Zebrafish sono un naturale Vibrio cholerae host e può essere utilizzato per riassumere e studiare l'intero ciclo infettivo dalla colonizzazione alla trasmissione. Qui, dimostriamo come valutare i livelli di colonizzazione di V. cholerae e quantificare la diarrea in zebrafish.
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Articolo metodologico
Quantificare la colonizzazione di Vibrio cholerae e diarrea nel modello Zebrafish adulto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Vibrio cholerae è meglio conosciuto come l'agente infettivo che causa il colera malattia umana. All'esterno l'ospite umano, V. cholerae esiste principalmente per l'ambiente acquatico, dove interagisce con una varietà di specie acquatiche superiori. Pesci vertebrati sono noti per essere un host ambientale e sono un potenziale serbatoio di V. cholerae in natura. V. cholerae e le specie di pesci teleostei Danio rerio, comunemente note come zebrafish, hanno origine dal subcontinente indiano, suggerendo una lunga interazione in ambienti acquatici. Zebrafish sono un organismo modello ideale per studiare molti aspetti della biologia, tra cui le malattie infettive. Zebrafish può essere facilmente e rapidamente colonizzato da V. cholerae dopo l'esposizione in acqua. Colonizzazione intestinale da V. cholerae conduce alla produzione di diarrea e l'escrezione di replicata V. cholerae. Questi escreti batteri possono quindi andare a colonizzare nuovi host di pesce. Qui, dimostriamo come valutare V. cholerae-colonizzazione intestinale in zebrafish e come quantificare V. cholerae-indotto diarrea di zebrafish. Il modello di colonizzazione dovrebbe essere utile per i ricercatori che stanno studiando se geni di interesse possono essere importanti per la colonizzazione di host e/o per la sopravvivenza dell'ambiente. La quantificazione di zebrafish diarrea dovrebbe essere utile ai ricercatori di studiare qualsiasi agente patogeno intestinale che sono interessati ad esplorare zebrafish come sistema modello.
Introduzione
Vibrio cholerae è un batterio gram-negativo, acquatico che causa il colera malattia umana così come diarrea sporadica1,2. V. cholerae è trovato nell'ambiente in molte aree del globo, spesso associato con altri organismi acquatici. Questi organismi associazione includono plancton, ovature di insetti, crostacei e pesci vertebrati specie3,4,5,6,7. Parecchi studi hanno isolato V. cholerae da tratti intestinali di pesce in dive....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Wayne State University. Questo metodo è stato descritto in Runft et al. 12
1. determinazione dei livelli di colonizzazione intestinale
Nota: Colonizzazione intestinale è la metrica più utile nel modello zebrafish come può essere utilizzato per confrontare la relativa idoneità dei vari ceppi di V. cholerae o gli effetti di mutazioni o di knockout del gene.
- Inoculazione di zebrafish per immersione
Nota: Questo mezzo di esposizione è sim....
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Risultati
V. cholerae colonizzazione dei tratti intestinali zebrafish
Per fornire un esempio dei livelli tipici colonizzazione che osserviamo, abbiamo inoculato 5 x 106 CFU di EL Tor V. cholerae ceppo pandemico N16961 in 200 mL di acqua in un becher contenente diversi zebrafish. Dopo 6 h di infezione, il pesce sono stato lavato in acqua dolce e trasferito in un becher di 200 mL di acqua in autoclave infezione com.......
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Discussione
Zebrafish è un relativamente nuovo modello per lo studio di V. cholerae ma molto promettente per la scoperta di futura aspetti inediti di V. cholerae biologia e patogenesi11,12,13 . Il modello di zebrafish adulto ha i vantaggi di essere sia un naturale V. cholerae host che contiene il microbiota intestinale intatto, maturo e un modello dell'ambiente. Svantaggi del modello sono che i due fattori di viru.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Grazie alla melodia Neely, Jon Allen, Basilea Abuaita e Donna Runft per il loro impegno nel contribuire a sviluppare il modello di zebrafish. La ricerca segnalata qui è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive dei National Institutes of Health, sotto numeri del premio R21AI095520 e R01AI127390 (per Jeffrey H. Withey). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Instrument | |||
| Incubatore con agitatore | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Incubatore Excella E25 | |
| NUAIRE, Plymouth, MN | Spettrofotometro a flusso | ||
| Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | ||
| Omogeneizzatore a vortice | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Bilancia | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Contatore di colonie automatizzato | con | ||
| Materiali | |||
| coperchi perforati Supporto per | micropunte con fori dalla scatola | ||
| cucchiai di plastica usa e getta Office | Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Sistema di acquari | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Depuratore d'acqua | Aqua FX | TK001 | |
| Rete da pesca | Cibo per | ||
| Pinna tetra | |||
| Salamoia Gamberetti | Red jungle marca | O.S.I. pro 80 | |
| Pannello | |||
| Perni | |||
| Bisturi | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Pinze | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Forbici Vannas | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| Provette con tappo a vite da 2 ml | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| Perle di vetro da 1 mm Bio | Spec | 11079110 | |
| Perle di vetro per la diffusione | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Piastra di Petri | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| Provetta da centrifuga da 1,5 ml | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| Provetta da centrifuga da 50 ml | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Provette | Pipetta in vetro Pyrex | 9820 | |
| Fisher | Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipette | Sartorius Biohit, Gö ttingen, Germania | m1000/m200/m20 | |
| Punte | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Sali oceanici | |||
| soluzione salina tamponata con fosfato | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaina (etile 3-amminobenzoato metansolfonato sale | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff' s reagente | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| acido periodico | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucina dallo stomaco suino | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Albumina sierica bovina | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay | Reagent Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medio | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
Riferimenti
- Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
- Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (201....
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Ristampe e permessi
