Articolo metodologico

Differenziazione, manutenzione e l'analisi delle cellule dell'epitelio del pigmento retinico umano: un modello di malattia-in-un-piatto per le mutazioni BEST1

DOI:

10.3791/57791

⸱

24 agosto 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per differenziare cellule del pigmento retinico epitelio (RPE) da cellule staminali pluripotenti umane recanti mutazioni paziente-derivate. Le linee cellulari mutanti possono essere utilizzate per analisi funzionali tra cui immunoblotting, immunofluorescenza e patch clamp. Questo approccio di malattia-in-un-piatto aggira la difficoltà di ottenere cellule RPE umane native.

Abstract

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Anche se oltre 200 mutazioni genetiche nel gene BEST1 umano sono state identificate e collegate a malattie degenerative retiniche, i meccanismi patologici rimangono evasivi principalmente a causa della mancanza di un modello di buona in vivo per lo Studio BEST1 e sue mutazioni in condizioni fisiologiche. BEST1 codifica una scanalatura dello ione, vale a dire BESTROPHIN1 (BEST1), che funziona in epitelio retinico del pigmento (RPE); Tuttavia, l'accessibilità estremamente limitata alle cellule RPE umane native rappresenta una sfida importante per la ricerca scientifica. Questo protocollo viene descritto come generare umano RPEs recanti mutazioni malattia-causanti BEST1 di differenziazione indotta da cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs). Come hPSCs sono auto-rinnovabili, questo approccio permette ai ricercatori di avere una costante fonte di hPSC-RPEs per varie analisi sperimentali, quali immunoblotting, immunofluorescenza e patch clamp e quindi fornisce un modello di malattia-in-un-piatto molto potente per BEST1-associate condizioni della retina. In particolare, questa strategia può essere applicata per studiare la fisiologia RPE (patho) e altri geni di interesse espresso in modo nativo in RPE.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È stato documentato che almeno cinque malattie degenerative retiniche sono causate da mutazioni genetiche in BEST1 gene1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, con il numero di mutazioni segnalate già oltre 200 e ancora crescente. Questi BEST1-malattie associate, noto anche come bestrophinopathies, causano perdita progressiva della vista e persino cecità, e attualmente esistono cure efficaci. Il prodotto proteico del BEST1, vale a dire BESTROPHIN1 (BEST1), è un Ca2 +-canale attivato Cl– (CaCC) specificamente espresso nell'epitelio retinico del pigmento (RPE) dei occhi5,6, 8,9. D'importanza, un fenotipo clinico di BEST1-malattie associate è la risposta visiva ridotta a stimoli luminosi, chiamato light peak (LP) misurata nel electrooculogram10,11; LP è creduta per essere mediato da un CaCC in RPE12,13,14. Al fine di meglio comprendere i meccanismi patologici di mutazioni BEST1 e ad adoperarsi per potenziali terapie, è essenziale per lo studio di canali BEST1 mutati in modo endogeno espresse in cellule umane di RPE.

Tuttavia, ottenere RPE cellule direttamente dai pazienti dal vivo è altamente impraticabile. Anche se cellule RPE native possono essere raccolto dalle biopsie di cadaveri umani e feti, la difficile accessibilità a tali fonti limita notevolmente la ricerca scientifica. Pertanto, è fondamentale disporre di fonti alternative di RPE diverso da occhi umani. Questa chiamata è stata accettata dai recenti progressi nelle tecniche di cellule staminali, come cellule RPE funzionali possono ora essere differenziate da cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), tra cui le cellule staminali embrionali (hESC) e indotta da cellule staminali pluripotenti (hiPSCs), quest'ultimo Essendo generato riprogrammando fibroblasti primari della pelle da donatori16,17,18. D'importanza, l'auto-rinnovamento e pluripotenza di hPSCs garantiscono una fonte affidabile per generare RPEs, mentre la paziente-specificità di hiPSCs e potenziale genomico modificazione delle hESCs (ad es., da CRISPR) offrono un modello di malattia-in-un-piatto versatile per mutazioni BEST1 desiderate.

hPSC-RPE ha diversi vantaggi rispetto ai topi modelli RPE: 1) topi knockout BEST1 non visualizzare qualsiasi anomalia retinica19, sollevando la possibilità di diverse esigenze genetiche degli BEST1 in RPE tra topi e nell'uomo; 2) solo il 3% di cellule RPE sono binucleate, in contrasto con il 35% in topi20; 3) hiPSC-RPE rafforza il trapianto autologo in clinica trattamento della retina disturbi21. Tuttavia, modelli animali sono ancora indispensabili per lo studio di RPE fisiologia e patologia in un sistema live, e non può essere trascurato il potenziale oncogeno dei hiPSC.

