Method Article

Cella singola analisi di Immunophenotype e produzione di citochine nel sangue periferico intero tramite citometria a massa

DOI:

10.3791/57780

⸱

June 26th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo un approccio proteomico di singola cellula per valutare immunitario fenotipica e funzionale (induzione di citochine intracellulari) alterazioni nei campioni di sangue periferico intero, analizzati tramite citometria a massa.

Abstract

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Citochine svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi delle malattie autoimmuni. Quindi, la misurazione dei livelli di citochine è stata al centro di molteplici studi nel tentativo di capire i meccanismi precisi che portano alla rottura della tolleranza al self e autoimmunità successive. Approcci finora sono stati basati sullo studio di un aspetto specifico del sistema immunitario (un singolo o pochi tipi di cellule o citochine) e non offrono una valutazione globale della malattia autoimmune complessa. Mentre studi basati su sieri di pazienti hanno offerto importanti intuizioni autoimmunità, non forniscono la fonte cellulare specifica delle citochine dysregulated rilevate. Un approccio globale di singola cellula per valutare la produzione di citochina in più sottoinsiemi di cellule immuni, all'interno del contesto di "intrinseco" plasma paziente-specifici fattori, di circolazione è descritto qui. Questo approccio consente il monitoraggio del fenotipo immune paziente-specifici (marcatori di superficie) e funzione (citochine), sia nella sua nativa "intrinseco patogeni" malattia stata, o in presenza di agenti terapeutici (in vivo o ex vivo).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie autoimmuni sono delle principali cause di morbilità e mortalità che colpisce 3-8% della popolazione. Negli Stati Uniti, disordini autoimmuni sono tra le principali cause di morte tra le donne giovani e di mezza età (età < 65 anni)1,2. Disordini autoimmuni sono caratterizzati dalla presentazione clinica eterogenea e diversificati processi immunologici sottostanti. Lo spettro di eterogeneità è ben rappresentato in diversi disturbi, come la partecipazione unita nell'artrite reumatoide (RA) e malattia neurologica nella sclerosi multipla (MS). Tuttavia, questo livello di eterogeneità è esemplificato anche all'interno di un singolo disordine, come il lupus eritematoso sistemico (Les): alcuni pazienti possono presentare con patologia renale, mentre gli altri soffrono di coinvolgimento ematologico o misto3.

Immunopatogenesi sottostante nei disordini autoimmuni rispecchia l'eterogeneità clinica, che coinvolge e iper-attivazione automatica di più sottoinsiemi delle cellule immuni innate ed adattabili e dysregulated concomitante produzione di citochine. Mentre citochine svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi della malattia autoimmune, comprendere il loro ruolo specifico nel meccanismo di malattia ha dimostrato di essere impegnativo. Le citochine sono caratterizzate da pleiotropia (una citochina può avere molteplici effetti su diversi tipi di cellule), ridondanza (citochine multiple possono avere lo stesso effetto), la dualità (una citochina può avere effetti pro - o anti - infiammatori in condizioni diverse), e plasticità (citochine possono essere modellate in un ruolo diverso da quello "originale", a seconda dell'ambiente)4,5,6. Di conseguenza, metodi a livello di popolazione non possono distinguere le risposte cellulari eterogenee per la stessa "milieu citochinico". Allo stesso modo, progettazione degli studi che si concentrano su un aspetto specifico del sistema immunitario (una citochina o tipo unicellulare), non offrono una valutazione globale di tutti gli elementi coinvolti nella malattia autoimmune complessa. Mentre studi basati su sieri di pazienti hanno offerto importanti intuizioni autoimmunità, non forniscono la fonte cellulare specifica delle citochine dysregulated rilevate.

