Rilevazione degli anticorpi che neutralizzano l'assorbimento cellulare di terapie di sostituzione enzimatica con un'analisi Cell-based

Valutazione di immunogenicità è una parte importante della sicurezza e dell'efficacia di monitoraggio programma per qualsiasi prodotto terapeutico biologico, compresi ERTs. I pazienti possono sviluppare una risposta immunitaria che possono influire direttamente sulla sicurezza dei farmaci, efficacia e farmacocinetica/farmacodinamica profili. Un sottoinsieme di questi ADA, chiamato Navarro, può inibire l'efficacia ERT in due modi: attraverso l'inibizione dell'assorbimento ERT nella cella mirata o inibendo l'attività catalitica di ERT. Il metodo presentato qui è progettato per misurare NAbs che interferiscono con l'assorbimento ERT nelle cellule. Per controllare completamente la sicurezza e l'efficacia di ERT terapeutica, monitoraggio continuo di Nefertari è cruciale nel delucidamento eventuali potenziali correlazioni con i risultati clinici o effetti farmacodinamici¹.

Piattaforme di valutazione NAbs contro terapie proteiche includono attività enzimatica, basati su cellule e ligand-legantesi saggi¹. La piattaforma di analisi ottimale viene selezionata in base a una serie di criteri: il meccanismo di azione del prodotto terapeutico, la sensibilità di piattaforma di analisi, selettività, precisione e soprattutto, sua capacità di imitare l'azione inibitoria del NAbs in vivo . Ligand-legantesi saggi possono essere opportuno in alcuni casi (ad esempio, quando una riga di celle rilevanti non può essere identificata o se la sensibilità appropriata non può essere raggiunto in un'analisi basata su celle). Tuttavia, nel draft 2016 linee guida FDA per industria documento e altri white paper accettati dal settore, basati su cellule NAb saggi sono raccomandati perché essi possono meglio riflettere il meccanismo biologico del farmaco in vivo^{1,2 , 3}.

I componenti critici per lo sviluppo di un'analisi di NAb basati su celle di flusso cytometry includono una linea cellulare adeguata che risponde alla stimolazione di droga, un surrogato positiva-controllo NAb che neutralizza l'ERT, un fluoroforo-coniugato ERT e la specie in esame biologica matrice^4,5,6. La selezione di riga della cella è dipenda sul meccanismo di azione ERT e linee cellulari multiple devono essere valutate nel corso del test sviluppo³. Nel metodo descritto qui, le cellule di T di Jurkat umane sono state selezionate per la loro espressione endogena di CI-M6PR sulla superficie delle cellule e la mancanza di recettori di frammento di anticorpo (FCR) che legano indiscriminatamente la regione Fc di più anticorpi^7,8 . Durante lo sviluppo di analisi, è importante stabilire un controllo negativo per gli studi di convalida e campione di prova, come siero riunito da individui che non sono stati trattati con la prova articolo¹. Linee cellulari dovrebbero anche tollerare pertinenti matrici da specie diverse per la continuità tra le fasi non clinici, cliniche e dopo la commercializzazione del farmaco sviluppo¹. Un altro componente è la selezione del controllo positivo del dosaggio. Il controllo positivo per l'analisi di assorbimento delle cellule ERT è stato scelto in base alla sua capacità di legare il terapeutico e neutralizzare l'assorbimento attraverso CI-M6PR^9,1. Spesso è difficile ottenere gli importi utili o sostenibili di antisieri neutralizzanti da soggetti umani per uso come un controllo di dosaggio, soprattutto in popolazioni di pazienti di malattia rara². Alternative includono antisieri da animali immunizzati iper o purificato per affinità policlonali o monoclonali anticorpi a spillo nel dosaggio pertinenti matrice¹. Durante l'utilizzo di una matrice specie-specifica, è possibile che fattori inibitori diversi anticorpi presenti nella matrice possono inibire l'assorbimento ERT. Un altro componente fondamentale del dosaggio è la ERT fluorophore-coniugati. La selezione del fluoroforo per la coniugazione di ERT dovrebbe essere valutata per ogni ERT, basato sul bisogno del dosaggio per luminosità, stabilità del pH e potenziale sovrapposizione spettrale in altri canali sul citofluorimetro.

