Method Article

Il TreadWheel: Protocollo di allenamento intervallo per delicatamente indotto da esercizio in Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/57788

⸱

June 8th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il TreadWheel utilizza il movimento rotatorio per indurre delicatamente esercizio in adulto Drosophila melanogaster sfruttando geotassi negativa, innata dei mosche. Per l'analisi delle interazioni tra fattori, come il genotipo, il sesso e dieta e loro effetto sui dosaggi fisiologici e molecolari ed esercizio permette di valutare la salute metabolica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'incidenza di malattie metaboliche complesse è aumentato a seguito di una diffusa transizione verso stili di vita di apporto calorico aumentato e livelli di attività abbassata. Queste malattie multifattoriali derivano da una combinazione di fattori genetici, ambientali e comportamentali. Una tale malattia complessa è la sindrome metabolica (MetS), che è un gruppo di disordini metabolici, tra cui l'ipertensione, l'iperglicemia e l'obesità addominale. Esercizio e intervento dietetico sono i trattamenti primari raccomandati dai medici per ridurre l'obesità e le sue malattie metaboliche successive. Intervento di esercizio, in particolare aerobica interval training, stimola i cambiamenti favorevoli nei comuni fattori di rischio per diabete mellito di tipo 2 (T2DM), malattia cardiovascolare (CVD) e altre condizioni. Con l'afflusso delle prove che descrive l'esercizio di effetto terapeutico ha sulla salute metabolica, che istituisce un sistema di modelli di esercitano in una regolazione controllata fornisce uno strumento prezioso per valutare gli effetti dell'esercizio in un contesto sperimentale. Drosophila melanogaster è un grande strumento per indagare i cambiamenti fisiologici e molecolari che derivano dall'intervento di esercizio. Le mosche hanno durate della vita breve e i meccanismi simili di metabolizzare le sostanze nutrienti rispetto agli esseri umani. Per indurre l'esercizio in Drosophila, abbiamo sviluppato una macchina chiamata il TreadWheel, che utilizza geotassi negativa, innata tendenza la Mosca a delicatamente indurre arrampicata. Questo consente ai ricercatori di effettuare esperimenti su larghe coorti di mosche geneticamente vari per comprendere meglio le interazioni genotipo-di-ambiente sottostante gli effetti dell'esercizio su salute metabolica.

Introduction

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Infanzia e adulti obesità stanno crescendo le epidemie nelle culture che consumano diete ad alto apporto caloriche e rimangano inattivo per lunghi periodi di tempo, che può portare a gravi conseguenze a lungo termine, tra cui l'insulino-resistenza, infiammazione cronica e artrosi 1 , 2 , 3 , 4. la prevalenza di questi disordini continua ad aumentare a causa dello squilibrio crescente apporto calorico e della spesa attribuita a elevato consumo di grassi e zuccheri e una vita prevalentemente sedentaria5. Corrispondentemente, questo squilibrio di energia ha portato ad un aumento dei casi di diabete mellito di tipo 2 (T2DM) e malattia cardiovascolare (CVD)5. Gli individui sono ad un elevato rischio di sviluppare entrambi i disordini se essi sono stati diagnosticati con disordine di sindrome metabolica (MetS), i cui sintomi includono l'obesità addominale e dislipidemia2. MetS è modellato da complesse interazioni tra genotipo e vari fattori ambientali, come la dieta ed esercizio6. Così, per ottenere una piena comprensione dei meccanismi di fondo di questa complessa malattia, tutti questi fattori devono essere considerati.

Quando si tratta di contrastare MetS, i medici raccomandano prima che subiscono cambiamenti di stile di vita che includono il consumo di una dieta sana, equilibrata e attività fisica2,7,8. Poiché i farmaci efficaci sono limitati e chirurgia di bypass gastrico è costosa e richiede un monitoraggio permanente del medico, intervento farmacologico e chirurgico è consigliato solo per i casi gravi e solo in combinazione con questi cambiamenti di stile di vita3 ,7,8. Mentre gli interventi di stile di vita, come esercizio fisico e dieta, è in grado di produrre e mantenere a lungo termine obiettivi di perdita di peso, o meno queste misure correttive completamente possono migliorare gli effetti negativi associati con MetS ha bisogno di ulteriore studio7, 8.

Modelli di mouse sono stati usati per esaminare gli effetti dell'esercizio su malattie metaboliche per anni; Tuttavia, l'introduzione di esercizio per volare ricerca il MetS è un relativamente recente endeavor9,10,11,12. Mosche forniscono il veicolo perfetto per studiare esercizio in un ambiente di laboratorio controllato, poiché essi sono facilmente manipolabili, hanno una durata breve, sono poco costoso da mantenere e vie metaboliche legate all'energia sono altamente conservati tra della drosofila e gli esseri umani13. D. melanogaster genomi sono ben caratterizzati, e c'è una ricchezza di strumenti di genetica disponibile per l'utilizzo in Drosophila che può fornire la comprensione in diversi genotipi e interazioni genotipo-di-ambiente che potrebbero modulare la effetto dell'esercizio sulla salute organismal14.