Recentemente, abbiamo sviluppato un approccio di proteomica di singola cellula per valutare contemporaneamente più tipi di cellule immunitarie e rilevare le loro varie perturbazioni di citochina nell'ambiente del paziente specifico "patogeni" plasma sanguigno periferico fattori circolanti. Il flusso di lavoro descritto qui è caratterizzato dall'uso di campioni di sangue intero periferico intatto, al contrario di cellule mononucleari di sangue periferico isolato (PBMCs). Sangue periferico intero rappresenta il veicolo più fisiologicamente rilevante per studiare la malattia immune-mediata sistematica, compreso globuli 1) non-mononucleari spesso coinvolti nella malattia autoimmune (cioè, neutrofili, piastrine) e 2) del plasma circolazione di fattori, quali gli acidi nucleici, i complessi immuni e citochine, che hanno ruoli di attivazione immunitario. Per catturare il "intrinseco patogeni" produzione dysregulated di citochina, sangue periferico campioni vengono elaborati immediatamente dopo il prelievo del sangue (T0, tempo zero) e dopo 6 h di incubazione a 37 ° C (temperatura corporea fisiologica) con un trasporto di proteine inibitore in assenza di qualsiasi condizione di stimolazione esogena (T6, tempo 6 h), per rilevare la produzione di citochine (accumulo, T6-T0) che rifletta lo stato di malattia "intrinseca" (Figura 1). Per studiare processi dysregulated che riflettono sopra o sotto-attivazione di vie di segnalazione coinvolte nelle risposte immunitarie pertinenti alla malattia, campioni di sangue periferici sono trattati (6 ore di incubazione a 37 ° C con un inibitore della proteina di trasporto) con un esogeno stimolando la condizione che riflette la patogenesi della malattia, quali gli agonisti del recettore Toll-Like (TLR) nel caso di SLE (T6 + R848, tempo 6 h con R848 1 µ g/mL), per rilevare la produzione di citochine che riflettesse una risposta agli acidi nucleici (confronto tra T0 vs T6 vs T6 + R848, Figura 1). Per studiare gli effetti immunomodulatori di terapie disponibili ex vivo, come si riferiscono ai processi dysregulated immune preciso per specifici pazienti, campioni di sangue periferici sono trattati con un inibitore JAK alle pertinenti terapeutico concentrazione (qui, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tempo 6h con 5 uM ruxolitinib), per rilevare le modifiche nello stato di malattia "intrinseca" in risposta al farmaco (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figura 1). Un inibitore JAK è stato scelto per questo studio perché gli inibitori JAK sono stati indicati per avere successo nel trattamento di malattie autoimmuni come ra

Per valutare contemporaneamente i processi di dysregulated sopra descritti in più sottoinsiemi di cellule immunitarie, i campioni di sangue periferico da SLE pazienti e controlli sani sono stati trattati come descritto in precedenza e analizzati mediante citometria a massa. Citometria a massa, noto anche come Cytometry-Time-Of-Flight, offre analisi unicellulare di oltre 40 parametri senza problemi di spettrale si sovrappongono7,8,9. Questa tecnica utilizza terre rare isotopi del metallo sotto forma di ioni metallici solubili come tag associato agli anticorpi, invece di fluorofori10. Ulteriori dettagli riguardanti la piattaforma tecnologica di citometria a massa (cioè, tuning e calibrazione, acquisizione di esempio) possono essere trovati in Leipold et al e McCarthy et al. 11 , 12 l'alta-dimensionalità di massa cytometry consente la misura simultanea delle citochine multiple in tutta sottoinsiemi delle cellule immuni innate ed adattabili con granularità di singola cellula (Tabella materiali).

