Articolo metodologico

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

DOI:

10.3791/57763

⸱

10 agosto 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

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Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare lo sviluppo di cuori in zebrafish in 4 dimensioni (4D). Imaging 4D, tramite microscopia di fluorescenza di luce-foglio (LSFM), prende 3-dimensionale (3D) immagini nel corso del tempo, di ricostruire i cuori in via di sviluppo. Indichiamo qualitativamente e quantitativamente che lo shear stress attiva endocardial tacca di segnalazione durante lo sviluppo di camera, che promuove trabeculation cardiaco.

Abstract

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Le forze emodinamiche sperimentato dagli sviluppo cardiaco di influenza cuore, soprattutto trabeculation, che forma una rete di ramificazione escrescenze dal miocardio. Programma genetico difetti nella tacca di segnalazione cascata sono coinvolti nei difetti ventricolari come cardiomiopatia Non-consolidamento ventricolare sinistra o sindrome del cuore sinistro ipoplasico. Usando questo protocollo, è possibile determinare che la sollecitazione di taglio guidato trabeculation e tacca di segnalazione siano legati uno a altro. Utilizzando la microscopia a fluorescenza luce-foglio, visualizzazione del cuore zebrafish sviluppo era possibile. In questo manoscritto, si è valutato se forze emodinamiche modulano l'iniziazione del trabeculation via tacca di segnalazione e così, influenzano la funzione contrattile si verifica. Per qualitativa e quantitativa shear stress analysis, 4-D (3-D + tempo) immagini sono state acquisite durante la morfogenesi cardiaca zebrafish e microscopia di fluorescenza di luce-foglio integrato con sincronizzazione 4D catturato il movimento ventricolare. Viscosità del sangue è stata ridotta tramite gata1a- morpholino oligonucleotidi (MO) micro-iniezione per diminuire la sollecitazione di taglio, quindi, giù-regolando la tacca di segnalazione e attenuando trabeculation. Co-iniezione di Nrg1 mRNA con gata1a MO salvato geni correlati alla tacca per ripristinare trabeculation. Per confermare la sollecitazione di taglio guidato tacca di segnalazione influenze trabeculation, contrazione dei cardiomiociti più ulteriormente è stato arrestato tramite tnnt2a-MO per ridurre le forze emodinamiche, quindi, down-regolazione di geni bersaglio tacca per sviluppare un non-trabecolazioni miocardio. Infine, conferma dei pattern di espressione dei geni Notch sollecitazione di taglio è stata condotta sottoponendo le cellule endoteliali a flusso pulsatile. Così, la microscopia di luce-foglio 4-D scoperto forze emodinamiche sottostante tacca di segnalazione e trabeculation con rilevanza clinica di cardiomiopatia non-consolidamento.

Introduzione

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Le forze biomeccaniche, quali emodinamico shear stress, sono intimamente coinvolti nella morfogenesi cardiaca. In risposta a forze di taglio emodinamico, scanalature e creste del miocardio si sviluppano in una rete trabecolare ondulatorio in allineamento con la regia della sollecitazione di taglio attraverso la valvola di atrioventricolare (AV)1. Trabeculation cardiaca è necessario aumentare la funzione contrattile e la massa del miocardio2. Le mutazioni in vie di segnalazione Notch provocano difetti cardiaci congeniti in esseri umani ed altri vertebrati3. Ad esempio, gata1a4 e tnnt2a5 morpholino oligonucleotidi (MO) sono stati indicati per ridurre la eritropoiesi, mentre l'eritropoietina (EPO) mRNA6 e isoproterenolo (ISO)7 aumentare rosso sangue cellule e frequenza cardiaca rispettivamente e di conseguenza parete shear stress (WSS). Inoltre, segnalazione di ErbB2, a valle della tacca, promuove la proliferazione dei cardiomiociti e differenziazione per generare forza contrattile, che a sua volta attiva Notch segnalazione8,9. È suggerito che lo shear stress governa Notch segnalazione trabeculation guidato per sviluppo ventricolare. Attualmente, ci sono molti studi che tentano di capire meglio gli eventi programmazione genetici che portano al cuore congenito difetti (CHD)10,11,12, ma molto poco stanno studiando come forze meccaniche influenzano che formano il cuore.