Attuali metodi di esercizio Drosophila richiamano tendenza della Mosca geotassi innata, negativo, l'istinto comportamentale a salire verso l'alto, per stimolare la scalata in adulti nell'ambito della loro recinzioni11,12,15 . La Power Tower, un metodo per stimolare esercizio in mosche, sistematicamente genera i recinti volare in verticale e poi cade loro indietro la superficie del banco, bussare efficacemente le mosche sul fondo del flaconcino, inducendo così loro istintuale geotassi negativa 12 , 16. esperimenti condotti utilizzando questa macchina ha mostrato che l'esercizio è un potente fattore protettivo contro molte malattie relative all'età, compreso CVD e T2DM e promuove l'invecchiamento sano12,17,18 . In particolare, hanno dimostrato che esercizio può ridurre l'insorgenza di declino senile mobilità in mosche e migliorare più sintomi relativi all'età, come prestazione cardiaca e lo stress risposta17,18. Tuttavia, controllo vola mai posizionato sulla Torre ha mostrata punteggi più elevati arrampicate rispetto quelli che avvertono la macchina, suggerendo che la forza delle gocce ripetitive può essere ferendo le mosche e che interessano la mobilità12. Questo suggerisce che un metodo alternativo di indurre esercizio che è meno forte ed evita che causa trauma fisico sarebbe un utile metodo complementare per la Power Tower protocollo16.

Per indurre delicatamente esercizio in Drosophila, abbiamo sviluppato una macchina di esercizio chiamata il TreadWheel (Figura 1). Il TreadWheel di (d'ora in poi abbreviato come TW) movimento rotatorio innesca la tendenza innata, negativo geotassi dei mosche ridefinendo costantemente alto gravitazionale delle fiale, che, a sua volta, stimola arrampicata nelle mosche. A differenza di altri metodi, il movimento di rotazione dei TW è intrinsecamente dolce, che riduce al minimo il numero di ulteriori fattori di stress che possono sorgere e influenzare i risultati. Così, la macchina fornisce i mezzi per indurre esercizio in gran numero di mosche senza indurre lo stress, che permetterà ai ricercatori di studiare gli effetti dell'esercizio su salute metabolica (Figura 2), invecchiamento, sonno e molti altri argomenti11.

Il nostro metodo segue un piramidale inverso, protocollo di allenamento intervallo, che in gran parte incorpora aspetti dell'intervallo aerobico (AIT) di formazione con qualche resistenza di addestramento di esercizio. Il regime standard di AIT è alterato in questo protocollo per aumentare gradualmente la durata di ciascun intervallo su un periodo di cinque giorni per promuovere la resistenza. AIT è stato particolarmente utile nel prevenire MetS rispetto a altri metodi di intervento ed era più efficace nell'inversione comuni fattori di rischio di sindrome metabolica rispetto continuo esercizio moderato19,20. Tuttavia, uno svantaggio di TW rispetto la Power Tower è che mosche habituate più rapidamente per il movimento di rotazione, così variazione nella tendenza innata a habituate tra le mosche può complicare l'interpretazione dei vantaggi di esercizio. 11 una soluzione elegante per questa limitazione è descritta da Watanabe e Riddle15 e loro complementari articolo21.

Protocol

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1. TreadWheel configurazione e funzionamento

Nota: Vedere Supplemental figura 1 per schemi su TW esercitare la costruzione di macchine. Le parti necessarie sono elencate nella Tabella materiali. Le frasi "TW", "TreadWheel", "macchina di esercitazione" e "macchina" è utilizzata in modo intercambiabile in tutto il protocollo.

  1. Calibrare motore mediante interruttore di alimentazione, tale che un periodo di rotazione completa è 15 s (4 giri). Calibrare la velocità di rotazione della macchina prima di collocarli fiale di volare nei morsetti protetti collegati a bracci rotanti.
    1. Regolare la velocità utilizzando un cronometro standard e un oggetto immobile temporaneamente collegato alla macchina, ad esempio un piccolo pennello nastrata per la copertura del motore con il pennello semplicemente toccando una delle staffe rotanti. Tempo il numero di rotazioni al minuto utilizzando l'oggetto immobile come un punto di riferimento e regolare la velocità per ottenere un periodo di rotazione s 15 (4 giri).

2. volare insieme e manutenzione

Nota: Tutte le mosche sono mantenute in un incubatore a 25 ° C con 50% di umidità e un ciclo di luce/buio di 12 h tra benchtop manipolazioni descritte di seguito. Mosche sono alimentati una dieta di laboratorio di farina di mais-melassa standard se non specificato diversamente.