Corrente convenzionale di parametri clinici e di laboratorio spesso non sono sufficientemente specifiche per la rilevazione di attività di malattia in corso o la risposta a specifici immunomodulatori13, che riflette la necessità di delineare meglio il sistema immunitario sottostante o sensibili modifiche che guidano le fiammate. Data la pervasività della citochina disregolazione nella malattia autoimmune, hanno una pletora di approcci terapeutici che utilizzano gli anticorpi o piccoli inibitori molecolari targeting citochine o segnalazione di proteine coinvolte nella regolazione della produzione di citochine recentemente è emerso. Nella sua forma base, l'approccio analitico di sangue periferico qui descritto fornisce una piattaforma per identificare dysregulated paziente-specifici sottoinsiemi di cellule e la loro produzione di citochina anormale nella malattia autoimmune con le manifestazioni sistematiche. Questa metodologia permette per la personalizzazione delle scelte terapeutiche come citochine dysregulated specifici possono essere identificate, trattamento specifico di opzioni possono essere esaminato ex vivo per valutare la loro capacità di immunomodulate il paziente malattia specifica processo.

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Protocol

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da il Colorado più istituzionale Review Board (COMIRB) dell'Università del Colorado. Tutte le procedure descritte qui sotto dovrebbero essere effettuate in un cappuccio sterili per coltura, salvo diversa indicazione, con puntali filtrata, e tutti i reagenti filtrata.

1. preparazione dei reagenti per la lavorazione del sangue intero periferico

  1. Preparare ruxolitinib stock aliquote (10 – 15 μL/flaconcino monouso) a 10mm diluendo il reagente liofilizzato in DMSO secondo le istruzioni del produttore (conservare a-80 ° C). Mantenere le concentrazioni di DMSO in tutte le analisi compreso non stimolati controlli sotto 0.2% (vol/vol).
  2. Preparare R848 (resiquimod) stock aliquote (10 – 15 μL/flaconcino monouso) a 1 μg/μL diluendo il reagente liofilizzato in acqua sterile come il secondo le istruzioni del produttore. Conservare a-80 ° C.
  3. Preparare lipopolysaccharide aliquote d'archivio (LPS) (5 μL per fiala per un solo utilizzo di tempo) a 1 μg/μL diluendo il reagente liofilizzato in acqua sterile secondo le istruzioni del produttore. Conservare a-80 ° C.
  4. Preparare la cella colorazione Media (CSM), utilizzo di PBS, 0,5% BSA e 0,02% NaN3.
  5. Acquisire e tenere pronto il cocktail di inibitore (PTI) di trasporto della proteina (Tabella materiali).
  6. Scongelare e diluire il ruxolitinib stock flaconcino (10 mM) 01:10 in PBS sterile (1 mM). Mettere da parte a temperatura ambiente in una cappa di coltura del tessuto.
  7. Scongelare e diluire il flaconcino stock R848 (1 µ g / µ l) 01:10 in PBS sterile (0,1 µ g / µ l). Mettere da parte a temperatura ambiente in una cappa di coltura del tessuto.
  8. Scongelare e diluire il LPS flaconcino stock (1 µ g / µ l) 1: 100 in PBS sterile (0,01 µ g / µ l). Mettere da parte a temperatura ambiente in una cappa di coltura del tessuto.
  9. Preriscaldare la sterile RPMI (nessun L-Glutammina) in un bagno d'acqua normali 37 ° C (per almeno 10 min).
  10. Diluire il tampone lisante/correzione di 1:5 in ddH filtrata2O (concentrazione di lavoro) sul banco (non deve necessariamente essere sterile).
    Nota: 1 mL di sangue intero richiede 20 mL di concentrazione di lavoro di tampone di lisi/correzione.
    1. Rendere il buffer di lisi/fix per 5 condizioni di 1 mL di sangue intero ogni (almeno 100 mL). Aliquota 20 mL di concentrazione di lavoro di tampone lisante/fix in provette coniche da 50 mL per millilitro di sangue intero (tenere la soluzione lisante/fix a 37 ° C fino a quando necessario). Etichettare le condizioni sui tubi conici contenente tampone di lisi/correzione come segue: T0 (tempo zero), T6 + 5R (tempo 6 h con 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (tempo 6 h con 1 μg/mL R848), T6 + LPS (tempo 6 h con 0,1 μg/mL LPS), T6 (tempo 6 h).
  11. Etichetta fondo sterile polistirolo tubi rotondi con tappi e provette per microcentrifuga da 1 mL con la stessa nomenclatura come descritto al punto 1.10.

