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Articolo metodologico

Valutazione della resistenza agli inibitori della tirosina chinasi di un interrogatorio di trasduzione del segnale da matrici di anticorpo

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DOI:

10.3791/57779

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19 settembre 2018

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1Lawrence J. Ellison Institute for Transformative Medicine, Center for Applied Molecular Medicine, University of Southern California

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per le matrici di anticorpo di identificare le alterazioni in vie di segnalazione in vari modelli di cellulari. Questi cambiamenti, causati da farmaci/ipossia/ultra-ultravioletti luce/radiazione, o da sovraespressione/downregulation/Ko, sono importanti per vari modelli di malattia e possono indicare se una terapia sarà efficace oppure può identificare meccanismi di farmaci resistenza.

Abstract

Malati di cancro con un regolamento aberrante delle reti di fosforilazione della proteina sono spesso trattati con gli inibitori della chinasi della tirosina. Si avvicina l'85% i tassi di risposta sono comuni. Purtroppo, i pazienti diventano spesso refrattari al trattamento, modificando la loro vie di trasduzione del segnale. Un'implementazione di delineamento di espressione con microarrays può identificare le modifiche nel complesso a livello di mRNA e proteomica può identificare le modifiche globali nei livelli della proteina o in grado di identificare le proteine coinvolte, ma l'attività della trasduzione del segnale le vie possono essere stabilite solo interrogando modificazioni post-traduzionali delle proteine. Di conseguenza, la capacità di identificare se un trattamento farmacologico è successo o se la resistenza è sorto, o la possibilità di caratterizzare eventuali alterazioni nelle vie di segnalazione, è una sfida clinica importante. Qui, forniamo una spiegazione dettagliata di matrici di anticorpo come uno strumento che può identificare le alterazioni a livello di sistema in varie modificazioni post-traduzionali (ad es., fosforilazione). Uno dei vantaggi dell'utilizzo di matrici di anticorpo include la loro velocità e accessibilità (matrice non richiede sia un esperto di proteomica o costose apparecchiature). La disponibilità di una combinazione di modificazioni post-traduzionali di targeting di matrici è il limite principale. Inoltre, approcci imparziali (fosfoproteomica) possono essere più adatti per la scoperta di romanzo, considerando che le matrici dell'anticorpo sono ideali per le destinazioni più ampiamente caratterizzate.

Introduzione

L'implementazione clinica degli inibitori mirati tirosina chinasi (TKI) ha trasformato il trattamento del cancro, fornendo i medici con strumenti efficaci per indirizzare le proteine specifiche che promuovere la trasformazione neoplastica. Questi composti inibiscono o bloccano la fosforilazione delle proteine bersaglio di tirosina chinasi1,2. TKI sono state sviluppate in parte perché le alterazioni genetiche in chiave di vari geni di segnalazione sono sufficienti per l'inizio del cancro di unità e progressione [ad es., recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), tirosina-chinasi di proto-oncogene Src (SRC), BCR-ABL e il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2)]3,4. L'impatto di TKI il ciclo cellulare5 e la segnalazione molecolare vie6 rappresenta una trasformazione dal non mirati per il trattamento del cancro molecolarmente guidate. Il vantaggio chiave di TKI versus chemioterapia è i tassi di risposta aumentata e il minor rischio di tossicità per le cellule sane7. Di conseguenza, sta aumentando l'attenzione sulla ricerca e lo sviluppo del romanzo TKI.