  1. Preparare la posa alloggiamenti per ciascun genotipo di interesse utilizzando piastre di agar di succo di mela, una goccia di lievito pasta per piastra e 6 once bottiglie di plastica per raccogliere le uova che si schiudono in larve.
    1. Per preparare il succo di mela piastre di agar, riempire capsule di Petri 35 x 10 mm ¾-pieno con 3% agar sciolto in succo di mela comprato al supermercato. Conservare le piastre solidificate in frigorifero fino all'utilizzo.
    2. In una provetta conica per centrifuga 50ml, unire lievito secco attivo comprato al supermercato con acqua distillata ad un rapporto di 2 mL di acqua per ogni grammo di lievito. Mix di lievito con acqua per creare una pasta della consistenza di ketchup utilizzando un bacchetta di vetro. Regolare le proporzioni di acqua e lievito come necessario per ottenere la consistenza desiderata.
    3. Conservare la pasta di lievito in frigorifero tra usi. Tenere il cappuccio del tubo allentato per permettere la de-gassificazione.
    4. Utilizzare un ago appuntito o coltello per piccoli fori di perforazione in 6 once bottiglie di Piazza-basso (polipropilene) come fori di ventilazione per camere di posa.
    5. Tamponare un piccolo punto di pasta di lievito (~ 3 mm di diametro) su ogni piastra di agar di succo di mela.
  2. Posizionare le mosche adulte del genotipo desiderato in 6 once bottiglia e bottiglia del cappuccio con la piastra di agar di succo di mela. Fissare la piastra alla bottiglia con elastici. E posizionarlo in un incubatore per consentire gli adulti a deporre le uova.
  3. Cambiare piastre di agar di succo di mela su una camera di covata due volte al giorno (mattina e sera). Piastre di congedo utilizzato nell'incubatrice per altri 12 – 24 h consentire il primo instar larve alla schiusa.
  4. In primo luogo raccogliere instar larve utilizzando un sottile pennello o raccolta pick (flessibile sottile ago attaccato ad un manico). Mettere 50 primo instar larve di un genotipo specifico su una fiala di cibo del tipo di alimento sperimentale voluto sviluppare e metamorfosi completa mentre alloggiati nell'incubatrice (Figura 2A).
  5. Raccogliere gli adulti per il trattamento di esercizio (Figura 2A).
    1. All'impupamento, raccogliere le pupe con un pennello piccolo, umido e posto in flaconcini vuoti prima eclosion per impedire che venga esposto alla dieta larvale mosche adulte.
    2. Trasferimento mosche adulte a fiale di cibo della dieta lab standard come essi eclose. Uno a cinque giorni dopo eclosion, separare mosche basate sul sesso.
  6. Designato metà degli adulti raccolti ogni sperimentali e gruppi di controllo. Mantenere le mosche in fiale della dieta lab standard ad una concentrazione di 50 mosche per flaconcino.
  7. Trasferire gli adulti a fiale di cibo fresco ogni due giorni per impedire loro di rimanere bloccati durante l'esercizio. Aggiungere parecchi grani di lieviti vivi supplementari per il nuovo cibo immediatamente prima di introdurre le mosche.
    Nota: Mentre è possibile mantenere le mosche senza un supplemento di lievito vivo, abbiamo trovato che le mosche adulte comporta meglio con il completamento. Il completamento di lieviti vivi è una variabile che potrebbe essere modificata per soddisfare obiettivi sperimentali del ricercatore.

3. protocollo di allenamento

  1. Il primo giorno dell'esercizio (giorno 1), flaconcino push spine per lasciare 1 cm di spazio in controllo fiale e 6 cm di spazio tra il cibo e la spina in esercizio fiale (Figura 1).
    Nota: Le fiale di controllo avrà limitato spazio per mosche spostare mentre sulla macchina esercizio e così mosche si impegneranno in gran parte meno movimento rispetto a fiale di esercizio.
  2. Mettere le fiale nei morsetti e poi dare le mosche 10min di acclimatare sulla macchina (Figura 1B).
    Nota: Un controllo alternativo è quello di mantenere le mosche non esercitate sul banco adiacente alla macchina esercizio con 6 cm di spazio (in flaconcino) per muoversi normalmente. Risultati simili di esercizio riguardante sia la "1 cm il TreadWheel" e i controlli di "6 cm il benchtop" sono stati trovati11.
  3. Trattare sia il controllo ed esercizio Vola a rotazione sulla macchina a temperatura costante per 5 giorni consecutivi a settimana con periodi alternanti di rotazione e resto (Figura 1D).
    Nota: Una temperatura costante è necessaria per evitare gli effetti confondenti della temperatura sui livelli di attività. Per gli studi di manipolazione di temperatura, posizionare la TW all'interno di un'incubatrice per modificare trattamenti di temperatura durante il training.
    1. Eseguire la macchina per quattro periodi di 15 minuti di esercizio al giorno 1. Si alternano questi attacchi con periodi di riposo di 5 minuti.
    2. Ciascuno dei giorni seguenti, aggiungere 5 minuti di esercizio a uno dei periodi di esercizio preesistente. Ad esempio, il giorno 2, rendono il primo periodo di esercizio 20 min a lungo, ma mantenere il resto dei periodi a 15 min a lungo.
    3. Il giorno 3, esercizio Vola per 20 min durante i primi due periodi e 15 min per i seguenti due periodi.
    4. Il giorno 4, è possibile utilizzare periodi di esercizio di 20 min per tutti tranne l'incontro finale, che dovrebbe essere solo 15 min a lungo.
    5. Il giorno 5, mantenere tutti i periodi di esercizio 20 min a lungo.
      Nota: Durante i periodi di riposo, i flaconcini contenenti le mosche devono rimanere saldamente fissati su TW. L'orientamento delle fiale durante questi periodi non è rilevante perché la forza gravitazionale avvertita da tutte le mosche sarà venuta dalla stessa direzione.
  4. Dopo aver completato il trattamento di esercizio per un determinato giorno, tornano le spine del flaconcino di cibo alla posizione normale e tornare loro incubatrici mosche fino al giorno successivo.
  5. Dopo completamento del regime di pieno esercizio, anestetizzare utilizzando standard di mosche volano CO2 metodi di anestesia. Quindi trasferire mosche al nuovo cibo fiale o provette per microcentrifuga per la valutazione delle caratteristiche fenotipiche di interesse.
    Nota: Fenotipi di esempio includono arrampicata capacità (flaconcino di cibo), accumulo dei trigliceridi (tubo del microcentrifuge) o espressione genica (tubo del microcentrifuge). Il protocollo può essere messo in pausa qui con i campioni conservati in modo appropriato a seconda delle valutazioni deve essere eseguita. Saggi che coinvolgono vivente mosche dovrà essere prontamente condotto in conformità con gli obiettivi specifici dell'analisi fenotipica.