Al fine di indagare le forze meccaniche che agisce sull'endocardio, stretta osservazione durante il periodo dello sviluppo deve essere attuata. Tuttavia, è difficile da ottenere immagini di buona qualità di in vivo battendo campioni dovuto l'inerenza della microscopia tradizionale13. Al fine di osservare l'evoluzione nel tempo all'interno di un campione, fisico di sezionamento e di colorazione, pertanto, necessario verificarsi13,14,15. Sebbene la microscopia confocale è ampiamente usata per l'immagine della struttura 3-d di campioni14,16, acquisizione di questi sistemi di imaging ancora è limitata dalla velocità di scansione lenta.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio (LSFM) è una tecnica di imaging unica che permette la visualizzazione in vivo di eventi dinamici con lungo lavoro distanza13. Questa tecnica usa un microscopio fluorescente a luce-foglio per sezione otticamente un esempio17. A causa di illuminazione di solo un foglio sottile di luce sul campione, c'è una riduzione in foto-candeggio e foto tossicità13,18. Il grande campo di vista e lunga distanza di lavoro consente per grandi campioni a rimanere intatto come sono imaged13,14,17. Il basso ingrandimento permette un'area più grande essere imaged, mentre la lunga distanza di lavoro consente per i campioni più spessi essere imaged senza compromettere il rapporto segnale-rumore. Molti gruppi hanno utilizzato LSFM a immagine intera embrioni17, cervelli14,18, muscoli e cuori19 fra altri tessuti, che mostra i diversi tipi di campioni che possono essere imaged.

Anche se la ricerca precedente ha dimostrato ridotto sforzo emodinamico occludendo le tracce afflusso o deflusso del cuore zebrafish, le informazioni sono esclusivamente qualitative. Provoca un'anormale terza sezione, ciclo cardiaco diminuito e valvola alterata formazione20. Le immagini LSFM 4D dare una nuova prospettiva nel senso che la cesoia emodinamica forze influenzano lo sviluppo del tessuto cardiaco. Queste forze meccaniche possono attivare le molecole di segnalazione sensibili alla forza e indurre la formazione delle creste trabecular. Dato l'aspetto di tempo aggiunto dell'imaging 4D, uno è in grado di tenere traccia delle modifiche in fase di sviluppo in tempo reale, che potrebbe portare a nuove rivelazioni che erano passata inosservate in precedenza. Zebrafish è un modello ideale per l'imaging perché gli scienziati possono osservare un intero animale vertebrato contro solo interazioni cellula-cellula. Ossigeno può diffondersi anche attraverso l'intero embrione, che permette lo sviluppo avvengono senza a seconda del sistema vascolare, a differenza nello sviluppo dei mammiferi. Anche se il cuore di zebrafish manca gli organi polmonari, che richiedono un cuore quattro-a temperatura ambiente, c'è un gran numero di geni cardiaci che sono conservate tra zebrafish e gli esseri umani21.

In questo manoscritto, descriviamo come utilizzare microscopia di fluorescenza di luce-foglio all'immagine le trabecole in via di sviluppo nei cuori di zebrafish in varie circostanze. In primo luogo, l'iniezione di gata1a4 o tnnt2a5 MOs sono stati utilizzati a bassa viscosità del sangue e di conseguenza WSS. La morfologia del cuore è stato poi registrata. In un gruppo separato di pesce, abbiamo aumentato il WSS con la somministrazione di EPO mRNA6 o isoproterenolo7 e osservate i risultati. Inoltre abbiamo condotto uno studio di cellulare con diverse portate pulsatile o oscillatorio. Dopo ogni gruppo di imaging, abbiamo trovato che WSS percepita da endocardio via Notch segnalazione iniziati trabeculation.

