È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Analisi di AtHIRD11 intrinseco disordine e l'associazione verso gli ioni del metallo di elettroforesi capillare ed elettroforesi capillare di affinità

5.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/57749

⸱

22 agosto 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo combina la caratterizzazione di un campione della proteina mediante elettroforesi capillare e uno screening rapido legante per ligandi caricate mediante elettroforesi capillare di affinità. È consigliabile per le proteine con una struttura flessibile, quali proteine intrinsecamente disordinati, per determinare eventuali differenze nell'associazione per diversi conformeri.

Abstract

Piante dipendono fortemente dal loro ambiente. Al fine di adeguarsi ai cambiamenti stressanti (per esempio, siccità e salinità elevata), piante superiori si evolvono classi di proteine intrinsecamente disordinate (IDP) per ridurre lo stress ossidativo e osmotico. Questo articolo utilizza una combinazione di elettroforesi capillare (CGE) e l'elettroforesi di mobilità MAIUSC affinità (ACE) al fine di descrivere il comportamento di associazione di diversi conformeri dell'AtHIRD11 di IDP da Arabidopsis thaliana. CGE viene utilizzato per confermare la purezza del AtHIRD11 e per escludere frammenti, modifiche di posttranslational e altre impurità come motivi per modelli complessi di picco. In questa parte dell'esperimento, i componenti differenti del campione sono separati da un gel viscoso all'interno di un capillare dalle loro diverse masse e rilevati con un rivelatore a serie di diodi. In seguito, il comportamento di associazione del campione verso vari ioni metallici è studiato da ACE. In questo caso, il ligando viene aggiunto alla soluzione tampone e lo spostamento nel tempo di espansione viene misurato per determinare se si è verificato un evento di associazione o no. Uno dei vantaggi di usando la combinazione di CGE e ACE per determinare il comportamento di associazione di un IDP è la possibilità di automatizzare l'elettroforesi del gel e l'analisi di associazione. Inoltre, CGE Mostra un limite inferiore di rilevamento rispetto la classica elettroforesi e ACE è in grado di stabilire la modalità di associazione di un ligando in maniera veloce. Inoltre, ACE può applicarsi anche ad altre specie cariche di ioni metallici. Tuttavia, l'uso di questo metodo per l'associazione di esperimenti è limitato nella sua capacità di determinare il numero di siti di legame. Tuttavia, la combinazione di CGE e ACE può essere adattata per caratterizzare il comportamento di associazione di qualsiasi campione di proteina nei confronti dei numerosi ligandi caricate.

Introduzione

Le piante sono più dipendenti dal loro ambiente rispetto a molte altre forme di vita. Dal momento che le piante non possono spostare in altri luoghi, hanno di adeguarsi ai cambiamenti nel loro ambiente (ad esempio, siccità, freddi e alte concentrazione di sale). Di conseguenza, piante superiori sviluppato proteine dello stress specializzati come dehydrins, che si attengono a molteplici attività per ridurre lo stress cellulare legato alla elevata salinità. Queste proteine legano acqua e ioni all'interno delle cellule, ridurre lo stress ossidativo legando Cu2 +-ioni e interagire con i fosfolipidi come pure il cytoskeletons. Inoltre, associazione Zn2 +-ioni permette queste proteine di agire come fattori di trascrizione. Loro capacità di legare il Ca2 +-ioni dopo fosforilazione è stato anche segnalato1.

Multifunzionale di queste proteine è correlato all'assenza di residui dell'amminoacido idrofobo. Di conseguenza, essi mancano eventuali interazioni idrofobiche all'interno della catena peptidica e anche una struttura vincolata. Tuttavia, perché queste proteine hanno una struttura restrittiva, che può essere occupata diversi conformeri alle stesse condizioni. Pertanto, essi possono essere descritti meglio come un insieme di strutture, piuttosto che come una conformazione unica. Proteine con queste proprietà sono conosciute come intrinsecamente disordinati proteine (IDP) e sono un concetto ampiamente utilizzato per proteine dello stress e diafonia tra vie differenti in cellule eucariotiche2.

