Cella singola analisi di Immunophenotype e produzione di citochine nel sangue periferico intero tramite citometria a massa

Summary

Qui descriviamo un approccio proteomico di singola cellula per valutare immunitario fenotipica e funzionale (induzione di citochine intracellulari) alterazioni nei campioni di sangue periferico intero, analizzati tramite citometria a massa.

Abstract

Citochine svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi delle malattie autoimmuni. Quindi, la misurazione dei livelli di citochine è stata al centro di molteplici studi nel tentativo di capire i meccanismi precisi che portano alla rottura della tolleranza al self e autoimmunità successive. Approcci finora sono stati basati sullo studio di un aspetto specifico del sistema immunitario (un singolo o pochi tipi di cellule o citochine) e non offrono una valutazione globale della malattia autoimmune complessa. Mentre studi basati su sieri di pazienti hanno offerto importanti intuizioni autoimmunità, non forniscono la fonte cellulare specifica delle citochine dysregulated rilevate. Un approccio globale di singola cellula per valutare la produzione di citochina in più sottoinsiemi di cellule immuni, all'interno del contesto di "intrinseco" plasma paziente-specifici fattori, di circolazione è descritto qui. Questo approccio consente il monitoraggio del fenotipo immune paziente-specifici (marcatori di superficie) e funzione (citochine), sia nella sua nativa "intrinseco patogeni" malattia stata, o in presenza di agenti terapeutici (in vivo o ex vivo).

Introduction

Le malattie autoimmuni sono delle principali cause di morbilità e mortalità che colpisce 3-8% della popolazione. Negli Stati Uniti, disordini autoimmuni sono tra le principali cause di morte tra le donne giovani e di mezza età (età < 65 anni)^1,2. Disordini autoimmuni sono caratterizzati dalla presentazione clinica eterogenea e diversificati processi immunologici sottostanti. Lo spettro di eterogeneità è ben rappresentato in diversi disturbi, come la partecipazione unita nell'artrite reumatoide (RA) e malattia neurologica nella sclerosi multipla (MS). Tuttavia, questo livello di eterogeneità è esemplificato anc....

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da il Colorado più istituzionale Review Board (COMIRB) dell'Università del Colorado. Tutte le procedure descritte qui sotto dovrebbero essere effettuate in un cappuccio sterili per coltura, salvo diversa indicazione, con puntali filtrata, e tutti i reagenti filtrata.

1. preparazione dei reagenti per la lavorazione del sangue intero periferico

1. Preparare ruxolitinib stock aliquote (10 – 15 μL/flaconcino monouso) a 10mm diluendo il reagente liofilizzato in DMSO secondo le istruzioni del produttore (conservare a-80 ° C). Mantenere le concentrazioni di DMSO in tutte le analisi compreso ....

Results

Nella figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro per la stimolazione e l'elaborazione dei campioni di sangue periferico, compresa l'assegnazione di aliquote del campione di sangue, temporizzazione dell'aggiunta di agenti di stimolazione, proteina trasporto inibitore cocktail e incubazione volte fino alla lisi di globuli rossi (RBC) e la fissazione. La scelta degli agenti stimolanti dipenderà le vie di segnalazione e citochine che sono mirate per la valutaz.......

Discussion

Qui descriviamo un romanzo, unicellulare, approccio proteomico per valutare contemporaneamente più tipi di cellule immunitarie e rilevare le loro varie perturbazioni di citochina nell'ambiente del paziente specifico "patogeni" plasma sanguigno periferico fattori circolanti. Questo metodo utilizza sangue intero periferici come il veicolo analitico e citometria a massa come lo strumento per la valutazione di anomalie fenotipiche e funzionali cellulari immuni. Il metodo è facilmente applicabile a studi umani e topi