Accesso ai risultati di sequenziamento genomico iniziato con il progetto genoma umano8,9,10 e continua ancora oggi con vari generazione (NextGen) cancro sequenziamento sforzi [ad es., The Cancer Genome Atlas (TCGA)11,12]. Questo ha ispirato molte metodologie sperimentali che forniscono informazioni simultanee su migliaia di geni e/o forniscono imparziale istantanee di geni o proteine modulate da perturbazioni biologiche13. Poiché il regolamento della funzione cellulare avviene a più livelli, dalla trascrizione di geni per la modificazione post-traduzionale delle proteine e la loro attività, una completa comprensione degli eventi controllando la funzione cellulare sarà in definitiva richiede un'integrazione di dati da varie letture biologiche. La possibilità di monitorare i livelli di RNA messaggero (mRNA) di migliaia di geni con una risoluzione di singole cellule gene ha aumentato la capacità di fare inferenze circa la funzione del gene e le interazioni a livello di intero genoma. Tuttavia, l'interpretazione di matrici di espressione genica sarà sempre intrinsecamente incompleta senza l'integrazione di altri livelli del regolamento: vale a dire, i livelli di espressione della proteina, gli Stati di modificazione della proteina e la post-traduzionale della proteina modifiche (fosforilazione, ubiquitylation, metilazione, ecc.). Qui, descriviamo l'utilità delle matrici di anticorpo come mezzo per interrogare le modificazioni post-traduzionali delle componenti importanti di segnalazione in funzione delle diverse condizioni in un singolo esperimento14,15, 16.

Matrici di fosfo-anticorpo possono essere impiegate per distinguere e analizzare i cambiamenti nelle vie di trasduzione segnale16. Questi possono derivare da una modificazione genetica o trattamenti di linee cellulari con gli inibitori della chinasi, chemioterapici, stress causato da inedia di privazione, ipossia o nel siero di glucosio. Di nota, di resistenza ai farmaci o di un gene specifico - up o downregulation può anche causare cambiamenti nelle vie di trasduzione segnale17.

Resistenza ai farmaci, ad esempio, possa derivare da mutazioni dell'obiettivo della droga per evitare la sensibilità. Nel cancro del polmone, noto le mutazioni di EGFR rendono il cancro insensibile a certe TKI, ma più suscettibili di altri. Vie di segnalazione alternativa può essere attivato su mutazione17. Come applicazione più ampia per l'identificazione delle vie di trasduzione del segnale coinvolte nella resistenza e ipossia, ecc., matrici di fosfo-anticorpo forniscono ulteriori approfondimenti, e di conseguenza capire, i meccanismi coinvolti.

Tecnologie che permettono una valutazione delle modifiche della proteina rappresentano una componente importante della biologia dei sistemi, perché spesso servono una funzione regolatrice, ad esempio modulando l'attività di un enzima o le interazioni fisiche tra proteine. L'importanza delle modificazioni post-traduzionali è illustrata dal ruolo di fosforilazione della proteina in quasi tutti i segnale extracellulare indotta trasduzione vie18. Tradizionalmente, l'identificazione delle chinasi o lo stato di fosforilazione di proteine anche potrebbe essere determinato da analisi Western blot, soprattutto se il ricercatore è interessato a soltanto 1 – 5 destinazioni. Tuttavia, Western blot sono molto selettivi e può essere orientato alla conoscenza preventiva e potrebbe perdere importanti obiettivi di conseguenza. Anticorpo Array forniscono una lettura di medio-velocità effettiva di bersagli multipli incorporando vari anticorpi di cattura [tortiera specifica fosforilato tyrosine(s), anti-ubiquitina, ecc.], su una matrice solida (ad es., vetro o nitrocellulosa). Anticorpi secondari forniscono informazioni su proteine specifiche in un formato di base di sandwich ELISA (Figura 1). Questo test diventa più potente e pertinenti come più bersagli sono di interesse o la conoscenza è limitata15. Il phospho-matrici sono più largamente impiegabili come possono confrontare fosforilazione come pure la quantità generale di proteine di una più ampia varietà di obiettivi in un esperimento e fornire una quantificazione significativamente migliorata tramite spettrometria di massa. Questa tecnica non è applicabile per l'identificazione dei siti di fosforilazione di nuove o sconosciute.

Su larga scala basati sulla spettrometria di massa proteomica potrebbe essere impiegato per identificare i siti di fosforilazione specifico di proteine19. Sebbene questa tecnica può enumerare migliaia di eventi post-traduzionali, richiede strumentazione costosa, pipeline sperimentale dedicati e un know-how computazionale che sono oltre la portata della maggior parte dei ricercatori.

