Articolo metodologico

Misurazione dei livelli di esercizio in Drosophila melanogaster utilizzando il sistema di quantificazione esercizio rotanti (Rich)

DOI:

10.3791/57751

⸱

27 maggio 2018

 , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

In questo articolo

Sommario

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La rotazione esercitare quantificazione sistema (Rich) può indurre esercizio in Drosophila melanogaster attraverso rotazione misurando contemporaneamente la quantità di attività svolta dagli animali. Qui, presentiamo un protocollo punto-per-punto dettagliare come misurare i livelli di attività degli animali vivendo rotazionale esercizio trattamenti utilizzando il reqs

Abstract

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Drosophila melanogaster è un nuovo organismo modello per studi di biologia di esercizio. Fin qui, due sistemi di esercizio principale, la Power Tower e il Treadwheel sono stati descritti. Tuttavia, un metodo per misurare la quantità di ulteriori attività animale indotta attraverso il trattamento di esercizio è stato carente. La rotazione esercitare quantificazione sistema (Rich) riempie questa esigenza, fornendo una misura di attività degli animali per gli animali vivendo esercizio rotazionale. Questo protocollo dettagli come usare il REQS per valutare l'attività degli animali durante l'esercizio rotazionale e illustra il tipo di dati che possono essere generati. Qui, dimostriamo come la REQS è utilizzata per misurare le differenze di sesso - e ceppo-specifici nell'attività indotta da esercizio. Il REQS è utilizzabile anche per valutare l'impatto di vari altri parametri sperimentali quali età, dieta o popolazione dimensioni sull'attività indotta da esercizio. Inoltre, può essere utilizzato per confrontare l'efficacia di differenti protocolli di training. D'importanza, essa consente di standardizzare trattamenti di esercizio tra i ceppi, che permette al ricercatore di raggiungere gli importi uguali di attività tra gruppi se necessario. Così, il REQS è una nuova risorsa notevole per esercizio biologi che lavorano con il sistema di modello di Drosophila e integra i sistemi esistenti di esercizio.

Introduzione

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Recentemente, i ricercatori hanno iniziato a utilizzare il moscerino della frutta Drosophila melanogaster a studiare biologia di esercizio. D. melanogaster è stato un sistema di modello genetico per oltre 100 anni1,2. Tuttavia, ricerca di Drosophila ha contribuito non solo la genetica, ma anche ad una varietà di altre discipline tra cui neurobiologia, biologia del comportamento e fisiologia3. Nel 2009, la Power Tower, la prima macchina di esercizio per Drosophila fu descritto4. La Power Tower si avvale della risposta geotassi negativa degli animali. Quando sono disturbati, Drosophila tendono a spostarsi nella parte superiore del loro recinto. Questa risposta è ben consolidata ed è la base del saggio popolare "anello" (geotassi negativa iterativo rapido5) che viene utilizzato per stimare la capacità di arrampicata e/o idoneità fisica in Drosophila. La Power Tower utilizza un braccio meccanico collegato ad un'unità motore per sollevare ripetutamente una serie di animali nei loro recinti da molti pollici e farli cadere indietro a terra per indurre la risposta negativa geotassi (Tinkerhess et al. 20126 fornire un video che illustra l'utilizzo di Power Tower). Trattamento prolungato sulla Torre di potere così aumenta la quantità di attività fisica (in esecuzione o volare) gli animali eseguire rispetto agli animali di controllo non trattata e sopra tempo porta al miglioramento delle prestazioni nell'analisi della anello per idoneità fisica4. Così, questo lavoro ha dimostrato la fattibilità dell'utilizzo di Drosophila come modello per la biologia di esercizio.