2. stimolazione e lavorazione del sangue intero periferico (Figura 1)

  1. Posizionare l'etichetta fondo polistirolo tubi rotondi da passo 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) su una cremagliera.
    Nota: Le seguenti operazioni vengono eseguite in questo tipo di tubo, se non specificato diversamente. Cap i tubi durante il trasferimento tra la cultura del tessuto cappuccio e incubatrice per mantenere la sterilità.
  2. Aggiungere 1 mL di 37 ° C RPMI (nessun L-Glutammina) in ciascuna delle provette (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Capovolgere la provetta di raccolta di sangue più volte, aggiungere 1 mL di sangue intero in ogni provetta e pipettare su e giù più volte per mescolare accuratamente con RPMI (diluizione con RPMI impedisce l'agglutinamento del sangue durante il periodo di incubazione di 6 h).
  3. Aggiungere 10 μL del 01:10 ruxolitinib T6 + 5R. Mescolare accuratamente con una pipetta P1000. Posizionare il portaprovette nell'incubatore a 37 ° C e iniziare a cronometrare l'incubazione (T = 0).
  4. Processo come segue l'esempio di T0.
    1. Pipettare l'intero contenuto del tubo T0 in una provetta conica etichettata contenente 20 mL di buffer di lisi/correzione di 37 ° C lavoro concentrazione. Per ottimizzare il recupero delle cellule, sciacquare il tubo con buffer di lavoro concentrazione lisare/correzione. Mescolare capovolgendo la provetta conica.
    2. Incubare a 37 ° C per 15 min consentire per lisi e la fissazione. A seguito di fissazione, eseguire tutti i passaggi successivi al banco. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    3. Decantare il supernatante. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS freddo ghiaccio per rompere in sul pellet, quindi riempire la forma conica per un volume di 15 mL di PBS.
    4. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Decantare il supernatante. Ripetere il lavaggio con PBS (misure 2.4.3–2.4.4) se le palline sono di colore rossi. Risospendere le cellule in 1 mL di CSM per spezzare il pellet, poi il trasferimento al tubo del microcentrifuge con etichetta (passo 1.11) per macchiatura dell'anticorpo. Prendere un 10 µ l di campione per contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro.
      Nota: Poiché tutte le cellule sono fissi a questo punto, non è necessario includere una macchia di attuabilità.
    5. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante, lasciando il pellet in ~ 60 µ l di volume residuo. Mantenere questo precipitato sul ghiaccio fino a quando i campioni da altre circostanze hanno completato l'elaborazione.
  5. A T = 30 min, spostare il portaprovette (punto 2.3) alla cappa di coltura del tessuto ed eseguire le operazioni seguenti.
    1. Aggiungere 10 μL di 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Mescolare accuratamente con una pipetta P1000.
    2. Aggiungere 10 μL di 0,01 μg/μL LPS a T6 + LPS. Mescolare accuratamente con una pipetta P1000.
    3. Aggiungere 4 μL di inibitore del trasporto di proteine (stock a 500 X) a T6, T6 e T6 + 5R, LPS (ma non a T6 + R848) e restituire i campioni nell'incubatore fino a T = h. 6 Mix accuratamente con una pipetta P1000 ogni 2 h.
      Nota: R848 è un agonista TLR reticolo endoplasmatico e quindi richiede un ritardo temporale nell'aggiunta dell'inibitore della proteina trasporto per consentire l'accesso al suo recettore di destinazione.
  6. A T = 2h, aggiungere 4 μL di inibitore del trasporto della proteina cocktail (stock a 500 X) al T6 + R848 tubo. Mescolare tutti i campioni con una pipetta P1000 e tornare il rack in incubatrice fino a T = 6 h.
  7. Mescolare i campioni con un P1000 ancora una volta a T = 4 h.
  8. A T = 6 h, elaborare T6, T6 + LPS, T6 + R848 e T6 + 5R provette di sangue come descritto passaggio 2.4 per il campione di T0.
  9. Conservare il pellet cellulare in volume residuo del CSM a-80 ° C per elaborare in una data futura. In alternativa, procedere per codici a barre e anticorpo che macchia senza memorizzare.