Uno di questi sfollati interni legati allo stress è AtHIRD11. È uno degli sfollati interni altamente siccità-espresso più di Arabidopsis thaliana. Quindi, i diversi conformeri possono essere separati dal loro raggio effettivo rapporto di addebitare, ed elettroforesi capillare (CE) è stato utilizzato per ulteriori indagini. Precedente ACE gli esperimenti hanno dimostrato le interazioni tra AtHIRD11 e ioni di metalli di transizione quali Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +e Ni2 +-ioni. I risultati dettagliati possono essere trovati in Hara et al. 3 e Nachbar et al. 4.

Il metodo ACE che verrà utilizzato qui si basa su nostri precedenti lavori pubblicati6. Tuttavia, l'aggiunta dell'acetanilide indicatore EOF per il campione della proteina non è adatto. AtHIRD11 Mostra modelli di vasto picco, e aggiunta l'indicatore EOF all'esempio sarebbe travestimento due picchi. Pertanto, l'indicatore è utilizzato in un oggetto run separato. Prima viene esaminato il comportamento di associazione, è confermato che i picchi rilevati durante esperimenti precedenti sono da diversi conformeri. Così, CGE è utilizzato per distinguere tra i conformisti della proteina, modificato il post-traduzionali proteina e impurità, come frammenti di AtHIRD11, di loro masse diverse. Successivamente, è indagato il comportamento di associazione del campione AtHIRD11 caratterizzata verso vari ioni metallici diversi.

Lo scopo di questo articolo è di descrivere un setup sperimentale per distinguere tra un IDP e altri componenti di un campione al fine di valutare le differenze nel comportamento associazione dei diversi conformeri.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. preparazione degli strumenti elettroforesi capillare

  1. Preparare i capillari
    1. Utilizzare una taglierina di vetro per tagliare una silice fusi con bare capillare con un rivestimento esterno di polyimide e un diametro interno di 50 µm in 33 cm (per l'esperimento CGE) e capillari lungo 30 cm (per l'esperimento ACE). Eseguire il taglio su una lastra di vetro.
      Nota: I 2 differenti setup sperimentale sono stati sviluppati per 2 diversi strumenti. Al fine di utilizzarli su altri strumenti, deve essere effettuato un trasferimento di metodo corretto e la lunghezza capillare deve essere impostata la lunghezza consentita dello strumento.
    2. Utilizzare una penna per segnare il centro di una finestra di rilevazione largo 1 cm ad una distanza di 24,5 cm da un'estremità del capillare per l'esperimento CGE e a 21,5 cm da un'estremità del capillare per l'esperimento ACE (lunghezza effettiva).
    3. Rimuovere il rivestimento esterno di polyimide dai vasi capillari di bruciare con una fiamma ossidrica, 0,5 cm prima e dopo il segno fuori. Analogamente, è possibile utilizzare la fiamma ossidrica per rimuovere 1 cm del rivestimento ad entrambe le estremità dei capillari.
      Nota: La lunghezza effettiva può variare leggermente dato che si basa sullo strumento elettroforesi capillare usato.
    4. Pulire le estremità dei capillari e le finestre di rilevamento con etanolo e un tessuto morbido.
      Nota: I capillari non rivestiti sono meno flessibili e probabilità di rompersi.
  2. Installare i capillari
    1. Installare un capillare nel sistema CE con la finestra di rilevamento vicino alla presa.
      Nota: I vari modelli di strumento CE hanno sistemi di portautensili diversi per i capillari. Consultare il manuale dello strumento usato per le istruzioni esatte.