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Protocollo

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I metodi seguenti sono stati eseguiti in conformità a protocolli UTA e UCLA IACUC. Questi gruppi sperimentali sono stati usati con transgenici Tg(cmlc2:gfp), i mutanti wea (debole atrium) o clo (cloche) : controllo (a) wild-type (WT), (b) gata1a MO e iniezioni (c) tnnt2a MO (tabella 1).

ModelloNomeGeni modificatiFenotipoRiferimento
ControlloWild-typeNessunoN/A
TG(cmlc2:GFP)Catena leggera della miosina cardiacaFluorescenza verde espressa specificamente nel miocardio34
Sollecitazione di taglio di parete in diminuzioneMutante debole atrium (wea)Catena di heacy Atrium-specificheAtrio non può contrarre, compatto ventricolo, spessore della parete del miocardio, stretto lume dialated atrio,37
Mutante Cloche (clo)N/ARimozione completa dell'endocardio, unaturally grande atrio con piccolo ventricolo, tagliatrici cardiaco inesistente41
gata1a MO gata1a Anemia da mancanza di globuli rossi4
tnnt2a MOtnnt2a39
Sollecitazione di taglio di parete maggiore MRNA EPONessunoPolicitemia grave, aumento del numero di cellule del sangue, di circolazione aumentata viscosità6
IsoproterenoloNessunoAumento della frequenza cardiaca7

Tabella 1: Descrizioni di Zebrafish. Definizioni e descrizioni di Zebrafish utilizzati negli esperimenti.