Per espandere il repertorio degli strumenti disponibili per la ricerca di esercizio Drosophila, nel 2016, Mendez e colleghi descritto una seconda macchina di esercitazione di Drosophila, il Treadwheel7. Simile alla Power Tower, il Treadwheel sfrutta la risposta negativa geotassi di Drosophila. Tuttavia, questa risposta è indotta dalla rotazione continua dei recinti degli animali, piuttosto che di sollevamento e farli cadere come la Power Tower. Questo metodo di induzione è più delicato e permette per un regime di esercizio orientato endurance più che evita qualsiasi trauma fisico che potrebbe verificarsi durante l'esercizio nella Power Tower (Vedi Katzenberger, R. J. et al 20138 per l'impatto del ripetuto fisico trauma sulla salute di Drosophila). Simile al Power Tower4, trattamento di esercizio degli animali sul Treadwheel conduce ad una varietà di risposte fisiologiche, compresi cambiamenti di forma fisica, i livelli del trigliceride e corpo peso7. Così, due metodi complementari sono disponibili per i biologi di Drosophila studiando esercizio.

Una limitazione di sia la Power Tower e il Treadwheel è l'impossibilità di misurare la quantità di attività indotta dal trattamento di esercizio. L'analisi di video-registrazioni dal vivo tratte dal Treadwheel ha dimostrato che c'erano differenze significative tra i vari ceppi di Drosophila in come rispondono al trattamento esercizio7. In particolare, i ceppi studiati hanno differito da in quanto attività ulteriori che animali eseguita quando stimolato7. Questa osservazione ci ha spinti a sviluppare un terzo sistema di esercizio, la rotazione esercitare quantificazione sistema (Rich), che permette di misurare i livelli di attività degli animali durante esercizio indotta da rotazione9. Il REQS utilizza un commercialmente disponibili attività Monitoraggio unità che è installato su un braccio girevole per stimolare esercizio mediante rotazione come il Treadwheel. Il lavoro iniziale con il Rich conferma che geneticamente diversi ceppi di Drosophila — e i sessi - può avere significativamente differenti risposte alla stimolazione rotazionale e quindi la quantità di esercizio indotta non è identica tra differenti genotipi9 . Così, il REQS consente ora i biologi della drosofila misurare la quantità di esercizio indotta dal trattamento, aprendo una varietà di nuove vie di ricerca nel campo di esercizio.

Qui descriviamo in dettaglio come utilizzare i requisiti per la quantificazione dell'esercizio rotazionale. Il REQS induce esercizio rotazionale e misura contemporaneamente i livelli di attività degli animali trattati. Il REQS è in grado di ospitare una grande varietà di programmi di esercizio, che vanno dal semplice 2h regime di esercizio continuo dimostrato qui ai più complessi metodi di addestramento di intervallo come descritto da Mendez e colleghi7e la stimolazione può essere regolata tramite velocità di rotazione (tra circa 1-13 di rotazioni al minuto). A seconda dell'unità di monitor attività utilizzato per produrre il REQS, questo metodo è adattabile per l'analisi delle singole mosche o grandi popolazioni di animali. A causa di questa versatilità, la REQS fornisce ai ricercatori di Drosophila con una serie di opportunità di studiare, ad esempio, regimi di esercizio differenti, interventi di dieta o impatto della densità della popolazione.

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Protocollo

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Il REQS consiste di un'unità di Drosophila Activity Monitor (per informazioni di origine, vedere Tabella materiali) montato su un braccio rotante che è controllato da un gruppo motore (Figura 1). Monitor attività determina la frequenza in un determinato intervallo di tempo la matrice di raggi laser al centro del tubo dosaggio di dissezione è interrotta. Per le illustrazioni dettagliate e una caratterizzazione approfondita, vedere la nostra precedente pubblicazione9. Mentre il nostro sistema utilizza l'unità di LAM25H, il REQS può essere modificato per accogliere anche altre unità di Drosophila Activity Monitor.