Le matrici anticorpo forniscono una lettura simultanea su varie proteine letture16. Questi possono essere cambiamenti nella proteina ubiquitylation (ubiquitina matrice) o fosforilazione. Il vantaggio principale di questa tecnologia di matrice è che esso fornisce importanti feedback sullo stato biologico dei vari percorsi biologici associati ai parametri di cellula importante (proteina di kDa 53, p53, recettori tirosino-chinasi e vie intracellulari) contemporaneamente. Inoltre, è possibile combinare diversi tipi di matrici per aumentare la penetrazione di un test (ad es., apoptosi e ubiquitina e la fosforilazione). Questa capacità di combinare più matrici per valutare varie alterazioni post-traduzionali in diversi campioni contemporaneamente in un modo di tempo e costi efficaci che non necessita di strumentazione specifica o esperienza è un significativo vantaggio nel caso di matrici di anticorpo.

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Protocollo

1. estrazione di proteine

  1. Piastra 5 x 106 cellule su una piastra di coltura del tessuto di 10 mm (o beuta) in una cappa di coltura del tessuto. Contare le celle al momento della placcatura con un contatore automatico delle cellule o un emocitometro. In alternativa, stimare il numero di celle.
  2. Sciacquare le cellule coltivate sulla piastra di 10 mm (o beuta) accuratamente 3 x 10 ml di tampone fosfato salino (PBS) (pH = 7.4). Assicurarsi di rimuovere tutti i PBS prima di aggiungere il buffer di lisi.
    Nota: Il buffer di Lisi è di solito fornito con il kit. In caso contrario, utilizzare un tampone del saggio di radioimmunoprecipitation (RIPA) o qualsiasi altri buffer di lisi delle cellule contenenti un cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi.
  3. Lyse 1 x 107 cellule/mL di cellule nel buffer di lisi aggiungendo la giusta quantità di buffer per le cellule e raschiando le cellule con un raschietto di cella nel buffer di lisi. (ad es., per le cellule HeLa e MiaPaCa-2, utilizzare 600 µ l per piastra di 10 cm).
  4. Pipettare lisato su e giù (circa 10 volte) e trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 mL.
  5. Incubare i lisati per 30 min a 4 ° C, preferibilmente in un rocker/agitatore. Premere il lisato attraverso una siringa con un ago da 27 G x 10 assicurare un'interruzione corretta della cell membrane(s). In alternativa, Sonicare lisato. Memorizzare i lisati a-20 ° C o utilizzarli immediatamente.
  6. Centrifugare il lisato a 14.000 x g a 4 ° C per 15 min e trasferire il surnatante in una provetta pulita da 1,5 mL.
  7. Quantificare la quantità di proteina totale di bicinconinico dosaggio acido (BCA)20 o un equivalente come Lowry o Bradford e continuare con almeno 50 – 400 μg. Utilizzare le proteine immediatamente o aliquota e congelare/negozio a-70 ° C (evitare più cicli di gelo-disgelo).