2. preparare le soluzioni

  1. Preparare le soluzioni per l'analisi CGE
    1. Preparare il tris (idrossimetil) amminometano (Tris)-tampone di SDS (100 mM/1% p/v) a pH 8.0.
      1. Utilizzare una maschera respiratoria e una cabina per pesata 1,00 g di sodio dodecil solfato (SDS) in un becher da 100 mL.
      2. Aggiungere 1,21 g di Tris nel bicchiere graduato 100 mL e scioglierla utilizzando 50 mL di acqua deionizzata e un'ancoretta magnetica su un agitatore magnetico.
      3. Mettere un elettrodo di pH nella soluzione e regolare il pH a 8.0 utilizzando 1,0 M HCl.
      4. Riempire la soluzione in un matraccio tarato da 100 mL e aggiungere acqua deionizzata fino al marchio. Agitare delicatamente per evitare qualsiasi formazione di schiuma.
    2. Preparare la soluzione di NaOH 0,1 M.
      1. Pesare 4,0 g di NaOH in un matraccio tarato da 100 mL. Riempirlo fino al segno con acqua deionizzata per fare uno stock di 1m.
      2. Utilizzare una pipetta 10ml per trasferire 10 mL di questa soluzione in un altro matraccio tarato da 100 mL e riempire fino al segno con acqua deionizzata.
    3. Preparare la soluzione di HCl 0,1 M.
      1. Mettere 10 mL di 10 M HCl in un matraccio tarato da 100 mL utilizzando una pipetta volumetrica 10ml e riempire fino al segno con acqua deionizzata. Ripetere questo passaggio per ottenere l'HCl 0,1 M.
    4. Preparare la soluzione di esempio.
      1. Peso 0,5 mg della proteina in una provetta 1 mL. Aggiungere 0,5 mL di tampone Tris-SDS gel dal passaggio 2.1.1 con una micropipetta.
      2. Sciogliere la proteina agitando delicatamente per evitare qualsiasi formazione di schiuma e la degradazione della proteina.
        Nota: Utilizzare ultrasuoni se la proteina non può essere sciolto come descritto; evitare qualsiasi riscaldamento della soluzione.
    5. Riempire le soluzioni in fiale.
      1. Filtrare ogni soluzione attraverso un 0,22 µm fluoruro di polivinilidene (PVDF) filtrare utilizzando un'adeguata siringa direttamente nel flaconcino.
        Nota: Per le soluzioni contenenti gel, la contropressione può essere elevata a causa della sua elevata viscosità.
      2. Preparare i flaconcini di 15 in totale e contrassegnare ciascuno per evitare eventuali confusioni.
        1. Riempire 3 flaconcini con un buffer di gel disponibili in commercio sodio dodecil solfato (SDS) a pH 8.
          Nota: L'uso di un buffer di gel SDS commercialmente disponibile fornisce risultati più precisi.
        2. Riempire 1 flaconcino con 0,1 M NaOH e 1 fiala con 0.1 M HCl per vampate di calore.
        3. Riempire 1 flaconcino con la soluzione di esempio.
        4. Riempire 5 flaconcini con acqua deionizzata e 4 flaconcini con 0,1 mL di acqua deionizzata (immersione fiale).
          Nota: Le fiale tuffantesi vengono utilizzate come fiale dei rifiuti durante il risciacquo del vaso capillare prima di ogni esecuzione. Le estremità capillare vengono immerse in acqua per lavare via i residui di gel.
  2. Preparare le soluzioni per l'analisi ACE
    1. Preparare la soluzione di NaOH 1 M.
      1. Pesare 4,0 g di NaOH in un matraccio tarato da 100 mL.
      2. Riempirlo fino al segno con acqua deionizzata per fare uno stock di 1m.
    2. Preparare l'acido etilendiamminotetracetico di 0.1 M (EDTA) in una soluzione di NaOH 0,1 M.
      1. Trasferire 10 mL di NaOH 0,1 di M in un matraccio tarato da 100 mL, utilizzando una pipetta da 10 mL. Riempirlo fino al segno con acqua deionizzata.
      2. Pesare 2,42 g di EDTA su una barca di pesatura e sciogliere il composto solido in 100 mL di 0.1 M NaOH.
    3. Preparare il tampone di Tris (30 mM).
      1. Aggiungere 3,63 g di Tris, 200 mL di acqua deionizzata e un ancoretta in un becher da mL 500. Porre il becher su un piatto di mescolare e accenderlo.
      2. Mettere un elettrodo di pH nel becher e regolare il pH a 7.4 utilizzo 0.1 M HCl.
      3. Riempire la soluzione in un matraccio tarato da 1 L e riempire fino al segno con acqua deionizzata.