1. Studio Setup

  1. Preparare Nrg1 ed EPO mRNA per trabeculation soccorso.
    1. Ottenere cDNA umano Nrg1 e amplificare da un plasmide di donatore.
      Nota: Il cDNA umano Nrg1 era dotato da William Talbot presso la Stanford University.
      1. Estrarre i reagenti necessari e materiali, vale a dire mastermix (conservati a-20 ° C) PCR, primer (Vedi tabella 2) (conservati a-20 ° C), un piatto PCR (conservato a temperatura ambiente) e una pipetta 20 μL (conservato a temperatura ambiente). Vedere tabella materiali per esempio prodotti.
        figure-protocol-1
        Tabella 2: Iniettori per la clonazione umana di Nrg1 .
      2. Preparare il mastermix per ogni set in triplice copia utilizzando la pipetta 20 μL di primer. Per 1 set di triplici copie, utilizzare 37.5 μL del mastermix, 3 μL di acqua esente da DNA, 4,5 µ l di primer. Per altre triplici copie, basta moltiplicare per il numero di campioni.
      3. Diluire la soluzione di lavoro del cDNA umano Nrg1 (concentrazione di 20 ng / µ g) nella striscia di primer con acqua priva di DNA affinché ci sia 10 μL per pozzetto per campione totale.
        Nota: Garantire che ogni soluzione al punto 1.1.1 è distribuito uniformemente. Questo scopo, ogni soluzione di miscelazione pipettando su e giù. Per evitare la contaminazione incrociata, è possibile utilizzare una punta della pipetta per un solo campione.
      4. Aliquota del cDNA di Nrg1 con la pipetta multicanale 10 μL desiderata nei pozzetti della piastra di PCR.
      5. Aggiungere 14,5 μL del mastermix il cDNA nei pozzetti. Applicare una copertura appiccicosa alla piastra PCR per sigillare i pozzetti e inserire la macchina PCR.
      6. Avviare la macchina PCR e assicurare che il ciclo raggiunge temperature appropriate secondo gli enzimi e primer usati.
    2. Clonare il cDNA di Nrg1 in pCS2 il plasmide+ presso i siti di BamHI ed EcoRI usando gli enzimi in eccesso BamHI ed EcoRI affinché il cDNA è legato a tutti i plasmidi.
      1. Mescolare il cDNA di Nrg1 con il donatore plasmidi pCS2+, disponibili in commercio master mix soluzione e primer (tabella 2).
        Nota: Il volume di reazione totale dovrebbe essere 50 μL con 25 μL di mix master, 3 µ l di primer e 1 μL del plasmide di donatore ng/μL 20 con il cDNA di Nrg1 .
      2. Posizionare il mix dal passaggio 1.1.2.1 in macchina PCR e impostare i parametri per soddisfare le specifiche seguenti: 98 ° C per 10 s, 55 ° C per 5 o 15 s e 72 ° C per 5 s/kb.
      3. Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione seguendo le istruzioni del produttore. Eluire il prodotto in 50 µ l di tampone di eluizione.
      4. Digerire il prodotto PCR purificato e 5 μg di pCS2+ con BamHI ed EcoRI separatamente a 37 ° C per 2 h in un volume di reazione 200 μL. Purificare la digestione risultante con un kit commerciale ed eluire in 20 μL e 100 μL di Tris-HCl (pH 8.5), rispettivamente.
      5. Lega i 4 μL di cDNA Nrg1 e 2 μL del digerito pCS2+ plasmide in una reazione a 25 µ l con 1 μL di un catalizzatore di ligasi a 16 ° C durante la notte.
        Nota: La procedura può essere fermata qui per incubazione overnight.
      6. Utilizzare 2 μL della soluzione di legatura da passo 1.1.2.5 e trasformazione in 50 μL di cellule di batteri e. coli adatte per clonazione (Vedi Tabella materiali).
    3. Confermare che la trasformazione ha avuto luogo schermando che il cDNA di Nrg1 cloni usando la PCR. Scegliere a caso cloni e aggiungere ad una soluzione di primers specifici, della polimerasi e trifosfati dNTP (dNTP).