2. umano Phosphokinase Array

  1. Portare tutti i reattivi a temperatura ambiente prima di iniziare (per circa 1 h).
    Nota: Tutti i reagenti ed usura in plastica sono inclusi nel kit.
  2. Preparare tutto il fresco di reagenti (buffer di matrice) prima di iniziare la procedura seguendo le istruzioni del produttore (a seconda della scelta di obiettivi/matrici, le istruzioni potrebbero variare leggermente).
  3. Ricostituire i cocktail di anticorpo di rilevazione in 100 μL di acqua deionizzata o seguire le istruzioni del produttore dovrebbe si differenziano per la provetta da 1,5 mL fornita.
  4. Preparare il tampone di lavaggio 1X diluendo 40 mL di tampone di lavaggio in 960 mL di acqua deionizzata: 25x e mescolare capovolgendo.
    Nota: I cristalli si dissolvono a temperatura ambiente. Il buffer può ingiallire nel tempo, ma continuerà a funzionare.
  5. Pipettare 1 mL di buffer di matrice 1 in tutti i pozzetti di un multi-vassoio 8 pozzetti (o 2 mL in un multi-vassoio 4 pozzetti).
  6. Con pinzette piatto-punta, togliere le membrane di matrice tra i fogli protettivi e metterli nei pozzetti. Assicurarsi che i numeri sulla membrana siano rivolti verso l'alto.
    Nota: Al momento dell'immersione, il colorante sulla membrana scomparirà.
  7. Coprire la piastra con un coperchio e incubare su un dondolo shaker a piattaforma per 60 min a temperatura ambiente.
    Nota: Questo è il passo di blocco di membrana.
  8. Durante il periodo di incubazione, è necessario preparare i campioni della proteina. Aggiungere 50 – 100 μg di proteine totali. Diluire il lisato, avendo un volume massimo di 334 μL, con buffer di Lisi ad un volume finale di 1 mL.
    Nota: 50 – 100 μg di proteina totale è sufficiente di solito.
  9. Aspirare con cura il buffer di matrice 1 e incubare le membrane con 1 mL dei campioni durante la notte a 2 – 8 ° C in un agitatore di piattaforma a dondolo.
    Nota: Non toccare/zero le membrane.
  10. Il giorno successivo, lavare la matrice accuratamente rimuovendo ogni matrice e posizionarla in singoli contenitori di plastica (circa 8 x 11 cm2) con 20 mL di tampone di lavaggio 1x 1. Lavare le membrane 3 x 10 min su una piattaforma a dondolo in 1x tampone di lavaggio a temperatura ambiente.
  11. Aggiungere 20 μL dell'anticorpo ricostituito cocktail dal passaggio 2.3 a 1 mL di tampone di matrice 2 1x. Aggiungere 1 mL di questa soluzione ad ogni 8-pozzetto per essere utilizzato.
  12. Rimuovere con cautela le membrane dai vassoi di lavaggio. Asciugare il bordo inferiore su carta assorbente per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio in eccesso e trasferirli nuovamente dentro il cassetto contenente i cocktail di anticorpi. Coprire la piastra con il coperchio e incubare per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo. Sciacquate i vassoi usati con dH2O bene e asciugarli per un successivo utilizzo.
  13. Ogni matrice di rimuovere delicatamente e inserire nuovamente i contenitori di plastica pulito individuali (circa 8 x 11 cm2) con 20 mL di tampone di lavaggio 1X. Lavare 3 x 10 min con il tampone di lavaggio su una piattaforma a dondolo a temperatura ambiente.
  14. Diluire la streptavidina-HRP (fornito con il kit) o tintura di streptavidina-fluorescente (per una rilevazione più quantitativa) 1:1,000 in 1x tampone di matrice 2 in una provetta da 15 mL.
  15. Restituire le membrane nei piatti 8 pozzetti contenenti la soluzione HP e li Incubare 30 min a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo (se usando la fluorescenza, avvolgere il vassoio nella carta stagnola per evitare qualsiasi esposizione alla luce).
  16. Rimuovere il tampone in eccesso ponendo la membrana tra 2 pezzi di 5 mm di carta 3M. Per l'imaging con un imager chemiluminescente/pellicola di raggi x, incubare le membrane secche con una soluzione di rilevamento di HRP (mescolare le due soluzioni chemiluminescente 1:1) per 3 min e posizionare la membrana in un foglio di plastica trasparente di protezione.
    Nota: Membrane(s) secchi può essere anche inserito in un imager fluorescente per rilevare il segnale fluorescente; ridurre al minimo l'esposizione alla luce per la membrana prima di formazione immagine. Per una quantificazione dei file x-ray film o imager, evitare la sovraesposizione. La maggior parte a chemiluminescenza/fluorescente Imager hanno una funzione per evitare una saturazione del segnale.