4. valutazione di arrampicata

  1. Dopo un giorno di riposo dopo il completamento del protocollo esercizio, generale volo arrampicata prestazioni utilizzando una rapida geotassi negativa iterativo (anello) di prova-come arrampicata geotassi negativa dosaggio22.
    1. Collocare i gruppi di 10 mosche in flaconcini vuoti usando CO2 anestesia (o toccando direttamente dal cibo fiale se già ordinati) e sigillare con la pellicola di paraffina per impedire la fuga di mosche. Dare le mosche almeno 10 min ad ambientarsi nel nuovo flacone. Per impedire il ribaltamento di fiale, un cerchio di cartoncino ~ 5 cm di diametro sul fondo del flaconcino per fornire extra superficie del nastro.
      Nota: Spine flaconcino non devono essere utilizzate perché esse ostacolino parte del flaconcino utilizzato per determinare l'altezza è salito.
    2. Posizionare le fiale 20 cm davanti a una griglia di 1 x 1 cm in piena vista di una telecamera montata, stazionaria con un timer incorporato (un telefono intelligente con un timer della fotocamera applicazione funziona bene).
    3. Toccare fiale delicatamente il contatore tre volte a bussare tutte le mosche verso il fondo del flaconcino. Dopo aver toccato il flaconcino giù la terza volta, immediatamente avviare il timer della fotocamera s 4 per catturare un'immagine per determinare l'altezza è salito da ogni fly.
      Nota: Toccando dovrebbe essere fatto a intensità costante e dal ricercatore stesso in ogni contrasto esercizio-controllo per minimizzare la variazione nelle risposte dei mosche a causa di intercettazioni.
    4. Ripetere il passaggio 4.1.3 due volte, con almeno 1 min di pausa tra le prove, per produrre un totale di tre prove per flaconcino.
  2. Per conservare le mosche per altre analisi, immediatamente dopo il dosaggio di arrampicata è stato completato, flash congelare le mosche per immersione in azoto liquido.
    1. Utilizzare un pallone dewar superficiale, aperta riempita di azoto liquido ad una profondità di circa 5 cm.
    2. Trasferire le mosche per microcentrifuga piccolo usando CO2 anestesia e quindi posizionare tubi nel pallone dewar riempito con azoto liquido. In alternativa, se future analisi richiedono l'evitare di CO2, snap congelare le mosche direttamente nel loro fiale arrampicate toccando delicatamente mosche al fondo del loro flaconcino mentre la parte inferiore è sommerso in azoto liquido e quindi trasferire le mosche congelate a microcentrifuga usando il forcipe.
      Nota: Azoto liquido è criogenico e deve essere utilizzato solo con adeguata ventilazione protettiva, attrezzatura e sala.
  3. Elabora le immagini utilizzando lo strumento di selezione del multi-punto23 ImageJ.
    1. Aprite un'immagine per l'elaborazione all'interno di ImageJ.
    2. Impostare una scala di 1 cm sulla base del libro di griglia di sfondo per calcolare la distanza percorsa in salita da ogni singolo volo. Utilizzare lo "strumento di linea" dalla barra degli strumenti da parte di un quadrato di 1 cm2 traccia dalla carta di griglia di sfondo. Fare clic sulla scheda "Analizza" e selezionare "Imposta scala". Impostare la "distanza noto" come "Unità di lunghezza" come 'cm' e '1.00' assicurarsi che "Globale" non è selezionata e fare clic su "OK".
    3. Selezionare l'icona "Multi-point selezione" dalla barra degli strumenti e zoomare sul fondo del flaconcino nell'immagine. Impostare il primo punto come il fondo del flaconcino facendo clic sulla parte più bassa del flaconcino.
    4. Clicca sul centro di ogni fly nel flaconcino per contrassegnarlo come un punto dati. Prendete nota che ci sono un totale di 11 punti per flaconcino, una marcatura il fondo del flaconcino e uno per ogni volo.
    5. Fare clic sulla scheda "Analizza" e selezionare "Misura" per generare una tabella dei valori misurati. Salva la tabella in un file csv.
    6. Aprire il file csv in un foglio di calcolo e calcolare la distanza esatta è salita da ogni fly sottraendo i valori y dei punti 2-11 dal punto 1 nella tabella dei valori misurati.
    7. Ripetere i passaggi da 4.3.1 attraverso 4.3.6 per ogni immagine.

5. trigliceride deposito Assay

Nota: I campioni, standard, soluzione standard di glicerolo e triglycerol soluzione di lavoro utilizzato durante tutto il test dovrebbe essere tenute su ghiaccio per tutta la durata del protocollo e devono essere conservati in frigorifero quando non in uso.