3. codice a barre delle cellule del sangue lisato/fisso

  1. Scongelare i campioni di cellule lisate/fisso dall'archiviazione di-80 ° C lentamente sul ghiaccio; un massimo di 20 campioni possa essere etichettato con codici a barre univoci e riuniti usando questo sistema. Diluire il tampone di perm X barcoding 10 01:10 con PBS; rendere sufficiente buffer per ~ 3 mL per campione.
  2. Riempire una depressione non sterili con il CSM e uno con il buffer di perm X barcoding 1. Aggiungere 1 mL di ghiaccio freddo CSM per campioni appena scongelati, mescolare accuratamente con una pipetta e trasferire ai tubi rispettivi cluster pre-etichettata in polipropilene.
  3. Prendere un 10 μL di campione per contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Normalizzare i conteggi delle cellule a 1.5 – 2 x 106 cellule per esempio in ciascun tubo di cluster: rimuovere e scartare il volume delle cellule in eccesso sopra 2 x 106 cellule.
  4. Centrifugare le cellule a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di perm X barcoding 1 con una pipetta multicanale e centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il sovranatante.
  5. Allineare i tubi di cluster su un rack nello stesso ordine come indicato sulla chiave codice a barre in modo il campione corrisponde con il codice a barre. Aggiungere 800 μL 1 X buffer di perm barcoding pipetta multicanale a tutti i campioni nei tubi cluster senza toccare il pellet cellulare con le punte di pipetta (Nessuna miscelazione) per ridurre la perdita delle cellule. Mettere da parte il rack con i tubi di cluster.
  6. Rimuovere le strisce di 20-plex Pd Barcoding Kit tubo da-20 ° C e scongelare a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μL di tampone di perm X barcoding 1, mescolare accuratamente e trasferire 120 μL del sedimento barcode mix in campioni di cellule corrispondenti provette di cluster.
  7. Mescolare accuratamente mediante pipetta multicanale così che non c'è nessuna contaminazione incrociata tra individualmente i campioni con codice a barre. Incubare le provette di cluster per 30 min a temperatura ambiente per consentire i codici a barre etichettare le cellule.
  8. Centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere in 1 mL di CSM.
  9. Centrifugare e risospendere in CSM nuovamente come al punto 3.8.
    Nota: Ciascun campione ora è etichettato con un codice a barre univoco e campioni sono pronti per essere messe in comune.
  10. Centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il supernatante. Con una pipetta singola e con la stessa punta, trasferire tutte le palline delle cellule in ~ 70 – 80 il volume residuo μL di una provetta di polistirene. Non espellere il puntale della pipetta; mettere da parte la pipetta singola con questo suggerimento.
  11. Con una pipetta multicanale e nuovi suggerimenti, è possibile aggiungere ~ 100 μL CSM ad ogni provetta di cluster originale per massimizzare il recupero delle cellule. Con la pipetta singola con la punta che è stata accantonata, trasferire tutte le palline delle cellule nel volume residuo di ~ 100 μL nella provetta polistirolo stessa.
  12. Aggiungere CSM a coronamento la provetta polistirolo (~ 3 mL). Conteggio e registrare il numero di cellulare il codice a barre in pool set. Centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il supernatante. Procedere alla colorazione degli esempi di codice a barre sullo stesso giorno.
    Nota: È normale aspettarsi ~ 20 – 30% perdita delle cellule nel processo di codici a barre.

