adattata per caratterizzare il comportamento di associazione di qualsiasi campione di proteina nei confronti dei numerosi ligandi caricate.
Introduzione
Le piante sono più dipendenti dal loro ambiente rispetto a molte altre forme di vita. Dal momento che le piante non possono spostare in altri luoghi, hanno di adeguarsi ai cambiamenti nel loro ambiente (ad esempio, siccità, freddi e alte concentrazione di sale). Di conseguenza, piante superiori sviluppato proteine dello stress specializzati come dehydrins, che si attengono a molteplici attività per ridurre lo stress cellulare legato alla elevata salinità. Queste proteine legano acqua e ioni all'interno delle cellule, ridurre lo stress ossidativo legando Cu2 +-ioni e interagire con i fosfolipidi come pure il cytoskeletons. Inoltre, associazione Zn
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Protocollo
1. preparazione degli strumenti elettroforesi capillare
-
Preparare i capillari
- Utilizzare una taglierina di vetro per tagliare una silice fusi con bare capillare con un rivestimento esterno di polyimide e un diametro interno di 50 µm in 33 cm (per l'esperimento CGE) e capillari lungo 30 cm (per l'esperimento ACE). Eseguire il taglio su una lastra di vetro.
Nota: I 2 differenti setup sperimentale sono stati sviluppati per 2 diversi strumenti. Al fine di utilizzarli su altri strumenti, deve essere effettuato un trasferimento di metodo corretto e la lunghezza capillare deve essere impostata la lunghezza consentita dello strumento.<....
- Utilizzare una taglierina di vetro per tagliare una silice fusi con bare capillare con un rivestimento esterno di polyimide e un diametro interno di 50 µm in 33 cm (per l'esperimento CGE) e capillari lungo 30 cm (per l'esperimento ACE). Eseguire il taglio su una lastra di vetro.
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Risultati
La figura 1 Mostra l'elettroferogramma per il campione di AtHIRD11 ottenuto durante gli esperimenti CGE. La dimensione del peptide aumenta da sinistra a destra. Numero massimo 4 ha la più grande massa e indica la proteina intatta. I picchi più piccoli 2 e 3 rappresentano le più piccole impurità (ad es., prodotti di degradazione). Il primo picco e l'inconsistenza della linea di base prima potrebbe essere riprodotto anche senza il campione della protei.......
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Discussione
Per tutti gli esperimenti di CE, la preparazione del capillare è un passo fondamentale. Trattandosi di un tubo di vetro con un diametro piccolo, si può rompere facilmente presso i punti dove il rivestimento viene rimosso quando esso viene gestita. L'installazione del vaso capillare nello strumento dovrebbe essere fatto con molta attenzione.
I passaggi critici necessari utilizzando il metodo ACE principalmente riguardano la messa a punto sperimentale. Un altro passo fondamentale è trovare i par.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo grato Masakuza Hara (Research Institute of Green Science e Technology, Università di Shizuoka, Giappone) per la fornitura di campioni proteici AtHIRD11.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Campione AtHIRD11 | Shizuoka University (Gruppo Prof. M. Hara) | -Proteina | deidratante da Arabidopsis thaliana espressa in Escherichia coli |
| Barefused silice capillare | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μ m diametro interno, 363 μ m diametro esterno, rivestimento in poliimmide |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germania) | non più disponibile in commercio | Strumento per elettroforesi capillare; Agilent 7100 CE può essere utilizzato al suo posto |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germania) | G7100A | Strumento per elettroforesi capillare |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germania) | 4606051V | Siringa per filtrazione |
| Filtri per siringhe Rotilabo | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germania) | Filtro a membrana PVDF KY62.1 | per filtrazione in soluzione |
| Eppendorf Research plus 10 μ L | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germania) | 3121 000.023 | Micro pipetta per la manipolazione di campioni |
| Eppendorf Research plus 10 μ L | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germania) | 3121 000.120 | Micro pipetta per la manipolazione delle soluzioni di ligandi |
| Pipetta a bulbo 10 mL | Duran Group GmbH(Magonza, Germania) | 24 338 08 | Preparazione della soluzione NaOH |
| Pipetta a bulbo 25 mL | Duran Group GmbH(Magonza, Germania) | 24 338 14 | Preparazione della soluzione di ligando |
| Pallone tarato in vetro Duran 25 mL | Duran Group GmbH (Magonza, Germania) | 24 671 1457 | Preparazione della soluzione madre del ligando |
| Pallone volumetrico Duran glas 10 mL | Duran Group GmbH (Magonza, Germania) | 24 671 1054 | Preparazione della soluzione madre del ligando |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | non più disponibile in commercio | Separazione durante l'elettroforesi su gel capillare / Tampone SDS alternativo: tampone di esecuzione CE-SDS di Bio-Rad Laboratories (Mü nchen, Germania) Numero di catalogo: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania) | 397229-5G | Marcatore di flusso elettroosmotico |
| Cloruro di manganese (II) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania) | 13217 | Ligando |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania) | 431788-100G | Ingrediente per il risciacquo |
| Cloruro di bario | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania) | 202738-5G | Ligando |
| Dodecil solfato di sodio | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania) | 71729-100G | Proteina solubilizzante per elettroforesi su gel capillare |
| Cloruro di nichel (II) esaidrato | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania) | 654507-5G | Ligando |
| Cloruro di selenio (IV) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania) | 323527-10G | Ligando |
| 2- ammino-2-idrossi-metilpropano-1.3-diolo (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania) | 252859-100G | Ingrediente tampone |
| Cloruro di zinco(II) | Merck Millipore ( Darmstadt, Germania) | 1088160250 | Legante |
| Nitrato di stronzio | Merck Millipore ( Darmstadt, Germania) | 1078720250 | Legante |
| Cloruro di calcio diidrato | Merck Millipore ( Darmstadt, Germania) | 1371015000 | Ligando |
| 37% acido cloridrico | Merck Millipore ( Darmstadt, Germania) | 1003171000 | Regolazione del pH |
| Cloruro di rame(II) diidrato | Riedel-de Haë n (Seelze, Germania) | 31286 | Ligando |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germania) | 10000084; 0 | Bagno ad ultrasuoni |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germania) | G2070-91126 | Pacchetti software per il funzionamento degli strumenti CE, l'acquisizione dei dati e la loro valutazione |
Riferimenti
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins.
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Ristampe e permessi