  1. Preparare gli standard utilizzando la soluzione Standard di glicerolo.
    1. Rendere il bianco (B) aggiungendo 1.000 µ l di tampone di omogeneizzazione a un tubo del microcentrifuge b.
    2. Rendere Standard 1 (S1), 2,5 mg/mL per pozzetto, aggiungendo 1.000 µ l della soluzione standard di glicerolo a un tubo del microcentrifuge etichettato S1.
    3. Rendere Standard 2 (S2), 1,25 mg/mL per pozzetto, aggiungendo 500 µ l di soluzione standard di glicerolo a 500 µ l di diH2O in un tubo del microcentrifuge etichettato S2.
    4. Rendere Standard 3 (S3), 0,625 mg/mL per pozzetto, aggiungendo 250 µ l della soluzione standard di glicerolo a 750 µ l di diH2O in un tubo del microcentrifuge etichettato S3.
    5. Rendere Standard 4 (S4), 0,3125 mg/mL per pozzetto, aggiungendo 125 µ l della soluzione standard di glicerolo a 875 µ l di diH20 in un tubo del microcentrifuge etichettato S4.
  2. Preparare soluzione di lavoro triglycerol dal Kit determinazione del trigliceride di siero.
    1. Aggiungere 40 mL di diH2O il reagente di glicerolo libero dal kit e miscelare capovolgendo la bottiglia.
    2. Aggiungere 10 mL di diH2O alla soluzione di trigliceride da kit e miscelare capovolgendo la bottiglia.
    3. Combinare la soluzione di reagente e del trigliceride di glicerolo e miscelare capovolgendo per preparare la soluzione di lavoro triglycerol.
      Nota: La soluzione di lavoro triglycerol è valida per 60 giorni e può completare quattro saggi di piastra a 96 pozzetti per kit utilizzando il protocollo sottostante. I volumi utilizzati sono proporzionalmente ridotto dal kit determinazione del trigliceride del siero ufficiale per l'uso nel formato piastra a 96 pozzetti.
  3. Verificare Blank e norme pipettando attentamente 5 µ l di ogni standard in un appartamento di 96 pozzetti a fondo, chiara micropiastra in triplice copia (o quadruplice copia per il bianco).
    1. Aggiungere esattamente 125 µ l di soluzione di lavoro di Triglycerol per ogni bene che contiene standard. Consentono soluzioni di reagire per 30 min.
    2. Posizionare una piastra a 96 pozzetti con uno spettrofotometro e leggere l'assorbanza a 540 nm. Utilizzare le misure di assorbanza per creare una curva standard e verificare l'esattezza degli standard di valutazione del valore di2 R. Se R2 per gli standard è minore di 0,98, ripreparare più attentamente gli standard.
  4. Iniziare 1 giorno del dosaggio per trigliceride deposito14 utilizzando provette microcentrifuga contenenti 10 congelati Vola ciascuno.
    Nota: Una pipetta multicanale o a ripetizione non dovrebbe mai essere utilizzata in questo passaggio perché gli importi di ciascun reagente usato per il test devono essere molto accurata e coerente per ottenere risultati riproducibili. Nella nostra esperienza, pipette multicanale e ripetere non hanno questo grado di precisione e coerenza. Ogni aliquota da una pipetta monocanale può essere visivamente confermata dallo sperimentatore per controllo di qualità e qualsiasi pregiudizi specifici per pipetta monocanale saranno sperimentati da tutti i campioni allo stesso grado.
    1. Preparare un brodo di 200 mL di tampone di omogeneizzazione combinando 0,272 g di KH2PO4, 400 µ l di EDTA 0.5 M e 199,6 mL di diH2O in una bottiglia di vetro.
    2. Aggiungere esattamente 100 µ l di tampone di omogeneizzazione per ciascuna delle 40 provette microcentrifuga contenente 10 adulti congelati dopo l'analisi di arrampicata. Poi, centrifugare i campioni per 30 s a 18.000 g.
    3. Macinare Vola utilizzando una smerigliatrice motorizzata e pestello (o un'altra forma di omogeneizzazione del tessuto) per preparare una soluzione lattiginosa. Assicurarsi che un pestello fresco viene utilizzato per ogni campione. Poi, centrifugare i campioni per 2 min a 18.000 g.
    4. Pipettare solo il top 75 µ l di liquido supernatante da ciascuna provetta in nuove provette per microcentrifuga. Assicurare che nessun bit volo dal pellet è trasferito. Posto nuovi tubi in frigorifero durante la notte.
  5. Iniziate la giornata 2 del protocollo del trigliceride rimuovendo 1 giorno campioni dal frigorifero.
    Nota: Passaggio 5.5 può essere eseguita lo stesso giorno come 5.4 ma abbiamo trovato il segnale per la concentrazione di trigliceridi essere più robusto dopo una notte in frigorifero. Tuttavia, il tempo tra passaggi 5.4 e 5.5 non deve superare 36 h.
    1. (Opzionale) Vortice nella prima provetta con liquido surnatante per 10 s e pipetta 5 µ l in una microcentrifuga pulito. Aggiungere 95 µ l di 0,15 M di NaCl nel nuovo tubo del microcentrifuge. Memorizzare questi sottocampioni nel congelatore da-20 ° C per una successiva analisi della proteina, se lo si desidera.
      Nota: Questi campioni del surnatante con la soluzione di NaCl aggiunta possono essere utilizzati per determinare il contenuto di proteine usando analisi preferito del ricercatore. Utilizziamo il metodo di Bradford24. Il contenuto proteico è un modo per standardizzare la misura del contenuto di trigliceridi, ma il ricercatore dovrebbe anche essere cauto nell'interpretare questi rapporti dal esercizio e dieta può anche interessare il deposito di proteine.
    2. Per le fiale di surnatante originale, vortice nella prima provetta con liquido surnatante per 10 s, quindi dispensare 5 µ l in due pozzetti separati di una micropiastra a 96 pozzetti per produrre tecniche replica. Essere sicuri di nota quali pozzi sono utilizzati per ciascun campione. Ripetere questo passaggio per gli altri 39 tubi.
    3. Dispensare esattamente 5 µ l di bianco nei quattro pozzetti della micropiastra, e per i restanti pozzetti, pipettare esattamente 5 µ l di ogni standard in triplice copia.
    4. Aggiungere la soluzione di lavoro triglycerol esattamente 125 µ l a ciascun pozzetto e consentire la soluzione di reagire per 30 min.
    5. Posizionare la piastra a 96 pozzetti con uno spettrofotometro e leggere l'assorbanza a 540 nm.
    6. Convertire i valori di assorbanza in concentrazione (mg/mL) utilizzando la curva standard calcolata dagli standard.