Il test descritto qui è un esempio per la misurazione di un NAb a proteina terapeutica, ad esempio un ERT, che entra la cella via CI-M6PR. ERTs diversi, destinati a trattare i disordini da accumulo lisosomiale (LSD), utilizzare questo percorso per uptake cellulare e lisosomiale targeting, tra cui alfa elosulfase per la sindrome di Morquio A, cerliponase alfa per la malattia di Batten CLN2, agalsidasi alfa per la malattia di Fabry, e alglucosidasi alfa per Pompe malattia^10,11. Lo scopo di questo metodo è quello di misurare i livelli relativi di Nefertari che interferiscono con la droga associazione e interiorizzazione via CI-M6PR. Questa operazione viene eseguita su più livelli dello screening, conferma, e titolo i passi³. Campioni sono proiettati per NAb positività e poi confermati positivi nel passaggio conferma. Infine, campioni che dello schermo e la confermano positiva possono essere diluiti in serie per generare un anticorpo titolo¹. Questa analisi di assorbimento del farmaco citometria a flusso basati su cellule fornisce un metodo sensibile e meccanicistico pertinenti in vitro di misurazione NAbs sostanze specifiche che possono influenzare il profilo farmacologico di un farmaco. Abbiamo tradotto il metodo validato e testato campioni clinici utilizzando questa piattaforma per il farmaco elosulfase alfa⁸. Qui descriviamo il protocollo dettagliato passo-passo che può essere applicato ad altre proteine terapeutiche o ERTs.

Matrici umani sono stati acquistati da fonti commerciali con approvazione da loro Institutional Review Board (IRB) ma devono essere trattati come potenzialmente infettivi. Assicurarsi che l'ambiente di laboratorio utilizzato mantiene una cultura di sicurezza¹².

1. prima di iniziare l'analisi

1. Preparare la streptavidina coniugata ERT biglie magnetiche secondo istruzioni^{13 del produttore}.
2. Preparare i campioni per il controllo qualità (QCs): spike un anticorpo di controllo positivo (PC) (ad es., un NAb) nella matrice specie-specifico (ad es., pool CSF o siero).
   Nota: Guida FDA ed EMA consiglia di preparare un alto e un basso QC per la validazione di test e test^1,14di routine.
   1. Ad esempio, per ottenere un QC a 10 µ g/mL, aggiungere 10 µ l di controllo positivo dello stock di 1 mg/mL in 990 µ l della matrice pertinente (ad es., CSF) per un volume totale di 1.000 µ l.
   2. Aliquotare i campioni QC in un volume adatto per un singolo utilizzano (ad esempio, 50 µ l) e congelare le aliquote a -60 a-80 ° C¹.
   3. Aliquotare un taglio-punto-controllo (CC), specie-matrice non trattati con l'articolo di prova (ad esempio, in pool CSF o siero) per un singolo utilizzo (ad es., 50 µ l) e congelare le aliquote a -60 a-80 ° C¹.
3. Eseguire una reazione di coniugazione tra il fluoroforo ed ERT utilizzando un contrassegno della proteina kit secondo protocollo^{15 del produttore}. Aliquotare il campione in un volume adatto per un singolo utilizzare (ad esempio, 50 µ l) e congelare le aliquote a -60 a-80 ° C.