1. Verifica dell'installazione della REQS

  1. Test di carico mosche in provette di vetro da anestetizzare gli animali con CO2 o altro metodo scelto per movimentazione, spostandoli nelle provette vuote e i tubi di tappatura.
  2. Inserire provette di vetro rinforzata negli slot dell'unità monitor attività. Fissare i tubi utilizzando gomma O-ring (17-18 gauge) e/o bande di gomma su entrambi i lati dell'unità per garantire i tubi non si muovono durante la rotazione:
    1. Infilare un o-ring la provetta del campione e posizionare l'o-ring vicino il punto centrale del tubo. Inserire la provetta del campione in un alloggiamento del monitor attività dalla parte anteriore e centrarlo.
    2. Spostare l'o-ring come necessario e garantire che, una volta la provetta del campione è centrata, l'o-ring è scivolata come vicino all'unità di monitoraggio di attività possibili. Fissare la provetta del campione di scivolare un secondo o-ring del tubo di vetro dal retro, spostare nuovamente l'o-ring come vicino all'unità di monitoraggio di attività possibili.
  3. Avviare la rotazione della REQS spostando l'interruttore di alimentazione sulla parte anteriore dell'unità. Regolare la velocità di rotazione con la manopola sulla parte anteriore dell'unità per la velocità desiderata (4 rpm (giri al min) in questo esempio).
    Nota: La velocità di rotazione in questo esempio è stato scelto per abbinare un studio precedentemente pubblicato7. Come diverse velocità di rotazione si tradurrà in livelli differenti attività degli animali, quando si inizia un nuovo studio, ottimizzazione della velocità di rotazione per lo specifico set-up sperimentale (genotipo, la durata del periodo di esercizio, ecc.) può essere necessario.
    Nota: È importante per assicurarsi che i tubi siano correttamente posizionati affinché essi non trascinare lungo la parte inferiore dell'unità REQS durante la rotazione.
  4. Testare la connessione al sistema di raccolta di dati fornito con l'unità di Drosophila Activity Monitor aprendo il software DAMSystem308 e garantire che la luce di connessione rimane verde per varie rotazioni. Il software inizierà registrazione dati in un file di testo "monitorX" (X è il numero di unità se si utilizzano più monitor) immediatamente all'atto dell'apertura. Frequenza di registrazione può essere regolato nella scheda "Preferenze"; registriamo in genere in intervalli di 5 min.
  5. Esaminare il file di testo generato dal software DAMSystem308 per garantire che la connessione dati funziona correttamente. Problemi con la connessione causare ritagli, punti di tempo dove 0 attività viene registrata per tutte le posizioni nel REQS (Vedi Risultati rappresentante e tabella 2). Se si verificano ritagli, regolare le connessioni dati che porta alla presa del telefono rotante, come durante la rotazione, questa connessione può diventare sciolti o intrecciati. Troviamo che stabilizzare la connessione con nastro aiuta a prevenire questo problema.

2. preparazione degli animali

Nota: Tutti gli animali erano sollevati e testati in condizioni standard in un'incubatrice (25 ° C, umidità 60-70%, ciclo luce/buio di 12 h) su melassa/farina di mais media10.

  1. Due settimane prima dell'esperimento previsto, impostare fiale con densità degli animali è controllata per raccogliere le mosche sperimentale da; in genere abbiamo istituito fiale con 7 maschi e 10 femmine. Con uno stock sano, da un singolo flaconcino, circa 15 vergini maschi e 15 femmine possono essere raccolti nel corso di un periodo di 4 giorni. Regolare il numero di flaconcini impostare basato sul numero di animali necessari per l'analisi; un dosaggio tipico nel nostro laboratorio include 10 insiemi di 10 vergini maschi e femmine per genotipo (100 maschi e 100 femmine).
    Nota: Non-Vergine mosche possono essere utilizzati a seconda la domanda specifica che sperimentale. Se conducendo esperimenti a lungo termine con gli animali non-vergine, striscianti larve possono interferire con accurata attività di monitoraggio.
  2. Rimuovere le mosche di padre una settimana dopo aver impostato le fiale.
  3. A partire dal giorno 10 dopo l'impostazione le fiale, raccogliere mosche Vergine dai flaconcini e archiviarli separati per sesso.
  4. Raccogliere gli animali sufficienti per l'esperimento e l'età loro come necessario, in questo esempio 3 giorni.
    Nota: Abbiamo in genere anestetizzare gli animali con CO2 per la movimentazione. CO2 è conosciuto per influenzare i livelli di attività degli animali per lunghi periodi di tempo dopo il trattamento (ad esempio, Vedi Bartolomeo et al 201511). Se l'effetto di2 CO interferisce con saggi a valle previsti o analisi, utilizzare un metodo diverso anestesia come amputate di ghiaccio.