        Nota: Questa procedura deve essere ripetuta o un matraccio tarato più grande è necessaria in quanto più di 1 L è necessaria per l'intera analisi.
    4. Preparare il flusso elettroosmotico acetanilide (EOF)-soluzione di indicatore (60 µM).
      1. Aggiungere 6 mg di acetanilide e 100 mL di tampone Tris in un matraccio tarato da 100 mL.
      2. Mettere il matraccio in un bagno ad ultrasuoni e accenderlo per 30 min.
    5. Preparare la soluzione del campione (1 mg/mL).
      1. Mettere un tubo del microcentrifuge 0,5 mL su una bilancia di precisione e aggiungere 0,3 mg di polvere liofilizzata AtHIRD11 nel tubo.
      2. Utilizzare una micropipetta per aggiungere 0,3 mL di un tampone Tris di 30 mM (pH 7,4) nel tubo. Agitare il tubo con attenzione per sciogliere la proteina.
    6. Preparare le soluzioni di ligando.
      1. Preparare la soluzione di riserva di CaCl2 (5 mM).
        1. Prendere una barca di pesatura, messo su una bilancia analitica e pesare 36,76 mg di CaCl2* H2O.
        2. Usando una micropipetta, sciacquare il CaCl2* H2O dalla pesatura in barca in un matraccio tarato da 50 mL con il tampone Tris precedentemente preparato.
        3. Riempire il matraccio tarato con il tampone Tris all'altezza del marchio.
      2. Preparare le soluzioni stock rimanente (5 mM).
        1. Ripetere il passaggio 2.2.6.1 utilizzando l'altro metallo sali invece di CaCl2* H2O [MgCl2: 23,80 mg, BaCl2: 26,02 mg, Sr (NO3)2: 52,91 mg, di MnCl2: 31,46 mg, SeCl4: 52,91 mg, CoCl 2* 2 H2o: 41,47 mg, Cuclo2* 2 H2o: 42,62 mg, ZnCl2: 3,41 mg e Burundi2* 6 H2o: 59,43 mg].
          Nota: La soluzione di2 ZnCl ha una concentrazione di 0,5 mM. Poiché sono state osservate forti interazioni tra gli ioni e la parete capillare interiore, la concentrazione è stata ridotta di un fattore 104.
      3. Preparare la soluzione di 500 µM CaCl2 .
        1. Riempire 10 mL della soluzione madre CaCl2 e metterla in un matraccio tarato da 100 mL.
        2. Riempire il matraccio tarato con un tampone Tris al contrassegno ed agitare la beuta.
      4. Preparare la soluzione di2 250 µM CaCl.
        1. Riempire 5 mL della soluzione madre CaCl2 e metterla in un matraccio tarato da 100 mL.
        2. Riempire il matraccio tarato con un tampone Tris al contrassegno ed agitare la beuta.
      5. Ripetere i passaggi 2.2.6.3 e 2.2.6.4 per le altre soluzioni stock.
    7. Riempire le soluzioni in fiale.
      Nota: Ogni esecuzione ripetuta ha bisogno di un set di fiale di entrata e di uscita. L'utilizzo di soluzioni di ligando freschi all'ingresso e all'uscita riduce gli spostamenti nel tempo di espansione dopo ogni esecuzione.
      1. Riempire la soluzione2 di CaCl 250 µM in una siringa da 10 mL.
      2. Mettere un 0,22 µm PVDF filtro siringa e spingere 2 mL della soluzione attraverso il filtro utilizzando la siringa al fine di scartare questa soluzione filtrata.
      3. Riempire 10 flaconcini fino a volume massimo consentito con i rimanenti 250 µM CaCl2 soluzione della siringa. Contrassegnare ciascuna come 250 µM CaCl 2 soluzione ingresso flaconcino.
      4. Riempire 10 flaconcini fino a quando sono riempito a metà con la soluzione di 250 µM CaCl2 . Contrassegnare ciascuna come 250 µM CaCl 2 soluzione presa flacone.
      5. Ripetere i passaggi 2.2.7.1 - 2.2.7.4 per le altre soluzioni metalliche contenenti sale.
      6. Ripetere i passaggi per ogni coppia di entrata e uscita fiale utilizzando invece il 30 mM Tris soluzione tampone (pH 7.4).
        Nota: Il 30 mmol/L tampone Tris pH 7.4 è utilizzato tra le esecuzioni al fine di ottenere dati in fase di migrazione per la proteina in assenza di ioni metallici. È necessario al fine di trascurare le modifiche in EOF.
      7. Ripetere i passaggi precedenti per fiala utilizzando invece l'acetanilide soluzione di indicatore di EOF (60 µM). Inoltre, ripetere la procedura utilizzando invece la soluzione del campione (1 mg/mL).