2. giorno 1: Cella placcatura e preparazione del campione

1. Preparazione delle cellule
   1. Utilizzare una cappa di coltura del tessuto e mantenere un ambiente asettico per le fasi successive. Spruzzare ogni oggetto che verrà inserito nella cappa con etanolo al 70% e manutenzione un ambiente pulito^16,17,18.
   2. Riscaldare il medium di crescita cellulare (ad es., RPMI-1640 con 10% fetale bovino del siero e l'1% penicillina-streptomicina) in un bagno di acqua o perlina a 37 ° C¹⁹.
   3. Cellule di Jurkat linfociti totali T umani e piastra 100 µ l per pozzetto a 7,5 x 10⁵ cellule/mL in un turno di 96 pozzetti-fondo cella piastra di coltura appropriato per l'utilizzo su un citometro a flusso dotato di un caricatore di piastra.
      1. Ad esempio, utilizzare un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato per contare le celle^20,21.
      2. Garantire che le cellule hanno almeno il 70% redditività prima di procedere con l'esperimento (ad esempio, valutare la vitalità con la macchiatura blu di trypan)¹⁷.
   4. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO₂ e 95% di umidità durante la notte per 14 – 20 h.
2. Preparazione del campione di screening
   1. Diluire il soggetto o l'analisi di campioni di controllo utilizzando mezzi di comunicazione privo di siero (ad es., RPMI-1640). Nel metodo di esempio qui, diluire i campioni 1: 2,5 in RPMI-1640 aggiungendo 60 µ l del campione a 90 µ l di terreni privi di siero. (ad es., striscia di 8 tubi). Procedere al punto 3.1 per la procedura di dosaggio preparare un fluoroforo ERT.
      Nota: La diluizione di 1: 2.5 è stata determinata sperimentalmente ed è ottima per il metodo presentato qui. Diluizioni del campione ottimale devono essere determinate per ogni metodo che si è sviluppato.
3. Conferma della perla e preparazione di campioni
   1. Calcolare il numero di perline ERT-coniugato necessaria per i campioni di conferma.
      1. Per esempio, per 10 campioni, utilizzare 10 campioni x 100 µ l di coniugato ERT perline per esempio + 30% extra per compensare eventuali perdite durante la fase di lavaggio = 1.300 µ l di coniugato ERT perline.
   2. Vortice le perline accuratamente. Aggiungere il numero calcolato di perline di una provetta conica da 15 mL per il lavaggio.
   3. Lavare i branelli magnetici ERT-coniugati aggiungendo 1.300 µ l di tampone di accoppiamento o come suggerito dal produttore (ad es., con tampone fosfato salino con 0,1% polisorbato 20) seguendo i passi qui sotto¹³.
   4. Vortice del tubo accuratamente. Posizionare il tubo in una cremagliera del tubo magnetico per 2 min. Senza disturbare le perline, attentamente aspirare e scartare il surnatante.
      Nota: La soluzione si trasformerà da marrone scuro a chiaro quando perline sono tirati dal magnete.
   5. Risospendere le perline con 1.300 µ l di tampone di accoppiamento. Ripetere i passaggi di lavaggio per un totale di quattro lavaggi.
   6. Dopo il lavaggio finale, è necessario sospendere le perline in 1.300 µ l di tampone (calcolati in precedenza nel passaggio 2.3.1.1) di accoppiamento. Aggiungere 100 µ l per bene a 96 pozzetti, bianca, rotonda-parte inferiore, il piatto in polipropilene vincolanti secondo la mappa di piastra (per esempio, una conferma, anche a campione o QC; la volontà di campione suddiviso in duplicati quando incubati con ERT fluoroforo).
   7. Collocare la piastra su un magnete di lato-minigonna di 96 pozzetti e consentire le perline formare una pallina. Attentamente, aspirare il supernatante chiaro ed eliminarlo.
      Nota: La soluzione diventerà da scuro al marrone chiaro dopo circa 1 – 2 min sul magnete Minigonna laterale. Le perle ottenute sono chiamate le perle "a secco".
   8. Se i campioni sottoposti a screening positivi e sono sia confermati, aggiungere 100 µ l di ciascun campione con e senza perle ERT-coniugati in caso/assegnate. Sigillare la piastra con una pellicola di plastica e agitare per almeno 60 minuti su un agitatore rotante a circa 800 giri/min a temperatura ambiente (TA).
      Nota: Precedentemente preparato e congelato positivi e negativi QCs e la CC devono essere inclusi in ogni piatto.
   9. Dopo l'incubazione, posizionare la piastra conferma sul magnete minigonna lato 96 pozzetti e consentire le perline formare una pallina.
4. Preparazione di titolo diluizione serie
   1. Per preparare una serie di titolo, in serie di diluire il campione nella matrice riunito un numero sufficiente di volte per attraversare il titolo predeterminato taglio punto¹.
   2. Per esempio, mix 30 µ l del campione a 60 µ l di matrice aggregata in una serie di diluizione di 1:3 per un totale di 8 diluizioni (ad es., striscia di 8 tubi). Procedere al punto 3.1 per la procedura di dosaggio preparare fluoroforo ERT.

