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Articolo metodologico

Formazione di Biofilm orali su differenti materiali per impianti dentali

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DOI:

10.3791/57756

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24 giugno 2018

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1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione di biofilm orali su materiali di titanio e ossido di zirconio per i pilastri di protesi dentarie, compresa l'analisi di attuabilità delle cellule batteriche e caratteristiche morfologiche. Un modello in situ associato con tecniche di microscopia potente viene utilizzato per l'analisi di biofilm orale.

Abstract

Impianti dentali e loro componenti protesici sono inclini a colonizzazione batterica e la formazione di biofilm. L'utilizzo di materiali che fornisce bassa adesione microbica può ridurre la prevalenza e la progressione di malattie perimplantari. In considerazione l'ambiente orale complessità e oral biofilm eterogeneità, microscopia sono necessarie tecniche che consentono un'analisi di biofilm delle superfici dei denti e materiali dentali. Questo articolo descrive una serie di protocolli implementati per confrontare la formazione di biofilm orali su titanio e materiali ceramici per pilastri protesici, come pure i metodi coinvolti nelle analisi di biofilm orale a livello morfologico e cellulare. Il modello in situ per valutare la formazione di biofilm orali su materiali di titanio e ossido di zirconio per i pilastri di protesi dentale come descritto in questo studio fornisce una buona conservazione del biofilm 48h, dimostrando in tal modo adeguatezza metodologica. La microscopia multifotonica permette l'analisi di un rappresentante di zona del biofilm formato sui materiali di prova. Inoltre, l'uso di fluorofori e l'elaborazione delle immagini usando la microscopia multifotonica permette l'analisi della redditività batterica in una popolazione molto eterogenea di microrganismi. La preparazione di campioni biologici per microscopia elettronica promuove la conservazione strutturale del biofilm, immagini con una buona risoluzione e senza artefatti.

Introduzione

Biofilm batterici sono complesse, funzionalmente e strutturalmente organizzato comunità microbiche, caratterizzato da una diversità di specie microbiche che sintetizzano un polimero extracellulare, biologicamente attivo matrix1,2. L'adesione batterica alle superfici di tipo biotiche o abiotiche è preceduto da una formazione della pellicola acquisita, costituita principalmente da glicoproteine salivari1,3,4. Deboli interazioni fisico-chimiche tra i microrganismi e la pellicola sono inizialmente stabilite e seguite da forti interazioni tra adesine batteriche e recettori glicoproteici della pellicola acquisita. Diversità microbica aumenta gradualmente attraverso la coaggregation dei colonizzatori secondarie ai recettori dei batteri già associate, formando una comunità multispecifica1,3,4, 5.

Omeostasi del microbiota orale e il suo rapporto simbiotico con l'host è importante nel mantenimento della salute orale. La disbiosi all'interno del biofilm orale possono aumentare il rischio per lo sviluppo di carie e malattia parodontale2,5. Gli studi clinici dimostrano una relazione di causa-effetto tra l'accumulo del biofilm su denti o impianti dentali e lo sviluppo di gengivite o peri-implantare mucosite6,7. La progressione del processo infiammatorio porta alla perimplantite e la conseguente perdita dell' impianto8.

Impianti dentali e loro componenti protesici sono inclini a colonizzazione batterica e la formazione di biofilm9. L'uso di materiali con una composizione chimica e la topografia di superficie che fornisce bassa adesione microbica può ridurre la prevalenza e la progressione di malattie perimplantari9,10. Il titanio è il materiale più utilizzato per la fabbricazione di pilastri protesici per protesi; Tuttavia, i materiali ceramici sono stati recentemente introdotti e stanno guadagnando popolarità come alternativa al titanio a causa della loro proprietà estetiche e biocompatibilità11,12. Inoltre importante, materiali ceramici sono stati associati con un potenziale presumibilmente ridotto ad aderire ai microrganismi, principalmente a causa di loro rugosità superficiale, bagnabilità ed energia libera di superficie10,13.

Studi in vitro hanno contribuito a progressi significativi nella comprensione dell'adesione microbica al moncone protesico superfici9,14,15,16,17. Tuttavia, l'ambiente dinamico della cavità orale, caratterizzata dalla sua temperatura variabile e il pH e la disponibilità di nutrienti, oltre che dalla presenza di forze di taglio, non è riproducibile in vitro protocolli sperimentali18, 19. Per ovviare a questo problema, un'alternativa è l'utilizzo di modelli in situ di formazione del biofilm, che vantaggiosamente conserva la sua struttura tridimensionale per ex vivo analisi10,20, 21 , 22 , 23 , 24.