3. raccolta dei dati con il Rich

  1. Anestetizzare gli animali da utilizzare per lo studio di quantificazione di esercizio con CO2 o un altro metodo di anestesia. Dividerli in gruppi secondo le necessità e caricare i gruppi di animali in tubi di vetro vuota di activity monitor; in questo esempio, 10 animali della stessa età sono caricati al tubo di vetro, con 10 ripetizioni per ogni tipo di animale (genotipo/sesso). Assicurarsi di prendere nota di quale tipo di animale viene caricato in ogni provetta.
    Nota: Per gli esperimenti più lunghi, alimentare può essere incluso nelle provette dei campioni. In questo caso, è essenziale che il cibo sia sicuro e non diventare sloggiato durante la rotazione.
  2. Caricare le provette di vetro nell'unità REQS e fissarli con la gomma O-ring. Se si lavora con più di un genotipo/sesso, utilizzando un disegno di blocco randomizzato o randomizzazione della posizione degli animali nella REQS eliminerà i potenziali effetti di posizione. Randomizzazione può essere raggiunto assegnando ogni flaconcino un numero casuale, ad esempio da un web-based generatore di numeri casuali (ad esempio, https://www.randomizer.org/) o in un foglio di calcolo, e poi ordinare le fiale sulla base del numero casuale.
  3. Inserire il REQS l'incubatrice per garantire la temperatura costante, umidità e luce condizioni. Assicurarsi che i cavi dati e di alimentazione siano collegati correttamente.
  4. Consentire agli animali di recuperare dall'anestesia e di acclimatarsi al nuovo ambiente per 1 h.
  5. Iniziare l'esperimento avviando rotazione di REQS alla velocità desiderata.
    Nota: Un'altra opzione è in primo luogo raccogliere i dati di attività di base dagli animali prima dell'inizio della rotazione, seguita registrando livelli di attività in risposta a stimolazione rotazionale.
  6. Avviare la raccolta dei dati aprendo il software DAMsystem308 (semplicemente aprendo la raccolta di dati software iniziati). I dati vengono scritti in un file di testo l'intervallo impostato (qui, 5 min); Se necessario, modificare le impostazioni di intervallo nella scheda "Preferenze" (Vedi punto 1.4).
  7. Per garantire che i dati sono trasmessi con successo al computer, aprire il file di testo generato dal software DAMsystem308 dopo uno o due intervalli di tempo sono passati e confermano che i dati vengano scritti nel file. Chiudere e riaprire il file per visualizzare dati da eventuali punti di tempo aggiuntivo. Raccogliere dati per la quantità desiderata di tempo; in questo esempio, 2h.
    Nota: Non aprire l'incubatrice durante il periodo di test, come gli animali sono molto sensibili a qualsiasi tipo di disturbo e probabilmente risponderà con attività aumentata.
  8. Alla fine dell'esercizio assay, terminare la raccolta di dati chiudendo il software DAMsystem308, poi si spegne il reqs Rimuovere gli animali dalle provette di vetro e pulire i tubi. Gli animali possono essere spostati indietro in fiale di cibo se ripetuti sono necessarie misure a diverse età.
    Nota: In caso di decessi durante il regime di esercizio, e dovrebbe essere registrato, come la presenza di mosche morte può avere un impatto attività conteggi. Nella nostra esperienza con le DGRP2 linee fly12,13, esercizio a 4 giri per 2 h non ha provocato morti, ma più debole ceppi potrebbero rispondere in modo diverso.