3. giorno 1: Procedura di dosaggio

1. Preparare il fluoroforo ERT nel medium privo di siero (ad es., 60 µ l per pozzetto, o circa 6 mL/piastra).
   1. Ad esempio, per preparare 10 mL di 1 µ g/mL fluoroforo ERT, aggiungere 10 µ l di 1 mg/mL stock fluoroforo ERT a 9,99 mL di siero-free media (ad es., RPMI-1640).
2. In un'incubazione di nuova piastra (ad es., lastra in polipropilene 96 pozzetti, bianco, fondo tondo, non vincolante), aggiungere i campioni preparati da passo 2.2, 2.3, o 2.4 e un fluoroforo ERT in una miscela 1:1 in pozzetti duplicati (ad es., trasferimento 60 µ l di ogni preparato campione e aggiungere 60 µ l della ERT fluoroforo per pozzetto).
   Nota: Un esempio di mappatura per piastra esperimento è fornito nella Figura 1.

Figura 1: esempio di esperimento piastra layout. Campioni e un fluoroforo ERT sono state incubate overnight a 2 – 8 ° C. Controlli quali controllo di alta qualità (HQC), bassa qualità (LQC) e controllo di qualità negativo (NQC) sono stati proiettati e confermati su angoli opposti della piastra per valutare l'uniformità di piastra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Mescolare i campioni e il fluoroforo ERT pipettando su e giù più volte con una pipetta multicanale. Avvolgere le piastre nell'estruso e incubare per loro una notte a 2 – 8 ° C per 14 – 20 h.

4. giorno 2: Aggiungere i campioni preparati alle cellule

1. Rimuovere le piastre di incubazione del campione dall'incubazione a 2 – 8 ° C e riscaldare le piastre inserendoli in un bagno di perle a 37 ° C per 10 – 15 min.
2. Rimuovere le celle dall'incubatrice di CO₂ . Effettuare un controllo visivo delle cellule placcate utilizzando un microscopio invertito per assicurare che le cellule appaiono sani e uniformemente distribuito attraverso i pozzi^17,19.
3. Aggiungere 100 µ l dei campioni precedentemente misti ed ERT fluoroforo ad una piastra di cella secondo la mappa di piastra sperimentale.
4. Inserire nuovamente la piastra delle cellule con i campioni aggiunto CO₂ incubatore a 37 ° C. Incubare la piastra per 3 h e ± 15 min.
   Nota: Questa volta nasce in laboratorio come ottimale per la risposta di segnale-rumore nel dosaggio.
5. Centrifugare la piastra di cella per 6 min a 320 x g in una centrifuga da tavolo 14 – 18 ° c. Confermare la presenza di un pellet cellulare in fondo i pozzetti della piastra.
6. Tenere la piastra ad un angolo di 30 – 45°. Rimuovere attentamente il surnatante da ogni pozzetto senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere 200 µ l di 1 x DPBS sul pellet cellulare in ogni pozzetto per risospendere le cellule.
7. Ripetere la cella fasi per un totale di 3 lavaggi di lavaggio. Procedere immediatamente al passaggio 5 per la macchiatura di attuabilità delle cellule.