3. capillare Gel separazione elettroforetica

Nota: Preparare la separazione secondo il metodo descritto nel precedente lavoro da Nachbar et al. 4.

  1. Preparare l'analisi
    1. Condizione del capillare
      1. Impostare il termostato a 23 ° C.
      2. Sciacquare il capillare per 10 min a 2,5 bar con 0,1 M NaOH.
      3. Sciacquare il capillare per 5 min a 2.0 bar con 0.1 M HCl.
      4. Sciacquare il capillare per 2 min a 2.0 bar con acqua deionizzata.
    2. Riempire il buffer del gel di SDS
      1. Riempire un capillare per 10 min a 2.0 bar con il buffer del gel di SDS commercialmente disponibili pH 8.0.
    3. Sciacquare il capillare prima di ogni esecuzione di separazione
      1. Sciacquare il capillare per 3 min a 4.0 bar con 0,1 M NaOH.
      2. Sciacquare il capillare per 1 min a 4.0 bar con 0.1 M HCl.
      3. Sciacquare il capillare per 1 min a 4.0 bar con acqua deionizzata.
      4. Sciacquare il capillare per 10 min a 4.0 bar con il buffer del gel di SDS.
  2. Eseguire la separazione
    1. Iniettare la soluzione di esempio per gli esperimenti CGE (passo 2.1.4) idrodinamicamente applicando 0,1 bar per 4 min all'ingresso.
    2. Applicare -16,5 kV e una pressione di 2,0 bar ad entrambe le estremità del capillare per 25 min.

4. affinità analisi elettroforetica capillare

Nota: Preparare la separazione secondo il metodo descritto in precedenti lavori da Nachbar et al. 4 e Cipriano et al. 5.