      Nota: I controlli erano il vettore (pCS2+) con e senza l'inserto (cDNA umano). Non sollevare troppo grande di una colonia perché batteri eccessiva possono inibire PCR.
      1. Scegliere 8 colonie dalla trasformazione e schermo pCS2+-Nrg1 cloni utilizzando i primer PCR da tabella 2.
      2. Cultura un clone con il cDNA di Nrg1 per isolare il pCS2+-DNA plasmidico di Nrg1. Inoculare con 100 μL di batteri e. coli con pCS2+-Nrg1 plasmide in 100 mL di LB media e cultura agitando (160-225 giri/min) a 37 ° C.
    4. Transfect pCS2 purificato+-Nrg1 plasmide in HEK-293 cellule in una piastra a 6 pozzetti utilizzando un reagente di transfezione commerciali seguendo le istruzioni del produttore.
    5. 24 ore dopo la trasfezione lisare le cellule utilizzando un buffer di lisi e correre attraverso un gel di SDS-PAGE, trasferimento ad una membrana di gel e quindi macchiare con anti-Nrg1 anticorpo22. Verificare l'espressione della proteina Nrg1 utilizzando un Western Blot.
      Nota: Il controllo è un vuoto pCS2+ plasmide. Può essere messo in pausa qui se gel membrana trasferimento si verifica durante la notte.
    6. Sintetizzare mRNA Nrg1 utilizzando un prodotto commerciale simile a quello nella Tabella materiali e seguire le istruzioni del produttore.
      1. Prendere 5 μL del pCS2+-DNA Nrg1 dalla cultura di batteri isolati e digerire con NotI in una reazione di 200 μL per 2 h a 37 ° C per linearizzare il plasmide.
      2. Purificare il plasmide linearizzato con un kit commerciale ed eluire in 20 μL di Tris-HCl (pH 8.5).
      3. Condurre la trascrizione in vitro con un kit di isolamento del RNA commerciale in una reazione di 20 μL usando 5 μL del plasmide linearizzato seguendo le istruzioni del produttore.
      4. Aggiungere che lo in vitro trascritto Nrg1 a 350 μL di tampone di lisi di RNA e poi purificare con un kit di isolamento del RNA. Eluire il RNA in 60 μL di Tris-HCl (pH 8.5).
      5. Misurare la concentrazione di RNA e conservare a-80 ° C per un uso futuro.
    7. Seguire i passaggi 1.1.6.1 - 1.1.6.5 sopra per il cDNA EPO e preparazione di mRNA ma clone cDNA nel plasmide pCS2 + EcoRI e XhoI siti invece.
  2. Iniettare Morpholino in zebrafish
    1. Progettazione23 le iniezioni MO utilizzando uno strumento online (Tabella materiali) contro la sequenza ATG di gata1a4 (5 ′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3 ') e tnnt2a5 (5 ′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3 ').
    2. Aggiungi gata1a e tnnt2a MO separatamente all'acqua privo di nucleasi per rendere le concentrazioni finali di 8 ng/nL e 4 ng/nL, rispettivamente. Ripetere con EPO mRNA con una concentrazione finale di 20 pg/nL. Assicurarsi che il volume finale è di 1 mL.
    3. Iniettare 1 nL di 8 ng/BN di gata1a MO e 1 nL di 4 ng/BN di tnnt2a MO negli embrioni di zebrafish separato al 1 alla fase 4 celle per ridurre la parete ventricolare shear stress (WSS)24. Per aumentare il WSS, iniettare 1 nL di 20 pg/nL di EPO mRNA6 negli embrioni di zebrafish nella fase 1 - 4 celle.
  3. Trattare chimicamente zebrafish per inibire trabeculation
    1. Utilizzando una pipetta 20 mL, diluire a 10 mg/mL AG1478 in 1% DMSO in E3 media ad una concentrazione finale di 5 μM a 30 hpf in una provetta da 15 mL. Come controllo, trattare ogni pesce con 1% DMSO solo.
    2. Aggiungi N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-butil estere (DAPT) in 1% DMSO (100 μM) E3 medio in una provetta da 15 mL per inibire la tacca di segnalazione alle 40 hpf in modo simile. Come controllo, trattare con solo 1% DMSO.