5. giorno 2: Cella vitalità colorazione

1. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 µ l di una soluzione di lavoro di macchia Live/Dead: 1x in ciascun pozzetto, selezionato per una lunghezza d'onda di emissione diversa da quella della ERT fluoroforo e preparati secondo istruzioni^{22 del produttore}.
2. Incubare la piastra per 15 min a RT nel buio. Centrifugare la piastra per 6 min a 320 x g in una centrifuga da tavolo 14 – 18 ° c.
3. Rimuovere attentamente il surnatante da ogni pozzetto senza disturbare il pellet cellulare. Lavare le cellule 1 x con 1 x DPBS.

6. giorno 2: Fissaggio delle cellule con paraformaldeide 1%

1. Usando una pipetta multicanale, dispensare 100 µ l di refrigerati (a 2 – 8 ° C) 1% paraformaldeide (PFA) in ciascun pozzetto.
2. Sigillare le piastre e delicatamente impulso vortice per miscelare. Avvolgere la piastra il cartoccio e posizionarlo a 2 – 8 ° C per almeno 10 minuti per consentire la fissazione.
   Nota: Fare attenzione per evitare gli schizzi sulla guarnizione del piatto.
3. Aggiungere 50 µ l di 1 x DPBS in ogni pozzetto usando una pipetta multicanale su e giù prima dell'analisi.

7. flusso Cytometry

1. Posizionare le piastre sul citofluorimetro con il caricatore di piastra e di eseguirli.
2. Acquisire e registrare l'intensità della fluorescenza mediano misurato (MFI) utilizzando il software di citometria a flusso (Vedi Tabella materiali).
   Nota: Vedere la Figura 2 come esempio per le impostazioni del caricatore. La portata del campione, volume di campione, volume, velocità di miscelazione e numero di miscele di miscelazione sono ottimizzati per questo test. Questi criteri possono essere regolati utilizzando i tasti "frecce up" o "giù" accanto ai numeri per ciascun criterio, a seconda del flusso cytometry acquisizione software²³.

Figura 2: esempio delle impostazioni caricatore citometro a flusso. Le impostazioni del caricatore devono essere ottimizzate per ogni analisi che si sono sviluppato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Creare un citometro analisi/cancelli/trame come mostrato nella Figura 3.
   Nota: La creazione del cancello e l'applicazione può variare per ogni flusso cytometry software²³.

Figura 3: flusso cytometry strategia di gating. Cellule Jurkat sono state separate dagli eventi totali e raccolti tracciando i forward-scatter (FSC) vs side scatter (SSC) canali e disegnando un cancello intorno alla popolazione di destinazione. Canottiere (cellule singole) sono stati separati da doppietti o cellula più grande aggrega utilizzando l'area FSC (FSC-A) e FSC (FSC-altezza) canali. Cellule vive sono stati scelti da gating sulle cellule di singoletto negative per una macchia di attuabilità. L'intensità di fluorescenza media (MFI) è stata misurata in cellule Jurkat unica, vivere e viene tracciata come un istogramma. I valori MFI delle celle con l'assorbimento di droga bloccato (ad es., HQC) e delle cellule con controllo vengono visualizzati valori di assorbimento (rosso e blu, rispettivamente). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Escludere le cellule morte dall'analisi e registrare circa 10.000 eventi²³.

8. analisi dei dati

1. Esportare i dati (crudo MFI) per il software di analisi (Vedi Tabella materiali).
   Nota: A seconda l'analisi necessaria, la seguente analisi di dati può essere eseguita utilizzando software di analisi.
2. Calcolare la media delle IFM di pozzetti duplicati (QCs e campioni) e il coefficiente di variazione (% CV) per valutare la variabilità di diffusione dei duplicati dalla media.
   
   
   
3. Per campioni e QCs che sono stati proiettati nell'analisi, calcolare la percentuale di segnale di inibizione (% SI) rispetto la media MFI della per la matrice aggregata di QCs CC.
   
4. Se necessario, è possibile calcolare i rapporti di recupero (RRs) per il QCs e i campioni riguardante i corrispondenti valori di schermo confermato.
   