  1. Condizione del capillare
    1. Impostare il termostato a 23 ° C.
      Nota: La temperatura viene utilizzata secondo i protocolli pubblicati e può essere modificata in altre temperature4,5. Tuttavia, le interazioni sono funzione della temperatura e cambieranno di conseguenza.
    2. Svuotare un capillare per 40 min a 2,5 bar con 0,1 M NaOH.
    3. Sciacquare il capillare per 10 min a 1.0 bar con acqua deionizzata.
    4. Sciacquare il capillare per 30 min a 1,0 bar con un tampone di Tris di 30 mM (pH 7,4).
  2. Preparazione per i metodi ACE
    1. Preparare il metodo per le misurazioni senza leganti.
      Nota: Acetanilide non è stato aggiunto alla soluzione del campione, mentre traveste 2 picchi proteici.
      1. Sciacquare il capillare per 1 min a 2,5 bar con una soluzione di EDTA 0,1 M.
      2. Sciacquare il capillare per 1 min a 2,5 bar con acqua deionizzata.
      3. Sciacquare il capillare per min 1,5 a 2,5 bar con un tampone Tris di equilibramento.
      4. Iniettare la soluzione di acetanilide per 6 s a 0,05 bar e cambiare l'ingresso e uscita fiale per le fiale di tampone Tris.
      5. Applicare 0,05 bar per 2.4 s al fine di spingere la soluzione di acetanilide dalla punta dell'interno ulteriore capillare.
      6. Applicare 10.0 kV per 6 min e rilevare il picco di acetanilide a una lunghezza d'onda di 200 nm.
      7. Ripetere i passaggi 4.2.1.1. -4.2.1.6. utilizzando la proteina campione invece la soluzione di acetanilide e rilevare tutte le cime della proteina.
    2. Preparare il metodo per le misurazioni con ligandi.
      1. Sciacquare il capillare per 1 min a 2,5 bar con una soluzione di EDTA 0,1 M.
      2. Sciacquare il capillare per 1 min a 2,5 bar con acqua deionizzata.
      3. Sciacquare il capillare per min 1,5 a 2,5 bar con la soluzione di ligando di equilibramento.
      4. Iniettare la soluzione di acetanilide per 6 s a 0,05 bar e cambiare l'ingresso e uscita fiale per le fiale di tampone contenente ligando.
      5. Applicare 0,05 bar per 2.4 s al fine di spingere la soluzione di acetanilide dalla punta dell'interno ulteriore capillare.
      6. Applicare 10.0 kV per 6 min e rilevare il picco di acetanilide a una lunghezza d'onda di 200 nm.
      7. Ripetere i passaggi 4.2.2.1 - 4.2.2.6 utilizzando il campione della proteina invece la soluzione di acetanilide e rilevare tutte le cime della proteina.
    3. Ripetere i passaggi da 4.2.1 e 4.2.2 alternativamente al fine di calcolare il cambiamento nei rapporti costo-dimensioni per le varie interazioni proteina-metallo ioni (descritte nella sezione Risultati rappresentante).
      1. Modificare la soluzione della proteina dopo ogni 60 h in una fresca.
        Nota: A questo punto, l'esperimento può essere messo in pausa. Questa procedura è ripetuta almeno 10 x per ciascuna concentrazione dei ligandi poiché il modello di picco varia leggermente da una esecuzione al. Se la soluzione viene utilizzata più di 60 h, le variazioni diventano troppo grandi.
    4. Eseguire i metodi
      1. Eseguire il metodo descritto al punto 4.2.2, usando le soluzioni di ligando alcalino-terrosi (CaCl2, MgCl2, BaCl2e SrCl2 soluzioni).
      2. Continuare a utilizzare il metodo descritto al punto 4.2.2, usando il MnCl2, SeCl4, CoCl2, Cuclo2, ZnCl2e Burundi2 soluzioni anziché le soluzioni di ligando alcalino-terrosi.
        Nota: I cloruri di metalli di transizione quest'ultimo ha mostrato più forti interazioni con il capillare e non possono essere rimosso completamente. Questi risultato di interazioni in turni nel tempo di migrazione da una esecuzione al. Di conseguenza, essi sono stati studiati dopo altri ioni del metallo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La figura 1 Mostra l'elettroferogramma per il campione di AtHIRD11 ottenuto durante gli esperimenti CGE. La dimensione del peptide aumenta da sinistra a destra. Numero massimo 4 ha la più grande massa e indica la proteina intatta. I picchi più piccoli 2 e 3 rappresentano le più piccole impurità (ad es., prodotti di degradazione). Il primo picco e l'inconsistenza della linea di base prima potrebbe essere riprodotto anche senza il campione della protei...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Per tutti gli esperimenti di CE, la preparazione del capillare è un passo fondamentale. Trattandosi di un tubo di vetro con un diametro piccolo, si può rompere facilmente presso i punti dove il rivestimento viene rimosso quando esso viene gestita. L'installazione del vaso capillare nello strumento dovrebbe essere fatto con molta attenzione.