4. colorazione del codice a barre lisate/fisso globuli e preparazione per l'analisi sullo strumento di massa citometria a

Nota: Ogni 1 X titolo di macchiatura dell'anticorpo (1 μL di anticorpo a 100 μL reazione di colorazione), solitamente può macchiare il 3 – 4 x 106 celle. Pertanto, quando tutti gli esempi di codice a barre sono riuniti in una provetta, alla quantità di anticorpo deve essere scalata. Se la quantità di campioni con codice a barre 20 a 30 x 106 cellule e ogni titolo X 1 può macchiare 3 – 4 x 106 cellule, nell'esempio di codice a barre richiede solo un 10 titolo X, al contrario di ogni campione di colorazione individualmente, che richiederebbe una quantità X 20 dell'anticorpo (1 X ogni singolo tubo). La concentrazione dell'anticorpo al numero di cellulare dovrà essere titolata con attenzione per ogni singolo anticorpo cocktail (non discusso qui).

  1. Macchia le celle utilizzando anticorpi (Tabella materiali) per induzione di citochina e di colorazione superficiale.
    1. Rendono la colorazione superficiale cocktail calcolando la quantità per essere aggiunto e contabile per pipettaggio errore (cioè, se macchiatura 20 campioni di codice a barre di 2 x 106 cellule in ogni campione, un 10 X macchia di titolo è necessario; per i calcoli di volume finale, compensare per pipettaggio errore facendo un 10.5 X colorazione soluzione finale).
    2. Aggiungere 10 X vale la pena di superficie macchiatura volume per il pellet cellulare con codice a barre. Per ridurre la perdita di cellule, con la stessa punta, mescolare e misurare il volume delle macchie superficiali e pellet cellulare.
    3. Basato sul volume delle cellule e la macchiatura cocktail, aggiungere CSM ad un volume di colorazione finale di 50 μL per il numero di campioni di cellule (cioè, se in esecuzione di un insieme di 20 campioni, 50 μL X 20 = 1 mL). Incubare per 30 min a 4 ° C. Agitare il campione ogni 15 min per promuovere anche la macchiatura.
    4. Durante l'incubazione di superficie macchia, preparare il tampone di Perm/lavaggio (Tabella materiali) diluendo 01:10 con ddH filtrata2O. Prepare volumi di 2 mL per permeabilizzazione e 5 mL per il lavaggio. Conservare a 4 ° C o su ghiaccio.
    5. Top fuori la superficie tubo con CSM di colorazione, e centrifuga a 600 x g a 4 ° C per 5 min. aspirare il supernatante. Risospendere il campione di codice a barre in 2 mL di 4 ° C, 01:10 tampone di diluizione Perm/lavaggio. Incubare a 4 ° C per 20-30 min a completamente permeabilize le cellule.
    6. Centrifugare a 600 x g a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante.
    7. Per la colorazione intracellulare, seguire una procedura simile colorazione (per quanto riguarda la marcatura di superficie). Tuttavia, utilizzare i 4 ° C, 01:10 diluizione Perm/Wash buffer anziché il CSM per il totale di macchiatura volume in modo che le cellule rimangono in un ambiente permeabilizing durante la colorazione intracellulare.
    8. Aggiungere l'anticorpo intracellulare cocktail alla superficie macchiata e permeabilizzate pellet cellulare (passi 4.1.2–4.1.17). Portare il totale volume da 50 µ l per numero di campioni di cellule di colorazione. Incubare per 60 min a 4 ° C. Agitare il campione ogni 15 min per garantire anche la macchiatura.