Il primo giorno del metodo, un'aliquota congelata di cellule Jurkat è stata scongelata e placcata, e sono stati preparati i campioni di prova. La figura 1 Mostra un esempio di mappatura per piastra. Il secondo giorno, i campioni sono stati mescolati con le cellule Jurkat e incubati a 37 ° C per circa 3 h e 15 min. Le cellule sono state poi lavate, fisso con PFA e analizzate su un citometro a flusso. La figura 2 Mostra esempio di flusso cytometer impostazioni.

Il flusso cytometry gating strategia è stato progettato per misurare la quantità di farmaco fluorophore-coniugati in diretta singolo Jurkat cells24 (Figura 3). Le cellule sono state separate dai detriti disegnando un cancello che esclude i detriti cellulari [solito, bassa dispersione avanti (FSC)] e le cellule morte [solitamente, high-side scatter (SSC)], lasciando solo le cellule vive per analisi25. Cellule singole sono stati quindi separate da aggregati di cellule disegnando un cancello che esclude l'alta zona FSC e il basso FSC altezza26. Le cellule sono state trattate con una macchia di vitalità che etichettati qualsiasi cellule morte o non sane senza una membrana intatta, e un ulteriore cancello è stato creato per escludere le cellule morte22. L'IFM di singole cellule vive è stato utilizzato per l'analisi dell'assorbimento ERT fluorophore-coniugati. Come un esempio di potenziale risultati di questo test di screening, la matrice a spillo con una quantità elevata di controllo positivo dell'anticorpo anti-droga di surrogato [ad es., controllo di qualità (HQC)] hanno inibito fluorophore-coniugato l'assorbimento ERT, risultante in un basso MFI di circa 300 (Figura 3). Al contrario, cellule incubate con la matrice in assenza dell'anticorpo positivo controllo dovrebbero avere un più alto MFI (MFI = 37.830 nella Figura 3), dimostrando l'assorbimento della ERT fluorophore-coniugati.

La neutralizzazione dell'anticorpo di controllo positivo per l'esempio qui è stato selezionato basato sul meccanismo di azione del farmaco (cioè, l'assorbimento ERT attraverso CI-M6PR). Un pannello di fluorofori è stato anche testato e confrontato per ottimale sensibilità e gamma dinamica1. 5e cypHer è stato testato a causa del suo aumento della fluorescenza a un pH acido, che potrebbero essere rilevanti per alcuni ERTs come misura aggiuntiva di targeting lysosomal della droga27. Un colorante fluorescente verde (ad es., Alexa Fluor 488) e un colorante fluorescente da' (ad es., Alexa Fluor 647) inoltre sono stati esaminati. Un esempio di come i diversi fluorofori potrebbe eseguire è presentato in Figura 4a e 4b. Nell'esempio, Alexa Fluor 647 ERT aveva le migliori prestazioni grazie alla sua sensibilità superiore (ad es., la più alta % SI alla concentrazione più bassa del PC) e l'ampia gamma dinamica (~ 3 ordini di grandezza).

Figura 4: esempio di risultati da diversi fluorophore-ERT coniugati. (A) durante lo sviluppo di analisi, una curva di diluizione del controllo positivo (PC) dovrebbe essere valutata utilizzando diversi ERTs fluorophore-coniugati. Nell'esempio mostrato qui, due fluorophore-coniugato ERTs (Alexa Fluor 488 e CypHer 5e) 6,25 µ g/ml e un più luminoso fluorophore-coniugato ERT (Alexa Fluor 647) 1,56 µ g/ml sono stati testati in presenza di concentrazioni crescenti del controllo positivo NAbs. (B), questo pannello mostra le curve da pannello A rappresentati graficamente, utilizzando IFM per mostrare il significativo aumento della gamma dinamica utilizzando un ERT Alexa Fluor 647-coniugati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il metodo descritto è un approccio a più livelli per il rilevamento, confermando e interpolando un livello quasi-quantitativo di NAb titolo3. Per stabilire il dosaggio è pronto per la convalida, i parametri tra cui sensibilità, precisione, selettività, specificità, tolleranza al farmaco, robustezza, e i punti di taglio devono essere valutati secondo stabilito guidances1,3 .