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ruxolitinib	Santa Cruz	SC-364729A	Conc. stock: 10 mM; Conc finale: 5 μ M
R848	Invivogen	tlrl-r848-5	Conc. di serie: 1 μ g/μ L; Conc finale: 1 μ g/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	Quantità di serie: 1 μ g/μ L; Conc finale: 0,1 μ g/mL
Tampone sterile PBS	Lonza	17-516F
Lyse/Fix BD	biosciences	558049	Stock Conc: 5X; Conc finale: 1X (diluito in ddH2O)
BD Tampone di perm/lavaggio al fosflusso I	BD biosciences	557885	Stock Conc: 10X; Conc finale: 1:10 (diluito in ddH2O)
RPMI	Gibco	21870-076
Azide di sodio (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032	Conc: >99,9%; Conc finale: 0,0002
Inibitore del trasporto proteico (PTI)	eBiosciences	00-4980-93	Conc: 500X; Conc finale: 1X
DNA Intercalator	Fluidigm	201192B	Conc. di serie: 500 μ M; Conc finale: 0,1 μ
Mezzi di colorazione per cellule M (CSM)			PBS + 0,5% BSA, 0,02% NaN3
MaxPar Barcode Perm	Buffer Fluidigm		201057 Stock Conc: 10X; Conc finale: 1X
20-plex Pd Barcode Set	Fluidigm	S0014	Stock Conc: n/a; Conc finale: n/a
EQ TM Perle di calibrazione a quattro elementi	Fluidigm	201078	Conc: 10X; Conc finale: 1X
16% Soluzione di formaldeide priva di MeOH	Thermo	28908	Stock Conc: 16% (p/v); Conc finale: 1,6% (p/v)
Tubi sterili in polistirene a fondo tondo	VWR	60818-496	Conc: n/a; Conc finale: n/a
Tubi cluster in polipropilene	Light Labs	A-9001	Stock Conc: n/a; Conc: n/a
Helios CyTOF instrument	Fluidigm	Helios Tutte	le soluzioni da utilizzare nell'analisi CyTOF devono essere prive di contaminazione metallica. ddH2O viene utilizzato nella preparazione di qualsiasi soluzione che deve avere una resistività di almeno 18,0 MΩ. cm. ddH2O e le eventuali soluzioni auto-preparate devono essere conservate in nuovi flaconi di plastica o vetro mai sterilizzati in autoclave.
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Anticorpi utilizzati per la citometria di massa
Marcatori di superficie
CD1c	Biolegend	L161	Massa: 161
CD3	BD	UCHT1	Massa: 144
CD4	Biolegend	SK3	Massa: 174
CD7	BD	M-T701	Massa: 149
CD8	Biolegend	SK1	Massa: 142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	Massa: 209
CD11c	BD	B-ly6	Massa: 152
CD15	BD	HI98	Massa: 115
CD14	Biolegend	M5E2	Massa: 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	Massa: 165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	Massa: 163
CD21	Biolegend	Bu32	Massa: 141
CD27	BD	L128	Massa: 155
CD38	Fluidigm	HIT2	Massa: 172
CD45 totale	Biolegend	HI30	Massa: 89
CD45RA	Biolegend	HI100	Massa: 153
CD56	Miltenyi	REA196	Massa: 168
CD66	BD	B1.1/CD66	Massa: 113
CD86	Fluidigm	IT2.2	Massa: 150
CD123	Fluidigm	6H6	Massa: 143
CD278/ICOS	Biolegend	C398.4A	Massa: 156
CD179/PD1	Biolegend	EH12.2H7	Massa: 162
IgD	Biolegend	IA6-2	Massa: 146
IgM	Biolegend	MHM-88	Massa: 151
CXCR5	BD	RF8B2	Massa: 173
HLADR	Biolegend	L243	Massa: 167
Citochine
IL-1&alfa;	Biolegend	364-3B3-14	Massa: 147
IL-1β	Bioleggenda	H1b-98	Massa: 169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	Massa: 157
IL-6	Biolegend	MQ2-13A5	Massa: 164
IL-8	BD	E8N1	Massa: 160
IL-12/IL-23p40	Biolegend	C8.6	Massa: 171
IL-17A	Biolegend	BL168	Massa: 148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	Massa: 176
MIP1β	BD	D21-1351	Massa: 158
MCP1	BD	5D3-F7	Massa: 170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	Massa: 175
IFNγ	Bioleggenda	4S. B3	Massa: 165
PTEN	BD	A2B1	Massa: 159
TNFα	Biolegend	Mab11	Massa: 166
Nota: Se il produttore è indicato come Fluidigm, questo anticorpo è stato acquistato da Fluidigm con metallo pre-coniugato. Se il produttore è indicato come diverso da Fluidigm, questo anticorpo è stato autoconiugato utilizzando l'etichettatura multi-metallo MaxPar. Kit (Fluidigm Cat: 201300) secondo il protocollo del produttore.