    9. Durante la colorazione intracellulare, preparare la soluzione di intercalator: 900 μL di PBS filtrata + 100 μL di filtrato 16% PFA (concentrazione finale pari all'1,6% PFA) + 0,2 μL di 500 uM di tintura intercalator (Tabella materiali).
    10. Coronare il pellet cellulare + intracellulare anticorpo cocktail con freddo 01:10 Perm/tampone.
    11. Centrifugare a 600 x g a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante. Top fuori il tubo di colorazione con il CSM. Contare e registrare il numero di cellulare. Centrifugare a 600 x g a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante. Risospendere le cellule in 1 mL di soluzione di intercalator dal punto 4.9. Incubare per almeno 20 min a temperatura ambiente per intercalazione completo, o durante la notte a 4 ° C (campioni in soluzione intercalator possono rimanere a 4 ° C per fino a 1 settimana prima della loro esecuzione sullo strumento citometria a massa).
  2. Preparare le celle per lo strumento di massa cytometry.
    1. Coronare il tubo con 3 mL di filtrato ddH2O e centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere le cellule in 3 mL di filtrato ddH2O. passare questa sospensione attraverso un filtro 100 μm per rimuovere eventuali detriti o aggregati che potenzialmente potrebbero intasare lo strumento citometria a massa.
    2. Contare e registrare la post-filtrazione numero di cellulare. Centrifuga a 600 x g per 5 min a 4 ° C
  3. Preparare la soluzione di perlina di taratura (Tabella materiali) diluendo esso 01:10 in ddH filtrata2O.
  4. Risospendere il macchiato le cellule nel volume richiesto di 01:10 diluito soluzione di perlina di taratura per raggiungere una concentrazione di cellule di ~ 1 x 106 cellule/mL.
    Nota: Per un CyTOF1 a 45 µ l/min, l'ottimale consigliata è 5 x 105 cellule/mL; per Helios a 30 µ l/min, 7,5 x 105 cellule/mL.
  5. Procedere per eseguire l'esempio sulla massa cytometry strumento9.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nella figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro per la stimolazione e l'elaborazione dei campioni di sangue periferico, compresa l'assegnazione di aliquote del campione di sangue, temporizzazione dell'aggiunta di agenti di stimolazione, proteina trasporto inibitore cocktail e incubazione volte fino alla lisi di globuli rossi (RBC) e la fissazione. La scelta degli agenti stimolanti dipenderà le vie di segnalazione e citochine che sono mirate per la valutaz...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo un romanzo, unicellulare, approccio proteomico per valutare contemporaneamente più tipi di cellule immunitarie e rilevare le loro varie perturbazioni di citochina nell'ambiente del paziente specifico "patogeni" plasma sanguigno periferico fattori circolanti. Questo metodo utilizza sangue intero periferici come il veicolo analitico e citometria a massa come lo strumento per la valutazione di anomalie fenotipiche e funzionali cellulari immuni. Il metodo è facilmente applicabile a studi umani e topi