Results

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Siamo particolarmente interessati a individuare i fattori che contribuiscono alla salute nel complesso metabolica di un individuo. Si è constatato in precedenza che interazioni genotipo-di-dieta contribuiscano sostanzialmente alla variazione di livello di popolazione in tratti metabolici14. Ciò significa che ciascun genotipo risponde alle differenze ambientali in un modo unico e complesso. Per estendere il nostro lavoro sugli effetti del genotipo di ambiente per includere l'esercizio fisico, abbiamo sviluppato il TreadWheel, che è in grado di esporre i grandi numeri di genotipi di intervallo aerobico (AIT) di formazione in un modo ad alta velocità.

Per stabilire se l'esercizio su TW influenzata tratti metabolici, abbiamo misurato accumulo dei trigliceridi in Oregon-R (OreR) e y1w1 mosche, comune wildtype (Figura 2B – C) e quei valori contro le mosche normalizzati concentrazione di proteine, come inizialmente riferito a Mendez et al. 11. abbiamo analizzato i dati di analisi multivariata della varianza (MANOVA) pari al genotipo, sesso, esercitare il trattamento (e le loro interazioni), e gli effetti di blocco sperimentale come tempo replicati e cibo fiala e scoperto che c'era un significativo l'interazione genotipo-di-esercizio (p = 0,0017) che interessano accumulo dei trigliceridi. C'era un effetto significativo di dimorfismo sessuale tra maschi e femmine, con i maschi memorizzazione più trigliceridi rispetto alle femmine (p < 0.0001). Abbiamo visto che nelle femmine, esercitati mosche erano significativamente più bassi livelli del trigliceride rispetto ai loro omologhi inoptati (Figura 2B, p < 0,0001). Nei maschi, mentre la diminuzione nell'accumulo dei trigliceridi osservata in Oregon-R esercitato mosche (rispetto ai comandi) non era statisticamente significativa, una differenza significativa nell'accumulo dei trigliceridi è stata osservata fra le due righe separate (Figura 2C, p < 0,0001). Notare che, mentre la standardizzazione della concentrazione di trigliceridi rispetto alla concentrazione di proteina fornisce insight sul corpo nel complesso Vola rapporti di composizione, può fornire anche confronto di concentrazione del trigliceride o proteina diretta tra i diversi gruppi di mosche informazioni specifiche sugli effetti dell'esercizio su questi fenotipi individualmente.

Poiché le variabili come esercizio adulto, sesso, e genotipo sono mostrato di influenzare l'accumulo dei trigliceridi, ci si aspettava che questi fattori anche altri fenotipi di impatto e interagiscono con la dieta. Abbiamo raccolto le larve da un rappresentante wildtype Drosophila genetica riferimento pannello riga (DGRP 153)25 su o un alto contenuto di grassi o normale dieta ed esercizio indotta in mosche adulte per una settimana (Figura 2A). Successivamente, abbiamo effettuato un'analisi di anello-come geotassi negativa per misurare la capacità di arrampicata. Il saggio di arrampicata utilizzato ha differito da un test standard di anello; invece di un apparato di anello, fiale con pellicola di paraffina che copre le aperture erano utilizzate per mosche domestiche durante il dosaggio. Altri aspetti del test anello originale, come il tempo tra toccando le mosche sul fondo del flaconcino e scattare la foto, sono stati mantenuti22.

Tutti i trattamenti sono stati ripetuti tre volte separate con un minimo di 59 mosche individuali a tempo replicare e trattamento. Dati sono stati analizzati dalla contabilità MANOVA per dieta, genotipo, sesso, esercitare il trattamento (e le loro interazioni), così come effetti di blocco sperimentale del tempo replicare, flaconcino di dosaggio e flaconcino saggio replicare. Abbiamo trovato che le femmine esercitate è salito significativamente superiore (p < 0,005) quando allevati sulla dieta grassa alta rispetto a tutti gli altri trattamenti femminili (Figura 2D). Per i maschi, si è visto che esercizio migliorata solo arrampicata quando i maschi sono stati sollevati sulla dieta normale, e quelli sollevati sulla dieta grassa alta ha mostrata alcun cambiamento significativo (Figura 2E). Abbiamo anche trovato significativi effetti sessualmente dimorphic (p < 0,0001) in arrampicata con maschi salire più in alto rispetto alle femmine. Il sorprendente risultato di una diminuzione in arrampicata prestazioni dopo l'allenamento per le femmine dalla riga 153 DGRP (Figura 2D) per le donne che consumano una dieta normale (p < 0,0001) è un esempio di come questo tipo di esercizio non può essere un uniformemente positivo intervento per tutti i genotipi e potrebbe dipendere da altri fattori ambientali. In Mendez et al. 11, le femmine da quattro altre linee genetiche testati per la loro performance in arrampicata dopo essendo stata sollevata su un normale dieta tutti hanno mostrata capacità di arrampicata avanzata con l'allenamento fisico. Ciò suggerisce che la risposta osservata in DGRP 153 è genotipo-specifici e non una proprietà generale del trattamento esercizio TW. La variabilità nella risposta tra sesso, dieta e gruppi di trattamento esercizio indica che ci sono interazioni significative di sesso di dieta e di esercizio che colpisce la capacità di arrampicata della linea (p < 0.0001).

Presi insieme, i risultati indicano che l'impatto dell'esercizio sulla salute metabolica di una mosca adulta può essere una funzione del suo sesso, genotipo e dieta larvale. La variazione fenotipica osservata in risposta al genotipo, le variabili di ambiente (ad es., dieta ed esercizio fisico) e il sesso è stato osservato anche in altri studi11,12,14,15. Così, la TW e Drosophila può essere una strategia potente per delucidare i fattori genetici e ambientali che modella la salute metabolica.