L'analisi della complessa struttura del biofilm formata su substrati orale richiede l'utilizzo di tecniche di microscopia in grado di visualizzare otticamente densa materia25. Microscopia a scansione laser di Multiphoton è una moderna opzione per biofilm analisi strutturale26. È caratterizzato dall'uso di ottica non lineare con una fonte di illuminazione vicino alla lunghezza d'onda infrarossa, pulsato a femtosecondi27. Questo metodo è indicato per l'acquisizione di immagini di autofluorescence materiali o segnato da fluorofori, oltre alle immagini generate da segnali ottici non-lineari, derivati da un fenomeno noto come generazione di seconda armonica. Tra i vantaggi della microscopia multifotonica sono la profondità di grande immagine ottenuta con danno minimo delle cellule causato dall'intensità della luce di eccitazione27.

Per un'analisi di attuabilità del biofilm su superfici abiotiche da microscopia multifotonica, l'uso di acido nucleico fluorescente tinture con differenti caratteristiche spettrali e una capacità di penetrazione nelle cellule batteriche è richiesto28. Fluorophores SYTO9 (verde-fluorescente) e ioduro di propidio (rosso fluorescente) può essere utilizzati per una differenziazione visiva tra batteri vivi e morti28,29,30. Ioduro di propidio penetra soli batteri con membrane danneggiate, mentre SYTO9 entra nelle cellule batteriche con una membrana intatta e compromessa. Quando entrambi i coloranti sono presenti all'interno di una cella, ioduro di propidio sposta SYTO9, contrassegnandolo rosso28,30e ha una maggiore affinità per gli acidi nucleici.

In considerazione l'ambiente orale complessità e oral biofilm eterogeneità, microscopia sono necessarie tecniche che consentono l'analisi di biofilm delle superfici dei denti e materiali dentali. Questo articolo descrive una serie di protocolli implementati per confrontare la formazione di biofilm orali su titanio e materiali ceramici per pilastri protesici, come pure i metodi coinvolti nelle analisi di biofilm orale a livello morfologico e cellulare.

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Protocollo

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della facoltà di odontoiatria di Ribeirão Preto, e il partecipante volontario firmato il consenso scritto (processo 2011.1.371.583).

1. di biofilm in Situ

  1. Selezione dei partecipanti
    1. Selezionare i pazienti sulla base dei seguenti criteri di inclusione: un individuo sano con una dentatura completa e nessun segni clinici delle malattie orali.
    2. Escludere i pazienti sulla base dei seguenti criteri di esclusione: gravidanza, allattamento, carie dentale, una malattia parodontale o trattamento antibiotico in ultimi 3 mesi, fumatore o qualsiasi malattia sistemica che poteva influenzare lo stato parodontale.
  2. Preparazione del dispositivo intraorale
    1. Registrare l'arco mascellare mediante un'impressione di alginato.
    2. Preparare tipo IV pietra aggiungendo 19 mL di acqua per 100 g di polvere di pietra. Versare la pietra nello stampo alginato per fare un modello dell'arco mascellare.
    3. Progettare e fabbricare un dispositivo intraoral acrilico per supportare i provini (dischi in ceramica e titanio).
      1. Fabbricare ritentive fermagli da filo NiCr (0,7 mm di diametro) utilizzando pinze ortodontiche #139 e la loro posizione sul modello. Per posizionare la pinza tra i molari superiori, piegare un'estremità di ogni filo in modo che formano un ciclo.
        1. Adattare il ciclo regione della papilla interdentale. Nella zona occlusale, inserire una delicata curvatura per non interferire con i punti di contatto e con l'occlusione. Rendere un 90° piega all'estremità del morsetto per una ritenzione in acrilico.
        2. Per montare il morsetto nel secondo molare superiore, adattare la curvatura del filo nel terzo cervicale (vestibolare) di contorno del dente (distale) e fare un 90° piegare all'estremità del morsetto per una ritenzione in acrilico.
          Nota: Al fine di fornire un'adeguata conservazione/stabilità al dispositivo intraorale, i ganci ritentivi sono stati posizionati tra i premolari superiori e funzione distale del secondo molare su entrambi i lati dell'arcata dentale.
      2. Manipolare la resina acrilica autopolimerizzante secondo le istruzioni del produttore e premere la resina acrilica tra 2 lastre di vetro (con un distanziatore di spessore di 3 mm interposto) durante la fase plastica, per fare un foglio di spessore di 3 mm.
      3. Stendere il foglio acrilico sulla regione palatale del modello, secondo il disegno del dispositivo e tagliare l'eccedenza della resina acrilica con un carver, prima della polimerizzazione.
      4. Fabbricare i dischi di cera utilizzando una matrice metallica [10 mm di diametro, 2 mm di spessore (superficie di 78,5 mm2)] posizionando la cera fusa nella matrice e aspettando la cera per solidificare. Manualmente è possibile incorporare 4 dischi di cera in resina acrilica, 2 di loro tra i premolari e gli altri 2 accanto ai secondi molari.
      5. Lasciare che la resina acrilica polimerizzare in una pentola a pressione sotto 20 psi di aria compressa per 20 min.
      6. Finire il dispositivo intraorale con un manipolo di laboratorio dentale elettrico e cutter e lucidare con gomma abrasiva.
      7. Regolare il dispositivo per una misura adeguata in bocca utilizzando le apparecchiature descritte sopra.
  3. Preparazione dei campioni di titanio e zirconio
    Nota: I campioni (n = 14) sono 10 mm di diametro e 2 mm di spessore e hanno una superficie di 78,5 mm2.
    1. Lucidare superfici degli esemplari con carte abrasive raffreddato ad acqua decrescente di abrasività (600, 1200 e 2000 grana), per circa 20 min.
      Nota: La lucidatura degli esemplari è stata effettuata per standardizzare la rugosità a 0,2 µm.
    2. Pulire e disinfettare i campioni e dispositivo intraorale con detersivo liquido e acqua di rubinetto e quindi utilizzare un bagno ad ultrasuoni di alcol isopropilico per 15 min. asciugarli con carta assorbente.
    3. Difficoltà gli esemplari nel dispositivo orale intraorale con circa 0,1 mL di adesivo non tossico hot melt (Figura 1).
    4. Installare il dispositivo contenente i campioni nella cavità orale.
      Nota: Il dispositivo intraorale contenente i campioni dovrebbe essere indossato per 48 h. Il dispositivo è stato rimosso e memorizzato in tampone fosfato salino (PBS), mentre il paziente era mangiare e l'esecuzione di pulizia orale.