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare Aimee Pugh-Bernard per suo input intellettuale e utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research Award e il premio numero K23-1K23AR070897 dal NIH per Elena W.Y. Hsieh. Lei era anche supportata da premio numero K12-HD000850 da Eunice Kennedy Shriver National Institute di salute del bambino e lo sviluppo umano e la Lucile Packard Foundation per la salute dei bambini, Stanford CTSA UL1 TR001085 e ricerca di salute dei bambini Istituto della Stanford University.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RuxolitinibSanta CruzSC-364729AConc. stock: 10 mM; Conc finale: 5 μ M
R848Invivogentlrl-r848-5Conc. di serie: 1 μ g/μ L; Conc finale: 1 μ g/mL
LPS-EKInvivogentlrl-eklpsQuantità di serie: 1 μ g/μ L; Conc finale: 0,1 μ g/mL
Tampone sterile PBSLonza17-516F
Lyse/Fix BDbiosciences558049Stock Conc: 5X; Conc finale: 1X (diluito in ddH2O)
BD Tampone di perm/lavaggio al fosflusso IBD biosciences557885Stock Conc: 10X; Conc finale: 1:10 (diluito in ddH2O)
RPMIGibco21870-076
Azide di sodio (NaN3)Sigma-AldrichS-8032Conc: >99,9%; Conc finale: 0,0002
Inibitore del trasporto proteico (PTI)eBiosciences00-4980-93Conc: 500X; Conc finale: 1X
DNA IntercalatorFluidigm201192BConc. di serie: 500 μ M; Conc finale: 0,1 μ
Mezzi di colorazione per cellule M (CSM)PBS + 0,5% BSA, 0,02% NaN3
MaxPar Barcode PermBuffer Fluidigm201057 Stock Conc: 10X; Conc finale: 1X
20-plex Pd Barcode SetFluidigmS0014Stock Conc: n/a; Conc finale: n/a
EQ TM Perle di calibrazione a quattro elementiFluidigm201078Conc: 10X; Conc finale: 1X
16% Soluzione di formaldeide priva di MeOHThermo28908Stock Conc: 16% (p/v); Conc finale: 1,6% (p/v)
Tubi sterili in polistirene a fondo tondoVWR60818-496Conc: n/a; Conc finale: n/a
Tubi cluster in polipropileneLight LabsA-9001Stock Conc: n/a; Conc: n/a
Helios CyTOF instrumentFluidigmHelios Tuttele soluzioni da utilizzare nell'analisi CyTOF devono essere prive di contaminazione metallica. ddH2O viene utilizzato nella preparazione di qualsiasi soluzione che deve avere una resistività di almeno 18,0 MΩ. cm. ddH2O e le eventuali soluzioni auto-preparate devono essere conservate in nuovi flaconi di plastica o vetro mai sterilizzati in autoclave.
NameAziendaNumero di catalogoComments
Anticorpi utilizzati per la citometria di massa
Marcatori di superficie
CD1cBiolegendL161Massa: 161
CD3BDUCHT1Massa: 144
CD4BiolegendSK3Massa: 174
CD7BDM-T701Massa: 149
CD8BiolegendSK1Massa: 142
CD11bFluidigmICRF44Massa: 209
CD11cBDB-ly6Massa: 152
CD15BDHI98Massa: 115
CD14BiolegendM5E2Massa: 154
CD16eBioscience/ThermoB73.1Massa: 165
CD19Santa CruzSJ25C1Massa: 163
CD21BiolegendBu32Massa: 141
CD27BDL128Massa: 155
CD38FluidigmHIT2Massa: 172
CD45 totaleBiolegendHI30Massa: 89
CD45RABiolegendHI100Massa: 153
CD56MiltenyiREA196Massa: 168
CD66BDB1.1/CD66Massa: 113
CD86FluidigmIT2.2Massa: 150
CD123Fluidigm6H6Massa: 143
CD278/ICOSBiolegendC398.4AMassa: 156
CD179/PD1BiolegendEH12.2H7Massa: 162
IgDBiolegendIA6-2Massa: 146
IgMBiolegendMHM-88Massa: 151
CXCR5BDRF8B2Massa: 173
HLADRBiolegendL243Massa: 167
Citochine
IL-1&alfa;Biolegend364-3B3-14Massa: 147
IL-1βBioleggenda H1b-98Massa: 169
IL-1RASanta CruzAS17Massa: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5Massa: 164
IL-8BDE8N1Massa: 160
IL-12/IL-23p40Biolegend C8.6Massa: 171
IL-17ABiolegend BL168Massa: 148
IL23p19eBioscience/Thermo23dcdpMassa: 176
MIP1βBDD21-1351Massa: 158
MCP1BD5D3-F7Massa: 170
IFNαMiltenyi LT27:295Massa: 175
IFNγBioleggenda4S. B3Massa: 165
PTENBDA2B1Massa: 159
TNFαBiolegendMab11Massa: 166
Nota: Se il produttore è indicato come Fluidigm, questo anticorpo è stato acquistato da Fluidigm con metallo pre-coniugato. Se il produttore è indicato come diverso da Fluidigm, questo anticorpo è stato autoconiugato utilizzando l'etichettatura multi-metallo MaxPar. Kit (Fluidigm Cat: 201300) secondo il protocollo del produttore.

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