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Figura 1 : The TreadWheel esercizio macchina. (A) la macchina contiene 48 fiale e ha una funzione di velocità regolabile. Qui gli esperimenti sono stati eseguiti a 4 giri. (B) alimenti singoli flaconi contenenti le mosche sperimentale sono andate a ruba in staffe attaccati ad un asse rotante. Cibo e spina (C) la distanza tra flacone era 6 cm per esercizio flaconcini e 1 cm per controllo fiale. Le fiale sono stati poi collocate sulla macchina per esercizio. Regime di (D) l'esercizio di piramide inversa di 5 giorni è stato utilizzato per esercitare le mosche adulte. Cinque minuti di ogni giorno, un ulteriore è stato aggiunto a uno dei periodi di esercizio a rampa di intensità dell'esercizio fisico in modo incrementale, quali modelli di resistenza, intervallo di allenamento. Questa figura è stata modificata da Mendez et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2 : Metodi visivi e risultati rappresentativi. (A) metodi per testare la dieta larvale e adulto esercizio effetti di interazione. Larve erano sollevate sulla dieta grassa o normale alta del laboratorio e commutate al cibo normale su eclosion. Mosche adulte sono stati separati per sesso, inseriti in gruppi sperimentali ed esercitati per cinque giorni consecutivi. In seguito, un anello-come negativo geotassi arrampicata analisi è stata condotta, e mosche sono stati congelati per misurazioni del trigliceride. Sono mostrati i dati rappresentativi del trigliceride per due linee genetiche, Oregon R e y1w1 per (B) le femmine e i maschi (C). Tutte le mosche erano allevate su una dieta normale ed esercitate in età adulta. Livelli con diverse lettere sono significativamente differenti (p < 0,05) utilizzo di uno studente post hoc, t-test. Questa figura contiene un sottoinsieme dei dati trasmessi nel Mendez et al. 11. dati rappresentativi di arrampicata sono mostrati per riga 153 DGRP per (D) le femmine e i maschi (E). Ogni punto rappresenta la media performance in arrampicata di 232 o più individui attraverso tre punti temporali indipendenti. Barre di errore indicano un errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Supplementare figura 1: la piantina dettagliata del TreadWheel. (A) diagramma della struttura morsetto doppio flaconcino utilizzato per collegare fiale alla macchina. (B) vista all'interno del sistema di rotazione unità di macchina. (C) proiezione parallela della faccia anteriore della macchina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File di codice supplementare: TreadWheel.skp Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

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Il protocollo di allenamento dettagliato qui ha dimostrato di stimolare correttamente la ginnastica dolce in Drosophila e può essere utilizzato per simulare l'esercizio di resistenza in un laboratorio controllate l'impostazione11. Va notato che quando inizialmente sviluppando il concetto di TreadWheel, abbiamo considerato prodotti commerciali che possono essere modificati per eseguire allo stesso modo (per esempio, una rosticceria di laboratorio). Tuttavia, abbiamo in definitiva respinto questo approccio, scegliendo un design su misura perché l'apparecchiatura commerciale non ha avuto una velocità sufficientemente bassa (4 giri) e mancava di capacità sufficiente flaconcino per la generazione di alto-rendimento del campione.

Il protocollo TW stesso può essere regolato fino a comprendere una vasta gamma di argomenti di ricerca. Per esempio, regolando la frequenza e la durata dei regimi di esercizio dei mosche può alterare le intensità di outs del lavoro che ricevono. Estendendo il protocollo più lungo di una settimana o ad altri gruppi di età, sarebbe possibile studiare gli effetti dell'esercizio su invecchiamento e varie malattie età-correlate. Si consiglia che se un approccio esteso esercizio viene implementato, quindi almeno un giorno di riposo alla settimana deve essere aggiunto per consentire il recupero. Performance e miglioramento è stato indicato per essere maggiore nei regimi che comprendeva una giornata di recupero rispetto a quei regimi che usato consecutivi quotidiano esercizio12. Abbiamo anche, vorrei mettere in guardia contro la proroga esercizio bout lunghezze ultimi 30 min dal momento che l'assuefazione al movimento rotazionale può verificarsi dopo lunghi periodi di continuo esercitano11. Abbiamo anche osservato variazioni genetiche nella motivazione dei mosche per mantenere i loro livelli di attività su TW11. Quindi, se più lunghi periodi sono desiderati, considerare monitoraggio livelli di attività dei mosche, così come presentato da Watanabe e Riddle15,21 descrivendo loro modificazione del concetto TW. Altri fattori che potrebbero essere variati comprendono temperatura e modelli, che sono indicati per interessare anche fly movimenti26,27di sonno-risveglio.

C'è una pletora di analisi disponibili durante e dopo il completamento del protocollo per affrontare gli effetti dell'esercizio a livello fisiologico, comportamentale e molecolare, nonché il potenziale per svelare effetti epigenetici di esercizio. Ulteriori saggi metabolici (per esempio, glucosio, glicogeno e proteine), le prestazioni cardiache e risposta infiammatoria misure possono essere utilizzati per esplorare ulteriormente l'esercizio di effetto ha su volare fisiologia e corpo composizione12,14 ,24,28. Vari cambiamenti comportamentali associati ad induzione di esercizio, quali i cambiamenti nel comportamento, attività locomotrice e sonno, di alimentazione possono anche essere misurati utilizzando strumenti come il CAFE dosaggio29 o l'attività di monitoraggio dispositivi12,15 ,30. Cambiamenti nell'espressione genica e respirazione cellulare attribuito per esercitare possono essere quantificate anche utilizzando metodi come qRT-PCR11 e respirometry31. Infine, Drosophila hanno preziose risorse genetiche disponibili, come il pannello di riferimento di genetica della drosofila 2 e la risorsa di popolazione sintetica di Drosophila che forniscono ai ricercatori la piattaforma per eseguire studi di genetica quantitativa25,32. Questi strumenti consentono a esperimenti di mappatura, come mappatura del Genome-Wide Association Studies e Quantitative Trait Loci, per identificare loci candidati associati di dieta ed esercizio fisico.