2. valutazione di attuabilità batterica

Nota: Il campione dimensione n = 10.

  1. Preparare una soluzione di tintura con l'aggiunta di 3 µ l di SYTO9 (verde colorante fluorescente dell'acido nucleico) e 3 µ l di ioduro di propidio (tintura fluorescente rosso dell'acido nucleico) a 1 mL di sterile di acqua distillata.
    Nota: Preparare soluzioni al riparo dalla luce.
  2. Trasferire gli esemplari di una piastra a 24 pozzetti e lavarli accuratamente con PBS per rimuovere eventuali cellule non aderenti.
  3. Aggiungere il volume appropriato (1 mL) di soluzione colorante fluorescente per coprire il campione contenente biofilm. Aggiungere il colorante con molta attenzione per non disorganizzare il biofilm.
  4. Incubare il campione per 20-30 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
  5. Lavare delicatamente il campione di biofilm con acqua distillata sterile per rimuovere qualsiasi colorante in eccesso.
  6. Mettere il preparato in un piatto fondo di vetro ed eseguire laser di multiphoton microscopia per l'analisi di biofilm.
    Nota: L'analisi della redditività delle cellule batteriche è stato effettuato utilizzando un sistema di microscopia multifotonica. La fluorescenza di ioduro di propidio è stata rilevata utilizzando un filtro con una lunghezza d'onda di eccitazione/emissione di 546/680 nm e 477/600 nm per SYTO9. La dimensione delle immagini ottenute è stata 5.16188 x 5.16188 mm, che corrisponde al 26,64 mm2 di superficie totale di ogni campione (78,5 mm2) o 33.94% dell'area totale. Le immagini sono state fatte dalla parte più centrale del campione, con una risoluzione di 1.024 x 1.024 pixel. Il canale rosso e canale verde immagini sono state analizzate separatamente utilizzando Fiji software31. Ogni cella è stata selezionata utilizzando uno strumento di selezione e l'intensità della fluorescenza è stata misurata attraverso la densità integrata dei pixel, sottraendo l'immagine di sfondo.

3. analisi della composizione chimica dei campioni di spettroscopia dispersiva di energia (EDS)

Nota: Il campione dimensione n = 3.

  1. Selezionare 3 esemplari di ogni materiale di prova gratuita di biofilm e valutare la composizione chimica in 2 aree diverse di ciascun campione utilizzando un microscopio elettronico a scansione accoppiato ad uno spettrometro a dispersione di energia, con una tensione di fascio di elettroni di 10 kV32.