I campioni sono stati considerati potenzialmente positivi con questo test quando % SI valori superiori a tagliata lo screening point (SCP) sono stati ottenuti. Il SCP è stato determinato statisticamente test droga-ingenuo campioni da una popolazione rappresentativa e misurando una diminuzione relativa nel segnale intensità (SI)3. Orientamento (per esempio della FDA) consiglia il SCP è stabilito presso il 95° percentile del set di dati distribuiti normalmente, e metodi per il calcolo il SCP sono stati descritti dettagliatamente altrove1. Qualsiasi campione che ha fatto diminuire il segnale di test (misurato come un aumento in % SI) o sopra il SCP è stato determinato per essere potenzialmente positivo e campioni con risultati superiori il SCP (senza modificare o ridurre in % SI) sono considerati negativi.

Campioni che proiettato positiva (% SI sopra il SCP) sono stati analizzati con il test conferma per determinare la specificità di Nefertari a ERT. L'analisi conferma è stata eseguita incubando pre-campioni con biglie magnetiche ERT-coniugati per rimuovere gli anticorpi farmaco-specifici o fattori inibitori. Il RR (il rapporto di conferma IFM IFM di screening) è stato valutato per determinare che il numero di NAbs rimosso dal campione. Un RR supera alla soglia calcolata di positività [vale a dire, il punto di taglio confermativo (CCP)] hanno indicato la presenza di anti-droga Navarro. Come test di screening, il CCP dovrebbe essere fondato valutando naïve al trattamento campioni da una popolazione rappresentativa nell'analisi di conferma. CCP si basava su un determinato statisticamente 1% tasso di falsi positivi ed era la soglia che designa un campione confermato positivamente (Figura 5)3.

Campioni che proiettato e confermato positivo in serie erano diluiti e analizzati con il test di titolo per determinare il livello relativo o titolo di Nefertari in ciascun campione. La diluizione più alta a cui un campione test positivo quando ha attraversato una soglia designata [ad esempio, il titolo tagliato punto (TCP)] è il campione titolo (Figura 5)1,3.

Figura 5: esempio sample test risultati. Questi pannelli mostrano esempi di campioni che testato positivo o negativo di screening sopra o sotto un SCP del 17,51% SI. Campioni positivi sono stati quindi analizzati con il test di conferma utilizzando biglie magnetiche coniugato di droga per vuotare l'anticorpo specifico per farmaco dai campioni prima del test nell'analisi. Campioni con un rapporto di recupero (RR) maggiore nel punto di taglio confermativo (cioè, RR = 1,315) sono stati considerati essere confermati positivi. Campioni che confermato positivo sono stati diluiti fino a quando il segnale oltrepassato il titolo punto (TCP) per stabilire il titolo (fattore di diluizione) a cui il risultato del campione è uguale il titolo punto di taglio di taglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Variabilità e ripetibilità di dosaggio sono stati testati per diversi giorni e con più di un analista. Il QCs erano inizialmente preparati in un unico batch e sub-aliquotati per 1 x uso. Nel corso di 3 d, due analisti eseguito il test con diversi set di QCs per dimostrare la precisione del dosaggio. Nei dati di esempio riportati, il CV % della precisione inter - e intra-saggio per il QCs sono meno di raccomandazione, della guida FDA del < 20% CV % (Figura 6)1.

Figura 6: esempio di QC precisione dati generati in tre giorni con due analisti. I dati di precisione sono stati calcolati da un'analisi della varianza (ANOVA), utilizzando la formula presentata in DeSilva et al. 28. il intra-batch (all'interno di piste) e Inter-batch (tra piste) statistiche vengono segnalate come % CV Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori sono dipendenti e gli azionisti di BioMarin Pharmaceutical Inc.