La procedura qui descrive un hPSC utile e moderatamente semplice protocollo di differenziazione di RPE che può essere utilizzato per scopi clinici e di ricerca. Questo protocollo utilizza la nicotinammide (vitamina B3) per aumentare la differenziazione di hPSCs tessuto neurale, che è ulteriormente indotte a differenziarsi in RPE dal trattamento con activina-A. Trattamento di nicotinammide è stato indicato per aumentare il numero delle cellule pigmentate (un segno di differenziazione in RPE), possibilmente attenuando l'attività apoptotica di differenziare cellule22. Le celle di hPSC-RPE risultante visualizzato la stessi chiavi marcatori, ciottoli morfologia e funzionalità cellulare come nativo di cellule RPE22umana. Così, in un ambiente di ricerca, le cellule RPE hPSC risultante sono adatte per le analisi funzionali a valle compreso immunoblotting, immunostaining e cellule intere patch clamp, per cui dettagliate procedure sperimentali sono inoltre fornite. Clinicamente, le cellule RPE derivate da cellule staminali hanno dimostrato grande potenziale per il trattamento di trapianto di degenerazione maculare in entrambi gli studi sugli animali e le prove umane23.

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Protocollo

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1. differenziazione di hPSC a RPE

  1. Mantenere e passaggio hPSCs come precedentemente descritto18.
    Nota: Tutte le cellule (tra cui hPSCs e hPSC-RPEs) sono coltivate a 37 ° C 5% CO2 per tutta la durata dei protocolli di crescita e differenziazione.
  2. Prima differenziazione, dividere hPSCs confluenti a prepatinato piastre da 6 pozzetti.
    1. A cappotto piastre, scongelare matrice della membrana basale su ghiaccio per circa 1 h, sospendere la matrice frullato nel terreno DMEM di 4 ° C in un 01:50 diluizione, aggiungere la miscela di rivestimento 800 µ l in ogni pozzetto e incubare per almeno 1 h a 37 ° C.
    2. Quando il rivestimento è completo, aspirare la miscela e immediatamente aggiungere 1,5-2 mL di terreno nei pozzetti.
    3. Per sollevare hPSCs da vecchie piastre di coltura, incubare le cellule con PBS più 0,5 mM EDTA per 5 min a temperatura ambiente, aspirare la soluzione e risospendere le cellule in piccoli ciuffi con terreno di coltura.
    4. Cellule di seme al confluency di ~ 20% nelle nuove piastre.
      Nota: Conservare la matrice della membrana basale in aliquote di 100 µ l a-20 ° C e utilizzare un'aliquota per rivestire una piastra a 6 pozzetti. Il tempo per il rivestimento può essere esteso fino a 4 h a 37 ° C, o una notte a temperatura ambiente. È importante sospendere e seme hPSCs come piccoli ciuffi di 3 – 5 cellule piuttosto che singole cellule.
  3. Quando le cellule sono coltivate a pieno confluency, sostituire il terreno di coltura con mezzo di differenziazione (4 mL/pozzetto) (tabella 1, senza activin-A). Cultura per 14 giorni, cambiando il mezzo (4 mL/pozzetto) 3x / settimana.
    Nota: La hPSC piastra densità raddoppia circa ogni 24 h. morte cellulare significativo è previsto dopo l'inizio della procedura di differenziazione. Aggregati di cellule morte e detriti nei pozzetti possono essere visto ad occhio nudo durante i cambi medi.
  4. Dal giorno 15 al giorno 28, supplemento mezzo di differenziazione con 100 ng/mL umani activina-A (tabella 1, con umani activina-A). Cambiare il mezzo (4 mL/pozzetto) 3x / settimana.
  5. Interrompere il completamento di activina A partire il giorno 29 (tabella 1, senza umano activina-A). Continuare la messa in coltura delle cellule nel mezzo di differenziazione per 8 – 10 settimane fino a quando appaiono i cluster pigmentate hPSC-RPE (Figura 1A-B).
    Nota: I mazzi delle cellule pigmentate possono essere visualizzati come piccoli punti scuri su una piastra di coltura delle cellule (Figura 1A-B, in alto) ad occhio nudo. Singole cellule pigmentate con la forma di ciottoli di firma possono essere visto sotto un microscopio 20x (Figura 1A-B, in basso).