I passaggi critici necessari utilizzando il metodo ACE principalmente riguardano la messa a punto sperimentale. Un altro passo fondamentale è trovare i par...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo grato Masakuza Hara (Research Institute of Green Science e Technology, Università di Shizuoka, Giappone) per la fornitura di campioni proteici AtHIRD11.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Campione AtHIRD11Shizuoka University (Gruppo Prof. M. Hara)-Proteinadeidratante da Arabidopsis thaliana espressa in Escherichia coli
Barefused silice capillarePolymicro Technologies (Phoenix, USA)106815-0017TSP050375, 50 μ m diametro interno, 363 μ m diametro esterno, rivestimento in poliimmide
Agilent 1600AAgilent Technologies (Waldbronn, Germania)non più disponibile in commercioStrumento per elettroforesi capillare; Agilent 7100 CE può essere utilizzato al suo posto
Agilent 7100 CEAgilent Technologies (Waldbronn, Germania)G7100AStrumento per elettroforesi capillare
Injekt 2 mLB. Braun (Melsungen, Germania)4606051VSiringa per filtrazione
Filtri per siringhe RotilaboCarl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germania)Filtro a membrana PVDF KY62.1per filtrazione in soluzione
Eppendorf Research plus 10 μ LEppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germania)3121 000.023Micro pipetta per la manipolazione di campioni
Eppendorf Research plus 10 μ LEppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germania)3121 000.120Micro pipetta per la manipolazione delle soluzioni di ligandi
Pipetta a bulbo 10 mLDuran Group GmbH(Magonza, Germania)24 338 08Preparazione della soluzione NaOH
Pipetta a bulbo 25 mLDuran Group GmbH(Magonza, Germania)24 338 14Preparazione della soluzione di ligando
Pallone tarato in vetro Duran 25 mLDuran Group GmbH (Magonza, Germania)24 671 1457Preparazione della soluzione madre del ligando
Pallone volumetrico Duran glas 10 mLDuran Group GmbH (Magonza, Germania)24 671 1054Preparazione della soluzione madre del ligando
Proteome Lab SDS MW Gel BufferBeckman Coulter (Brea, USA)non più disponibile in commercioSeparazione durante l'elettroforesi su gel capillare / Tampone SDS alternativo: tampone di esecuzione CE-SDS di Bio-Rad Laboratories (Mü nchen, Germania) Numero di catalogo: 1485032 
AcetanilideSigma-Aldrich (Steinheim, Germania)397229-5GMarcatore di flusso elettroosmotico
Cloruro di manganese (II)Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)13217Ligando
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)431788-100GIngrediente per il risciacquo
Cloruro di barioSigma-Aldrich (Steinheim, Germania)202738-5GLigando
Dodecil solfato di sodioSigma-Aldrich (Steinheim, Germania)71729-100GProteina solubilizzante per elettroforesi su gel capillare
Cloruro di nichel (II) esaidratoSigma-Aldrich (Steinheim, Germania)654507-5GLigando
Cloruro di selenio (IV)Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)323527-10GLigando
2- ammino-2-idrossi-metilpropano-1.3-diolo (Tris)Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania)252859-100GIngrediente tampone
Cloruro di zinco(II)Merck Millipore ( Darmstadt, Germania)1088160250Legante
Nitrato di stronzioMerck Millipore ( Darmstadt, Germania)1078720250Legante
Cloruro di calcio diidratoMerck Millipore ( Darmstadt, Germania)1371015000Ligando
37% acido cloridricoMerck Millipore ( Darmstadt, Germania)1003171000Regolazione del pH
Cloruro di rame(II) diidratoRiedel-de Haë n (Seelze, Germania)31286Ligando
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45LAllpax (Papenburg, Germania)10000084; 0Bagno ad ultrasuoni
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1Agilent Technologies (Waldbronn, Germania)G2070-91126Pacchetti software per il funzionamento degli strumenti CE, l'acquisizione dei dati e la loro valutazione

Riferimenti

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Proteine intrinsecamente disordinatelegame agli ioni metallicianalisi di AtHIRD11cambiamenti conformazionalispostamento della mobilità elettroforeticainterazione proteina-ligandopreparazione dei capillarisoluzione tampone Tris
Analisi di AtHIRD11 intrinseco disordine e l'associazione verso gli ioni del metallo di elettroforesi capillare ed elettroforesi capillare di affinità
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.