2. tecniche di imaging

  1. 4-D cardiaco LSFM Imaging con algoritmo di sincronizzazione
    1. Assumere 2-D immagini dell'embrione intero pesce più cardiaco battendo cicli utilizzando la procedura descritta qui sotto (Figura 1). Assicurarsi che lo spessore di luce-foglio è di circa 5 μm. Prendere 500 fotogrammi di x-y con un tempo di esposizione di 10 ms Set z-scansione a 1 μm per campionamento digitale senza perdita di dati secondo il principio di campionamento Nyquist25.
      1. Creare un gel di agarosio 1% (p/v) aggiungendo 1 g di agarosio a 100 mL e riscaldandola fino a tutti dell'agarosi sono dissolto. Caricare un piccolo tubo di plastica con l'embrione e l'agarosio utilizzando una pipetta 20 μL e fissarlo sul palco.
      2. Aprire l'immagine software di visualizzazione e fare clic su Live per vedere il live view del campione. Regolare l'obiettivo utilizzando la manopola in modo che il campione è a fuoco. Allo stesso modo, spostare il palco in modo che il live view del campione Mostra la parte superiore dell'embrione.
      3. Prendere immagini 500 volte per 5 s a 10 ingrandimenti utilizzando software26 del microscopio.
      4. Spostare la fase utilizzando il motore di un nuovo livello (1 μm nell'asse z) e ripetere la procedura di imaging.
      5. Ripetere 2 passaggi di cui sopra fino a quando l'intero cuore è completamente ripreso.
    2. Garantire l'integrità dei dati trascurando le immagini del primo e l'ultimo ciclo cardiaco. Trovare il periodo del ciclo cardiaco abbinando le immagini che sono state scattate dallo stesso punto di tempo del ciclo cardiaco, ma in periodi diversi. Utilizzare la seguente equazione che è stata sviluppata per individuare il periodo:
      figure-protocol-2(1)
      dove D è la funzione di costo utilizzata per il montaggio di un'ipotesi di periodo, hom l'immagine catturata, τ' il tempo che l'immagine è stata catturata, zk l'indice z-senso dell'immagine, xm è la vettore dell'indice pixel, e T' è l'ipotesi di periodico.
    3. Utilizzare la seguente equazione per trovare lo spostamento relativo tra due immagini in fasi simili:
      figure-protocol-3(2)
      dove Qk', k denota una funzione di costo per lo spostamento relativo, R è il quartiere spaziale possibile, L è il tempo totale di acquisizione dell'immagine, x è il pixel indice, zk e zk' sono le fette di primo e secondo in direzione z, t è il tempo, e s è l'ipotesi di spostamento relativo.
    4. Convertire lo spostamento relativo spostamento assoluto per quanto riguarda la prima immagine e risolvere l'equazione lineare utilizzando l'approccio pseudo-inversa, per trovare la relazione assoluta per allineare la sezione successiva delle immagini come descritto in precedenza27.
    5. Le immagini finali di 4-D sono state elaborate utilizzando software di elaborazione immagine (Tabella materiali).
      1. Sovrapposizione immagini 2D in 3D
        1. Aprire una software di elaborazione di immagine commerciale.
        2. Fare clic su Open Data.
        3. Selezionare tutte le immagini per essere impilati in 3-d > clic carico.
        4. Aggiungere la dimensione del voxel di 0,65 x 0,65 x 1 > fare clic su OK.
        5. Fare clic sulla casella Visualizza immagini per visualizzare l'immagine 3D.
        6. Pulsante destro del mouse la casella blu slice_1.tiff > selezionare Visualizza > selezionare Volren.
        7. Fare clic su modifica > seleziona Opzioni > seleziona modifica Colormap.
        8. Regolare il colore utilizzando le caselle delineate in rosso > fare clic su OK.
      2. Conversione 3D 4D
        1. Fare clic su "File > Apri dati di serie temporali.
        2. Selezionare il file TIFF 3D che sono stati appena fatto > clic carico.
        3. Immettere la stessa dimensione del voxel come prima.
        4. A destra fare clic sulla casella blu slice_1.tiff > selezionare "Display" > selezionare Volren.
        5. Fare clic su modifica > seleziona Opzioni > seleziona modifica Colormap. Regolare il colore utilizzando le caselle > fare clic su OK.
        6. Fare clic destro Tempo serie controllo > clic su Movie maker > Premere il tasto Play per guardare il film.
        7. Aggiungere un nome file, grandezza, frequenza fotogrammi, qualità uguale a 1, digitare monoscopiche > fare clic su applica
        8. Esportare il video. Aprire il video in un software appropriato.

3. analisi qRT-PCR

  1. Zebrafish isolamento del RNA per quantificare i ligandi di Notch, recettori, del cuore e le espressioni dei geni di destinazione
    1. Sacrificare la zebrafish sottoponendole ad un sovradosaggio di tricaina metilato28,29. Usando un protocollo descritto in precedenza30, i cuori di zebrafish erano asportati e preparati per isolamento del RNA.
    2. il RNA totale di isolare e sintetizzare il cDNA utilizzando il kit di sintesi cDNA seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Gli iniettori PCR di design per i ligandi di tacca Jag1, Jag2, Dll4, recettore Notch1be segnalazione relativi geni Nrg1 ed ErbB2. Vedere tabella 3 per i primers che abbiamo usato.
    4. Aggiungere i primer dal punto 3.1.3, il mRNA isolato dal passaggio 3.1.2 e una commerciale mastermix alla piastra PCR. Eseguire la qRT-PCR al condizioni adeguate di temperatura e tempi secondo gli enzimi utilizzati. Normalizzare i risultati di zebrafish α-actina.
      Nota: Questo calcolerà i livelli di espressione per ciascuno dei ligandi, i recettori e geni.