2. isolamento e coltura di cellule RPE differenziato

  1. Rimuovere il mezzo di differenziazione, lavare una volta con PBS, aggiungere 1 mL di tripsina 0.05% plus 1 U / µ l di collagenasi in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 20 – 30 min. Rimuovi la tripsina/collagenosi e delicatamente aggiungere 2 mL di mezzo RPE pre-riscaldato in ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti (< C0 > tabella 2).
    Nota: Usare un microscopio rovesciato per monitorare la morfologia delle cellule RPE hPSC, che sono poligonali prima del trattamento di tripsina/collagenasi, e diventare rotonda dopo digestione sufficiente.
  2. Utilizzare un becco Bunsen per tirare vetro pipetta Pasteur.
    1. Con entrambe le mani, tenere premuto a lungo (9 pollici) pipetta Pasteur ad entrambe le estremità in posizione orizzontale e sopra il bruciatore di Bunsen circa 2/3 la lunghezza della parte sottile della pipetta.
    2. Una volta che il vetro diventa morbido dalla fiamma, rapidamente tirare le due estremità, tale che un micro suggerimento di raschietto-come è formato la nuova fine della pipetta (Figura 2).
    3. Ripetere più volte per creare più "raschietti di cella". Spruzzare le pipette tirate con etanolo al 70% per la sterilizzazione e li asciugare nella cappa di cultura cellulare.
  3. Sotto un microscopio, utilizzare una micro "raschietto cella" delicatamente dissociare i cluster pigmentate hPSC-RPE dalla piastra.
    1. Picchiettare delicatamente (non raschiare) direttamente sulle cellule pigmentate, che galleggerà fino nel terreno di coltura una volta essi dissociare dal fondo del pozzo.
    2. Utilizzare immediatamente una micropipetta 20 µ l per delicatamente le cellule dissociate hPSC-RPE di aspirazione e trasferirli su un piatto 6 pozzetti prerivestito con RPE media24.
    3. Raccogliere ~ 5 x 103 celle (confluency di ~ 10% come osservato sotto un microscopio 20x) in ciascuna prerivestiti bene di una piastra 12-pozzetti ripetendo i passaggi 2.3.1–2.3.2 più volte, come necessario. Portare il volume finale del mezzo a 2 mL.
      Nota: Per evitare dissociata hPSC-RPE cellule dal galleggiante, non movimento delle lastre durante il processo di dissociazione tale che le cellule dissociate sono galleggianti nel mezzo, ma restano ancora localmente concentrate.
  4. Cellule di cultura recentemente isolato hPSC-RPE (P0) su 12 pozzetti in mezzo RPE per altre 6-8 settimane consentire loro di formare un monostrato pigmentato (Figura 1).
  5. Modificare il mezzo 3 x / settimana. Quando si cambia il mezzo, lasciare circa 1/3 del volume del mezzo vecchio in ciascun pozzetto e aggiungere 2/3 del volume di mezzo RPE fresco, pre-riscaldato. In questa fase, è necessario utilizzare 2 mL di terreno RPE per pozzetti in una piastra 12-pozzetti (così, scambiare 1,3 mL di terreno ogni volta).
    Nota: Il monostrato di cellule di P0 hPSC-RPE può formare cupole, suggerendo che le cellule sono attivamente trasporto di fluidi e sono ancorate tramite giunzioni strette25. Pertanto, formazione di cupola è un indicatore di stato maturo di RPE.