4. morfologico del Biofilm batterico di microscopia elettronica a scansione

Nota: Il campione dimensione n = 1.

  1. Difficoltà il biofilm immergendo gli esemplari in glutaraldeide al 2,5%, diluito in tampone cacodilato 0.1 M sodio, pH 7.0-7.3, per 24 h.
  2. Lavare il campione in tampone PBS (pH = 7.6).
  3. Postfix il biofilm con tetrossido di osmio 1% per 1 h.
  4. Lavare il campione in tampone PBS (pH = 7.6).
  5. Disidratare i campioni di biofilm con cura, tenendoli immersi in aumento delle concentrazioni di soluzioni di etanolo (50%, 70%, 90%, 95% e 100%).
    Nota: Eseguire 3 scambi di etanolo ad una concentrazione di 100%. Il passo di disidratazione totale impiegano circa 2 ore.
  6. Trasferire gli esemplari al punto critico asciugacapelli e fare diverse sostituzioni con anidride carbonica (CO2) fino a quando gli esemplari sono asciutti.
  7. Rimuovere i campioni essiccati dall'apparecchio e montarli sui possessori di microscopio elettronico a scansione.
  8. Sputter-cappotto uno strato di 20 nm di oro sulla superficie del provino per 120 s.
  9. Inserire i dischi rivestito in oro nella camera di microscopio elettronico a scansione. Ottenere immagini da 5 diverse aree di ogni esemplare, a 20-30 kV sotto pressione variabile e a 650 X ingrandimento12.

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Risultati

La densità di colonizzazione del biofilm dopo 48 h di crescita in situ è stata rappresentata in questo studio la percentuale dell'area colonizzata sui dischi rispetto alla superficie totale digitalizzata del campione usando microscopia multifotonica (titanio e zirconio 26.64 mm2). Figura 2 rappresenta la densità di colonizzazione batterica sulla superficie dei 3 materiali testati. Una maggiore densità del biofilm è stata osservata sulle su...

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Discussione

Il protocollo descritto in questo studio è stato sviluppato per valutare la formazione di biofilm su materiali di titanio e ossido di zirconio per pilastri protesici, compresa l'analisi di attuabilità delle cellule batteriche e caratteristiche morfologiche. Per ottenere questo risultato, è stato progettato un modello di in situ di formazione del biofilm, che consiste di un dispositivo intraorale in grado di ospitare campioni di prova materiali e tenerli esposta all'ambiente orale dinamico per 48 h. Il dispositiv...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano José Augusto Maulin dal laboratorio di microscopia Multiuser (scuola di medicina di Ribeirão Preto) per la sua generosa assistenza con EDS e SEM analisi e Hermano Teixeira Machado per la sua generosa assistenza tecnica nell'edizione dei video.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Hydrogum 5Zhermack DentalC302070
Durone IVDentsply17130500002
filo NiCrMorelli55.01.070
JET acrilico autopolimerizzanteClá ssico
Cera dentale Clá ssico
Pentola a pressione Essencedental
Carte abrasive grana 600NORTONT216
Carte abrasive grana 1200NORTONT401
Carte abrasive grana 2000Lucidatrice metallografica NORTONT402
Arotec
Alcool isopropilicoSIGMA-ALDRICHW292907
Adesivo hot meltTECSILPAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Kit di vitalità per biofilmInvitrogenL10316
Puntali per pipette, 10 &; LKASVIK8-10   
Puntali per pipette, 1.000 &; LKASVIK8-1000B   
Piastra a 24 pozzetti KASVIK12-024
Piatto con fondo in vetroThermo Scientific150680
AxioObserver microscopio invertitoZEISS
Chameleon vision ii laserObiettivo coerente
EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Olio DICZEISS440452-9903-000
Sensori SDD - X-Max 20mm²Oxford Instruments
Soluzione di glutaraldeideSIGMA-ALDRICHG5882
Tampone di cacodilato di sodio SIGMA-ALDRICH97068 
Tetrossido di osmioSIGMA-ALDRICH201030
Na2HPO4SIGMA-ALDRICHS9638 Utilizzatoper la preparazione di soluzione salina tamponata con fosfato
KH2PO4SIGMA-ALDRICHP9791 
NaClMERK1.06404
KclSIGMA-ALDRICHP9333 
Etanolo assoluto per analisi EMSUREMERK1.00983
CPD 030 Essiccatore a punti criticiBAL-TEC
JSM-6610 Series Microscopio elettronico a scansioneJEOL
SCD 050 Sputter CoaterBAL-TEC

Riferimenti

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