4. in vitro delle cellule endoteliali aortica umana (HAEC) esperimenti

  1. Modello dinamico sollecitazione di taglio
    1. Cellule di HAEC cultura con HAEC cultura media. Una volta completamente confluenti, esporre le cellule di flusso laminare e flusso pulsatile di 23 x 10-5 N al tasso di 1 Hz per 24 h.
      1. Scaldare CE media/DMEM 10% FBS in un'acqua bagno per 20 min.
      2. Recuperare le cellule HAEC dal serbatoio di azoto liquido e posizionare la cuvetta nel bagno di acqua fino a quando sciolto.
      3. Utilizzando una pipetta μL 1.000, rimuovere le cellule scongelate e metterli in una provetta da 15 mL con 3-5 mL di media. Centrifugare la soluzione di cella a 53 x g per 3 min.
      4. Aspirare la soluzione fuori e aggiungere abbastanza media per un volume totale di 10 mL. Aggiungere la soluzione di cella un matraccio T75 sterile, la boccetta di cap e distribuire le cellule in modo uniforme sul fondo della piastra.
      5. Contrassegnare il matraccio con iniziali, data, tipo di cella e numero di passaggio. Incubare la beuta a 37 ° C, 5% CO2, fino a quando le cellule sono 80% confluenti. Ricordatevi di cambiare i media ogni 2-3 giorni.
      6. Utilizzando una pompa commerciale, collegare il tubo al pallone e impostare i parametri di cui sopra nel punto 4.1.131,32,33.
    2. Aggiungere GI254023X a 50 mL di terreno di HAEC ad una concentrazione finale di 5 μM per 30 min.
    3. Con il pre-misti GI254023X, un inibitore di ADAM10 che sopprime la tacca di segnalazione, condurre la stessa a flusso laminare o esperimenti di flusso pulsatile come in 4.1.1.
    4. Quantificare la tacca ligandi (Jag1, Jag2 e Dll4) e geni bersaglio tacca (pelosi e rinforzatore di Spalato [Hes]) mediante qRT-PCR per quattro gruppi di campioni HAEC (flusso laminare, flusso laminare + GI254023X, flusso pulsatile, flusso pulsatile + GI254023X) descritta precedentemente32.

5. salvataggio e sovra-espressione di tacca di segnalazione

  1. Iniettare 1 nL del mRNA Nrg1 preparato ad una concentrazione di 5 pg/nL (dal punto 1.1.6) nella fase 1-4 celle con gata1a MO al fine dei overexpress tacca destinazione geni24.
  2. Iniettare 1 nL del mRNA Nrg1 in wea mutante in un simile modo24.
  3. Doppio della concentrazione di Nrg1 mRNA (10 pg/nL) e iniettare24 1 nL in zebrafish per osservare la morfologia ventricolare.
  4. Iniettare 1 nL di 20 pg/BN di EPO mRNA6 negli embrioni di zebrafish nella fase 1-4 celle per aumentare l'ematopoiesi per aumentare ventricolare WSS come precedentemente illustrato24.
  5. Iniettare 1 nL della 50 μM isoproterenolo7, che aumenta il tasso di contrattilità, al mezzo di E3 per 24 h mentre zebrafish sono coltivate come illustrato in precedenza24.
  6. Eseguire imaging LSFM 4-D per ogni gruppo. Seguire le istruzioni nella procedura 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. quantificazione del cambiamento frazionario accorciamento e volume nel tempo