3. analisi dei dati

  1. ImageJ, un'immagine elaborazione programma21, di scaricare e installare il software.
  2. Aprire ImageJ facendo doppio clic sul 'Icona ImageJ'. Selezionare l'immagine per essere analizzati facendo clic su 'File' nella barra dei menu, quindi selezionare 'Apri' dal menu a discesa e Sfoglia i file del computer per l'immagine di interesse. Fare clic sul file per aprirlo.
  3. Invertire l'immagine per l'analisi (macchie nere su fondo bianco a macchie bianche su sfondo nero) facendo clic su 'Modifica' nella barra dei menu e selezionando 'Invert' dal menu a discesa.
  4. Selezionare l'icona' ovale' dalla barra degli strumenti (la seconda opzione nella barra degli strumenti di ImageJ). Cliccando sulla foto (traversa nera) e muovendo il mouse per disegnare un cerchio o ovale. Regolare la dimensione/forma di cerchio o ovale per circondare i puntini sulla macchia del puntino.
  5. Fare clic su 'Analizzare' nella barra dei menu e quindi selezionare 'Misura' dal menu a discesa per aprire automaticamente una nuova finestra con i valori dell'area selezionata (zona, media, minimo e massimo).
  6. Spostare l'area circolare trascinando il cerchio dal centro (mettere il punto di destra freccia nel mezzo) e posizionarlo intorno alla zona di misurazione (dot) successiva. Misurare tutti i punti di interesse, il controllo positivo, controllo negativo e lo sfondo per l'analisi.
    Nota: Il controllo negativo è il PBS, lo sfondo è una parte della membrana senza alcuna macchia (qualsiasi parte farà) e il controllo positivo è un controllo fornito dal produttore.
  7. Selezionare i punti di controllo negativo di PBS e sottrarre il valore da ogni posto. Media intensità per ogni coppia di punti duplicati che rappresentano ogni recettore tirosina chinasi (RTK). Ogni intensità media può essere correlato al controllo per calcolare la variazione di piega.

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Risultati

Per studiare l'effetto di resistenza TKI su vie di trasduzione del segnale nelle linee cellulari, quattro campioni sono stati analizzati. Esempio di un controllo (H3255r1) e 3 linee di cellulari TKI-resistente (H3255r2-4) (Figura 2) sono stati collegati al modello spot anticorpo (Figura 3). Tutti e 4 i campioni sono stati preparati usando questo protocollo. Sei fosfoproteine con attività differenziale sono stati scelti per la dim...

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Discussione

Approcci che combinano molte letture biologiche sono intrinsecamente più accurate rappresentazioni del macchinario cellulare in un esperimento effettuato. L'avvento di matrici di fosfo-anticorpo consente una rapida caratterizzazione del modello di modifiche che possono essere più informativo dello stato di aggiornamento di ogni singola proteina. Il flusso di lavoro generale per l'applicazione di matrici di fosfo-anticorpo si basa su una modifica in serina, treonina o tirosina. In questo esempio viene focalizzata su che c...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati per il generoso sostegno finanziario del Lawrence J. Ellison Istituto di Transformative medicina di USC (un regalo di David Agus). Apprezziamo il sostegno dell'autunno Beemer e Lisa Flashner che portano alla generazione e pubblicazione di questo manoscritto. Ringraziamo Laura Ng per il suo sostegno amministrativo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Imager Odysee SALi-Cor BiosciencesImager fluorescente
provetta da 1,5 mLRaschietto cellulare Eppendorf
Falkon (Corning)353085
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbeco (PBS)Corning21-031-CVtampone di lavaggio per l'estrazione di proteine
Piatto per coltura tissutale 100 mmTRP93100
ICC Siringa da insulina U100Becton Dickinson32941227 G5/8,  1 mL per il trattamento con ago di campioni proteici
Protein Profiler ARRAY R& DARY003Bumano fosfo MAPK array
ARRAY R& DARY002Bumana per array di fosfochinasi
Eppendorf 5430REppendorfCentrifuga da tavolo
Kit per il dosaggio delle proteine BCAPierce Thermo Fisher23225
SpectraMAX M2Molecular DevicesLettore di assorbanza per la quantificazione delle proteine
IRDye 800CW StreptavidinaLi-Cor Biosciences925-32230Coniugato di streptavidina per la rivelazione fluorescente
LabGard ES Classe II, cabina di biosicurezza di tipo A2NuAireNU-425-400Cappa per coltura tissutale
TC20 contatore cellulare automatizzatoBio-Rad1450102Contatore cellulare
Halt Protease & Cocktail di inibitori della fosfatasi (100x)Thermo Fisher78446
tampone RIPASigmaR0278
Sonic DismembratorFisher ScientificF60sonicator
Agitatore a piattaforma oscillanteVWR10860-780
ImageJNIH open sourcehttps://imagej.net/Welcome
SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64 bit)Valentina
in 22363212 Profilo proteico Centrifuga

Riferimenti

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