Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

Summary

L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici isolati dal tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Questo protocollo prevede preparazione flash-congelati campioni di tessuto intestinale umano, cryosectioning, colorazione etanolica e disidratazione, LCM e l'estrazione di RNA.

Abstract

Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici raccolti da tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Abbiamo identificato cinque passaggi del flusso di lavoro che sono cruciali per l'ottenimento di RNA isolati dai gangli enterici con sufficientemente alta qualità e quantità per RNA-seq. In primo luogo, quando si prepara il tessuto intestinale, ogni campione deve avere tutto il liquido in eccesso rimosso dal macchiare prima della spianatura serosa quanto possibile nella parte inferiore della grande stampi base. I campioni allora rapidamente sono congelati in cima a una miscela di ghiaccio secco e 2-metilbutano. In secondo luogo, durante il taglio del tessuto, è importante posizionare cryomolds modo che sezioni intestinali in parallelo il piano completo del plesso mioenterico, producendo quindi il maggiore della superficie dei gangli enterici per ogni diapositiva. Terzo, durante LCM, polietilene napthalate (PEN)-diapositive di membrana offrono la massima velocità e flessibilità nel delineare le forme non uniforme dei gangli enterici durante la raccolta dei gangli enterici. In quarto luogo, per la visualizzazione distinte dei gangli enterici all'interno delle sezioni, etanolo compatibile con coloranti, come la viola di Cresyl, offrono ottima conservazione dell'integrità di RNA rispetto acquose coloranti. Infine, per l'estrazione di RNA da gangli catturati, abbiamo osservato le differenze tra kit commerciali di estrazione RNA che restituito superior RNA quantità e qualità, eliminando la contaminazione del DNA. Ottimizzazione di questi fattori nel protocollo corrente notevolmente accelera il flusso di lavoro e produce campioni di gangli enterici con eccezionale qualità di RNA e la quantità.

Introduction

Questo metodo è progettato per ottenere campioni di RNA di alta qualità dei gangli enterici da tessuto intestinale umano mediante microdissezione laser (LCM). Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per fornire sufficiente qualità di RNA e rendimenti per RNA (RNA-seq) di sequenziamento ed è destinato a essere utilizzato con tessuto intestinale umano appena resecato, slegato, flash-congelato.

Disturbi funzionali della motilità gastrointestinale dell'intestino ed interessano uno su quattro persone negli Stati Uniti. Il sistema nervoso enterico (ENS), noto anche come il secondo cervello¹, è spesso al centro di q....

Protocol

Tutti i protocolli descritti qui sono stati approvati dalla Vanderbilt University istituzionale Review Board (IRB).

1. preparazione prima dell'arrivo del tessuto

1. Ottenere l'approvazione IRB corretto e coordinare con agenzie di donazione di organi umani per ottenere tessuto intestinale appena resecato, slegato da donatori che soddisfano tutti i criteri di ricerca necessari per lo studio.
   Nota: Questo protocollo può essere adattato per l'uso con topi e altri modelli del roditore.
   1. Immediatamente dopo la resezione di ogni segmento intestinale, accuratamente lavare il lume con PBS refrigerati o tessuto-memorizzazione per rim....

Results

Abbiamo apportato diversi miglioramenti ai protocolli esistenti che consentono la raccolta relativamente rapida dei gangli enterici dai campioni intestinali umani utilizzando LCM, conforme agli standard per RNA-seq. In primo luogo, abbiamo ottimizzato il congelamento rapido di segmenti di tessuto intestinale in grandi stampi base collocati sulla superficie di un impasto di ghiaccio secco in 2 MB (Figura 1B). Il miglior successo durante cryose.......

Discussion

Questa procedura consente la raccolta efficiente dei numerosi gangli enterici come fonte per la derivazione di RNA per RNA-seq. Qui, abbiamo abbiamo accelerato i processi illustrati in protocolli esistenti mantenendo al massimo l'integrità del RNA. Come tutti i passaggi di questa procedura sono interdipendenti, è importante che tutti i problemi verranno eliminati dall'inizio dello studio e che tutti i campioni sono preparati come similmente ad uno altro come possibile, per ottenere affidabile RNA-seq.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalina tamponata neutra	Sigma	HT501128-4L
2-metilbutano	Fisher	O3551-4
siringa da 3 ml	BD	309628
provette coniche da 50 ml, polipropilene	Corning	05-526B
Stampi base 37x24x5mm, monouso	Microscopia Elettronica Scienze	5025511
Belzer UW  Soluzione per celle frigorifere	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM tappi	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
pellicola trasparente, Press' n Guarnizione	Contento	N.A.
Cresyl Violet Acetato	Acros Organics	AC405760025
tagliere	Microscopia elettronica Scienze	63308
Etanolo, 190-proof	Pharmco-AAPER	111000190
Etanolo, 200-proof	Pharmco-AAPER	111000200
vetro vetrini	Fisher	12-550-343
Guanti, polsino esteso	Microflex		Camici 19010144
, chirurgici-monouso	Kimberly-Clark	19-088-2116
Vassoio, 20 L (vaschetta di sterilizzazione grande in polipropilene)	Nalgene	1335920B
Kimwipes (grande)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (piccolo)	Kimberly-Clark	34133
Sistema di microdissezione a cattura laser (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Mandrino per criostato Leica, grande,  40 mm	Servizio di strumenti di patologia sud-orientale	NA
Microscopio ottico	Olympus	CX43
Obiettivo per microscopio (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
Obiettivo per microscopio (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Setacci molecolari	Acros Organics	AC197255000
Acqua priva di nucleasi	Ambion	AM9937
Kit di estrazione dell'RNA PicoPure	Applied Biosystems	12204-01
Pestello a pellet	Kimble Kontes	4621973
membrana PEN Vetrini LCM	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
Provette senza RNasi, 1,5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
Kit di estrazione dell'RNA "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
Kit di estrazione dell'RNA "B" (RNeasy  Micro kit)	Qiagen	74004
Metodo di estrazione dell'RNA "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
Kit di estrazione dell'RNA "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Paraspruzzi, visiera monouso	Fisher	17-310
Forbici, chirurgico, 14,5 cm "affilato-affilato"	Strumenti per la scienza	14002-14
Filtro per siringa, acetato di cellulosa (0,2 μ m)	Nalgene	190-2520
Mezzo di congelamento dei tessuti Dati	generali Sanità	TFM-5
Xileni	Fisher	X3P1GAL