L'articolo descrive un protocollo ottimizzato per fare fette di tessuto vitale del cervello-ipofisi, utilizzando il medaka pesci teleostei (Oryzias latipes), seguita da registrazioni elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie utilizzando la tecnica del patch-clamp con il configurazione di patch perforato.
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Articolo metodologico
Fette di cervello-ipofisi sane per le indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in pesci teleostei
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sono state condotte indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in numerose specie di vertebrati, ma molto pochi in pesci teleostei. Tra questi, la netta maggioranza è stata effettuata su cellule primarie dissociate. Per migliorare la nostra comprensione di come Teleostei cellule ipofisarie, si comportano in un ambiente più biologicamente rilevante, questo protocollo viene illustrato come preparare fette di cervello-ipofisi vitali utilizzando il medaka (Oryzias latipes) di piccoli pesci d'acqua dolce. Rendendo le fette di cervello-ipofisi, pH e osmolalità di tutte le soluzioni sono stati adeguati ai valori trovati nei liquidi corporei di pesci d'acqua dolce che vivono a 25-28 ° C. Dopo la preparazione della fetta, il protocollo viene illustrato come effettuare registrazioni elettrofisiologiche usando la tecnica perforata della intero-cellula patch-clamp. La tecnica del patch-clamp è un potente strumento con risoluzione temporale senza precedenti e sensibilità, che permette di indagine delle proprietà elettriche da cellule intatte tutta giù per canali ionici singolo. Patch di perforata è unico in quanto mantiene l'ambiente intracellulare intatto impedendo elementi regolatori nel citosol di essere diluito la soluzione di elettrodo pipetta patch. Al contrario, quando si eseguono registrazioni della intero-cellula tradizionale, è stato osservato che cellule ipofisarie medaka perdono rapidamente la capacità di potenziali di azione del fuoco. Tra le varie tecniche di perforazione disponibili, questo protocollo viene illustrato come ottenere la perforazione della membrana con patch utilizzando il fungicida anfotericina b.
Introduzione
L'ipofisi è un organo endocrino chiave nei vertebrati situati sotto l'ipotalamo e posteriormente al chiasma. Produce e secerne ormoni di sei-otto dai tipi cellulari specifici. Ormoni ipofisari costituiscono un intermedio tra il cervello e gli organi periferici e pilotare un'ampia gamma di processi fisiologici essenziali tra cui la crescita, la riproduzione e la regolazione dell'omeostasi. Simili ai neuroni, cellule endocrine dell'ipofisi sono eccitabili elettricamente con la capacità di fuoco spontaneamente i potenziali di azione 1. Il ruolo di questi potenziali di azione è cella dipendente. In diversi tipi di cellule dell'ipofisi dei mammiferi....
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Protocollo
Tutti gli animali gestione è stata eseguita secondo le raccomandazioni per la cura e il benessere degli animali di ricerca presso l'Università norvegese di Scienze della vita e sotto la supervisione di ricercatori autorizzati.
1. preparazione di strumenti e soluzioni
Nota: Tutte le soluzioni devono essere sterili. Attenzione occorre prestare attenzione per il pH e l'osmolalità (osmol/kg di acqua) di tutte le soluzioni, che dovrebbe essere attentamente adattato all'ambiente extracellulare delle specie studiate. pH e osmolalità deve essere regolati con precisione apparecchiature elettroniche, quali pH-metro e punto d....
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Risultati
Questo protocollo viene illustrato un protocollo passo dopo passo di come realizzare registrazioni elettrofisiologiche affidabile dalle cellule di ipofisi (gonadotrope), utilizzando una linea transgenica di medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] dove il bersaglio delle cellule (produzione di Lh gonadotropes) sono etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP).
Inizialmente, le indagini elettrofisiologiche sono stati condotti .......
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Discussione
Le registrazioni elettrofisiologiche usando la tecnica del patch-clamp su fettine di cervello-ipofisi richiedono attenta ottimizzazione. Protocolli ben ottimizzati per lo svolgimento di indagini di cellule vive specificamente in teleostei sono limitati, con la maggior parte delle pubblicazioni che utilizzano protocolli basati su sistemi mammiferi. A questo proposito, è importante essere consapevoli del fatto che diversi parametri fisiologici come pH e osmolalità sono non solo specie dipendente, ma anche molto dipende se .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Ringraziamenti
Grazie Sig. ra LourdesCarreon G Tan per il suo aiuto mantenere la struttura di medaka e Anthony Peltier per le figure illustrative. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU e dal Consiglio della ricerca della Norvegia, grant numeri 244461 (programma di acquacoltura) e 248828 (programma di vita digitale Norvegia).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Colla chirurgica | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Adesivo tissutale |
| Lame in acciaio inox | Campden Instruments | 752-1-SS | |
| Arpa | SAKURA | 4122 | |
| Warner instruments | 64-1417 | ||
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| Pipette per patch ultrapure LMP agarosio | invitrogen | 166520-100 | |
| Strumento Sutter | BF150-110-10HP | Borosilicato con filamento O.D.: 1,5 mm, I.D.: 1,10 mm | |
| Microscopio Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
| P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
| Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
| Amplificatore Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
| GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH sale di trifluoroacetato |
| estrattore di pipette | Sutter Instrument | P-1000 | |
| amfotericina B | SIGMA | A9528 | antibiotico |
| polietilenimmina | SIGMA | P3143 | 50% PEI soluzione |
| microfiler siringa | WPI | MF28 / g67-5 | |
| vetro per il ponte agar | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicato con filamento O.D.: 2,0 mm, I.D.: 1,16 mm Lucidato a fuoco |
| Software | di microscopia open source | ||
| optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
| sonicatore | Elma | D-7700 singen | |
| NaCl | SiGMA | S3014 | |
| KCl | SiGMA | P9541 | |
| MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
| D-Glucosio | SiGMA | G5400 | |
| Hepes | SiGMA | H4034 | |
| CaCl< sub>2 | SiGMA | C8106 | |
| Saccarosio | SiGMA | 84097 | |
| D-mannitolo | SiGMA | 63565 | |
| MES-acido | SIGMA | M0895 | |
| BSA | SIGMA | A2153 |
Riferimenti
- Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
- Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trend....
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Ristampe e permessi