Studi completati utilizzando il TreadWheel ha dimostrato che, in media, esercizio diminuisce il peso corporeo, accumulo totale dei trigliceridi e glicogeno, mentre aumentando il contenuto di proteine e arrampicata prestazioni11. Ulteriormente, ci erano risposte variabile all'esercizio fisico tra i sessi e genotipi per peso corporeo, così come i trigliceridi, proteina, glicogeno, glucosio e attività livelli11,15. Mentre la variabilità della risposta all'esercizio fisico e dieta tra genotipi e sesso può essere difficile da interpretare e, a volte, controintuitivo, essa riflette le fonti di variazione reale biologica osservata nelle popolazioni naturali. Come ci sforziamo di capire la diversità dei fattori sottostanti che contribuiscono ai tassi alti di MetS, strumenti che facilitano la districante il ruolo relativo dei vari fattori che contribuiscono testando questi fattori in organismi modello sarà fondamentali per la nostra capacità per sviluppare interventi di prevenzione e trattamento personalizzati. Per valutare appieno l'efficacia dell'esercizio, ciascuno di questi fattori e come interagiscono fra loro deve essere considerato quando lo svolgimento di esperimenti e la formulazione di conclusioni.

La TW, come maggior parte delle altre macchine esercizio volare, è limitata nella sua capacità di quantificare volare. Recentemente, Watanabe e Riddle ha sviluppato il rotante esercizio quantificazione sistema (Rich), un backbone TW modificato con un'attività di monitoraggio unità (LAM25H) dal sistema di monitoraggio della drosofila serie15,21. Come la TW, questo sistema utilizza il moto rotatorio per indurre delicatamente esercizio mentre usando il braccio LAM25H per monitorare e quantificare le attività di volare, ma contiene un minor numero di flaconcini (32 fiale) rispetto al TW15. Per gli studi di esercizio ad alta velocità, se la quantificazione di attività non è necessaria o desiderata, la TW consente un maggior numero di campione. Il design TW potrebbe essere modificato anche dalla sua attuale forma per ospitare un maggior numero di flaconcini. Questo sistema, insieme ad altri metodi di esercizio esistenti, ha contribuito a stabilire che l'esercizio non solo è realizzabile in Drosophila ma possa anche essere studiata per determinare l'effetto di attività fisica su una varietà di risposte fisiologiche e molecolari 11,12,15. Così, la TW, come un metodo provato di indurre la ginnastica dolce in mosche, utilizzabile per una grande varietà di domande biologiche della sonda.

Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laura Mafla, Olivia Fish e il resto del laboratorio Reed per il loro aiuto con allevamento di volare ed elaborazione di immagini. Sean Mendez costruito il TreadWheel originale con l'assistenza di officina meccanica UAB. Finanziamenti per questo studio è stato fornito da NIH-R01 GM 098856 LKR Undergraduate creatività e Accademia di ricerca presso l'Università di Alabama a KEL e BJW.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiali per la costruzione della ruota di pedale:
Supporto di livellamento antivibrante per impieghi gravosiMcMaster-Carr60855K71Quantità: 4
cuscinetti a sfera in acciaio inossidabileMcMaster-Carr57155K306Quantità: 8
trasformatori di tensione plug-in (500MA, ingresso 120VAC, uscita 24 VAC)McMaster-Carr70235K16Quantità: 1
Motoriduttore DC compatto a faccia quadrataMcMaster-Carr6409K23Quantità: 1
Portautensili (morsetti)McMaster-Carr1723A22Quantità: 5 (10x)
12L14 Asta in acciaio al carbonio con tolleranza strettaMcMaster-Carr5227T24Quantità: 1
Collare albero vite di fermoMcMaster-Carr6432K13Quantità: 8
Puleggiaa cinghia tondaMcMaster-Carr6284K51Quantità: 5
Controlli per freccette - 25 giri max, motore elettrico AC DCMcMaster-Carr13DV 1AQuantità: 1
Materiali per la manutenzione e l'allevamento delle mosche
oz Bottiglie a fondo quadrato (polipropilene)Genesee Scientific32-130Quantità: 1
35x10mm Petri PlatesVWR82050-536Quantità: 1
fiale strette di DrosophilaGenesee Scientific32-116Quantità: 1
Flystuff FlypadGenesee Scientific59-114Quantità: 1
cerbottana, MiniGenesee Scientific54-104Quantità: 1
Materiali per test ad anello:
ImageJ softwareNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/Quantità: 1
1 cM di carta millimetrata o griglia disegnata (almeno 20 cM per 30 cM)variQuantità: 1
fotocamera digitale con timer o smartphone con fotocamera timer appvariQuantità: 1
Materiali per il dosaggio dei trigliceridi:
Dewar PalloneVWR14200-960Quantità: 1
determinazione dei trigliceridi siericiSigma AldrichTRO100Quantità: 1
Pestello a batteriaVWR47747-370Quantità: 1
PestelloVWR47747-358Quantità: 1
6 Kit per la

References

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Drosophila melanogasterTreadWheel ExerciseInterval Training ProtocolMetabolic Health AssessmentTriglyceride Storage AnalysisNegative Geotaxis AssayLive Yeast SupplementationVariable Speed MotorExperimental Design SetupGenotype Environment Interaction

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