4. analisi dei dati

  1. Aprire il file. txt con l'etichetta "Monitor1" prodotte dal software DAMSystem308.
  2. Esaminare il file di dati per eventuali problemi che possono verificarsi durante l'acquisizione dei dati (tempo perso punti, ecc.; Tabella 1). Se necessario, censurare il file rimuovendo dati punti all'inizio e alla fine della registrazione.
  3. Utilizzando il software statistico di vostra scelta (ad es., R), analizzare i dati raccolti. Genera statistiche descrittive e realizza analisi della varianza (ANOVA) per studiare effetti come il sesso e il genotipo, se i dati sono normalmente distribuiti. Se i dati non sono distribuiti normalmente, è possibile utilizzare metodi non parametrici, come test di Kruskal-Wallis, per confrontare i gruppi. Le analisi specifiche necessarie dipenderà la questione scientifica specifica e il disegno sperimentale.

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Risultati

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L'output di un singolo tratto con il Rich è una tabella di dati prodotta dal software DAMSystem308, che sarà contrassegnata con "Monitor1.txt" per impostazione predefinita (per vedere un esempio supplementare File 1). Un Estratto da una tabella di questo tipo è illustrato nella tabella 1. Ogni colonna contiene i dati da un tubo di dosaggio individuale, mentre le righe contengono l'attività misurata in ogni intervallo di tempo dall'inizio dell'esperimento ...

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Discussione

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Come illustrano i risultati rappresentativi, il REQS è in grado di misurare accuratamente l'attività di esercizio Drosophila. Il REQS è flessibile e permette ai ricercatori di affrontare una serie di domande di ricerca relazionati all'esercizio biologia o interventi di esercizio. Ci sono due passaggi critici nel protocollo per evidenziare. In primo luogo, è essenziale per verificare l'installazione di REQS per garantire che la trasmissione dati dalla REQS alla DAMSystem308 sta funzionando correttamente. Se non impostato ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Il lavoro è stato supportato dal premio numero P30DK056336 da nazionale Istituto di diabete e digestivo e rene malattie attraverso una sovvenzione pilota dalla nutrizione e obesità Research Center presso la University of Alabama a Birmingham per NCR.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Monitoraggio dell'attività della Drosophila TricineticaLAM25HREQS componente
Cavo telefonico DistricanteUvitaluv20170719REQS
componente Chiusure per fiale (flugs)Genesee Scientific49-102Drosophila colture forniture
Fiale Genesee Scientific32-120Forniture per colture di Drosophila
Rete per colture di DrosophilaCarolina Biological Supply173090Forniture per colture di Drosophila
Farina di maisPepsico43375Drosophila media
Melassa Golden BarrelBLA-GALDrosophila media
AgarApex Bioresearch66-103Drosophila media
Lievito secco inattivoGenesee Scientific62-106Drosophila media
TegoseptApex Bioresearch20-258Drosophila media
Acido propionicoGenesee Scientific20-271Drosophila media

Riferimenti

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  1. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  4. Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance. PLoS One. 4 (6), e5886(2009).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (61), (2012).
  7. Mendez, S., et al. The TreadWheel: A novel apparatus to measure genetic variation in response to gently induced exercise for Drosophila. PLoS One. 11 (10), e0164706(2016).
  8. Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
  9. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS One. 12 (10), e0185090(2017).
  10. Reed, L. K., et al. Genotype-by-diet interactions drive metabolic phenotype variation in Drosophila melanogaster. Genetics. 185 (3), 1009-1019 (2010).
  11. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  12. Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Res. 24 (7), 1193-1208 (2014).
  13. Mackay, T. F., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  14. Berlandi, J., et al. Swing Boat: Inducing and recording locomotor activity in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer's disease. Front Behav Neurosci. 11, 159(2017).
  15. Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Sci Rep. 5, 8454(2015).

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