  1. Eseguire imaging LSFM 4-D per ciascun gruppo a 50, 75 e 100 hpf. Seguire le istruzioni nella procedura 2.1.1-2.1.5.2.8. Dividere ogni immagine così ognuno ha 600 nodi per la replica di movimento della parete cardiaca.
  2. Misurare la variazione di diametro del ventricolo durante la diastole e sistole utilizzando la seguente formula:
    figure-protocol-4(3)
    Caricare immagini 3D ventricolare a ogni 0,1 s con software di visualizzazione e misura il volume.
  3. Tracciare la variazione di volume nel tempo per ogni gruppo sperimentale a 75 hpf e 100 hpf.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM è stato usato in questo manoscritto al fine di acquisire immagini 2D e 3D ad alta risoluzione. Come visto in Figura 1A e 1B, la lente di illuminazione dirige il foglio leggero al campione. A causa della magrezza del foglio luce, solo un unico piano è illuminato. La lente di rilevamento viene posizionata perpendicolarmente alla lente illuminazione e si concentra sul piano illuminato (Figura 1B). Il foglio leg...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo protocollo, abbiamo dimostrato che imaging 4D può essere utilizzato per monitorare lo sviluppo di una rete trabecolare in risposta ai cambiamenti nelle forze biomeccaniche. In particolare, la sollecitazione di taglio con esperienza dalle cellule endoteliali avvia la tacca di segnalazione cascade, che a sua volta promuove trabeculation. In questo manoscritto, abbiamo indicato che (1) gata1a MO iniezione ha ridotto l'ematopoiesi e pertanto ridotta sollecitazione di taglio della parete, (2) tnnt2a

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori vorrebbero esprimere gratitudine a William Talbot presso la Stanford University per fornire l'essere umano Nrg1 cDNA e di Deborah Yelon da UCSD per fornire la WEA mutanti. Gli autori piacerebbe anche ringraziare Cynthia Chen per aiutare con l'acquisizione di immagini. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH HL118650 (a T.K. Hsiai), HL083015 (a T.K. Hsiai), HD069305 (per Chi N.C. e T.K. Hsiai.), HL111437 (per T.K. Hsiai e Chi N.C.), HL129727 (a T.K. Hsiai), T32HL007895 (a R.R. Sevag Packard), HL 134613 (da V. Messerschmidt) e Università del Texas sistema stelle fondi (di J. Lee).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Clontech Hifi PCR pre-mix Takara 639298PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNADono di William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USAN/AUtilizzato per il salvataggio in trabecolazione
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Sistema di rilevamento PCR in tempo realeBio-Rad1855201PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+GE HealthPlasmide utilizzato per sintetizzare mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Kit di purificazione Nucleospin...  Clontech740609.25Purificazione del DNA
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligasi Clontech2011APCR Soluzione di legatura
1.1.2.5
Cellule competenti stellariClontech636763E. coli cellule utilizzate per la trasformazione
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Reagente di trasfezione
1.1.4
mMessage SP6 kitInvitrogenAM1340Kit utilizzato per sintetizzare mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820purifica l'RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8GeneToolsN/ASoftware per la progettazione di primer
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNACreative BiogeneCDFH006026aumenta WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478Sigma-Aldrich T4182ErbB inibitore
1.3.1
E3 mediumPer far crescere embrioni
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPTSigma-Aldrich D5942γ-inibitore della secretasi
1.3.2
Agarosio Sigma-Aldrich A9539Utilizzato per il montaggio di embrioni
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT  Fotocamera CMOS digitaleHamamatsu PhotonicsC11440-42UUtilizzato per acquisire immagini
2.1.1.2, 2.1.1.3
Software Amira SoftwareFEIN/AImmagini visualizzate e analizzate in 3D e 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesilato Sigma-Aldrich 886-86-2Utilizzato per sedare o sacrificare umanamente embrioni
3.1.1
Kit di sintesi iScript cDNABio-Rad1708890sintetizza cDNA
3.1.2
Microcentrifuga Eppendorf 5424 MicrocentrifugaEppendorf05-400-005
4.1.1.3
GI254023XSigma-Aldrich 260264-93-5Inibitore di ADAM10
4.1.2, 4.1.3 
Cloridrato di isoprenalinaSigma-AldrichI5627L'isoproterenolo aumenta WSS
5.1.5
MATLABMathworksN/AAnalisi della meccanica cardiaca

Riferimenti

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Errata corrige

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Tag

Light sheet Fluorescence MicroscopyZebrafish HeartShear StressTrabeculationNotch Signaling4D ImagingGata1a MorpholinoNrg1 mRNATnnt2a MorpholinoHemodynamic Forces

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