3. RPE destino convalida dall'Immunoblotting

  1. Rendono la cella hPSC-RPE lisato usando il tampone di estrazione di proteine derivate da mammiferi completati con inibitore della proteinasi cocktail. Incubare il lysate delle cellule in ghiaccio per 30 min prima centrifugazione a 13.000 x g per 15 min a 4 ° C per eliminare i detriti cellulari non disciolto. Misurare la concentrazione di proteine totali di lisato.
  2. Denaturare 40 µ g di proteina totale in tampone di Laemmli SDS a 75 ° C per 10 min. Separate la proteina campioni su un gel di Tris-glicina SDS-PAGE 10% a una tensione costante di 90 V per 15 min e poi 150 V fino a quando la raggiunge anteriore di tintura il fondo del gel.
  3. Trasferimento delle proteine su una membrana di nitrocellulosa in pre-raffreddata tampone Tris-glicina completati con 10% metanolo a 100 V per 1 h.
  4. Bloccare la membrana in soluzione salina tamponata Tris con 0,1% detergente non ionico (TBST) e 5% senza grassi del latte secco per 1 h a temperatura ambiente.
  5. Incubare la membrana con gli anticorpi primari, diluiti in tampone bloccante a 4 ° C durante la notte. Diluire gli anticorpi proteine marker specifiche RPE di targeting come segue: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. Diluire l'anticorpo contro la β-actina a 1: 10.000 per rilevare β-actina come controllo caricamento.
  6. Lavare la membrana con TBST 3 volte, con 5 min per ogni lavaggio.
  7. Incubare la membrana con fluoroforo anti-topo di capra coniugato IgG anticorpo secondario diluito 1: 10.000 in tampone bloccante per 1 h a temperatura ambiente.
  8. Lavare la membrana con TBST 4 volte, con 10 min per ogni lavaggio.
  9. Rilevare le proteine utilizzando una porta a infrarossi imaging sistema (Figura 3).

4. Verifica della localizzazione subcellulare BEST1 immunostaining

  1. Lavare una volta cellule hPSC-RPE con 2 mL di PBS e difficoltà in 2 mL di paraformaldeide al 4% per 45 min a temperatura ambiente.
  2. Lavare due volte con 2 mL di PBS e incubare le cellule in 2 mL di PBS con 0,1% non ionici tensioattivi e 2% asino del siero per 45 min a bloccare i siti di legame non specifico.
  3. Incubare le cellule con l'anticorpo BEST1 (diluizione 1: 200) per 2 h a temperatura ambiente.
  4. Lavare le cellule con 2 mL di PBS 3 volte. Incubare con fluoroforo coniugato IgG secondario (1:1, 000) per 1 h a temperatura ambiente.
  5. Lavare con 2 mL di PBS 3 volte per rimuovere l'anticorpo secondario non associato.
  6. Osservare cellule marcate mediante microscopia confocale (Figura 4).

5. registrazione Ca2 +-dipendente Cl– corrente in hPSC-RPE di cellule intere Patch Clamp

  1. 24-72 h prima il morsetto di patch, dividere un bene (su un piatto di 12-pozzetti) completamente confluenti di cellule mature di hPSC-RPE0 P (a forma di ciottoli e pigmentata). Aspirare il media, lavare una volta con PBS e aggiungere 1 mL di tripsina 0.05% plus 1 collagenosi U / µ l nel pozzo.
    Nota: Pre-riscaldare la tripsina/collagenosi a 37 ° C proprio prima dell'uso.
  2. Incubare a 37 ° C per 8 min.
    Nota: Dopo questo passaggio, le cellule di hPSC-RPE sono ancora aderente e collegata.
  3. Utilizzare una micropipetta 1ml per lavare delicatamente le cellule fuori la piastra e trasferimento di cellule nella miscela di digestione in una provetta conica da 15 mL. Lavare bene con 1 mL di tripsina/collagenosi pre-riscaldata per raccogliere le cellule residue e combinarli nella provetta conica da 15 mL.
    Nota: Le cellule di hPSC-RPE sono ancora in grandi ciuffi a questo punto. Non tentare di rompere i grumi di cellule pipettando vigorosa. Alcuni ciuffi possono aderire alla parete interna della punta 1 mL.
  4. Incubare la provetta conica in un bagno asciutto di 37 ° C per 8 min.
  5. Utilizzare una micropipetta da 1 mL a delicatamente pipetta altalenante 10 – 15 volte il mix di digestione.
    Nota: Grumi di cellule diventano molto più piccole ma ancora visibile. Evitare di pipettaggio vigorosa.
  6. Ripetere i due passaggi precedenti.
    Nota: la maggior parte delle celle deve essere a cella singola sospensione dopo pipettaggio. Potrebbe esserci ancora alcuni ciuffi di minuscoli delle cellule, che sono accettabili. Opzionale: Incubare la provetta conica a 37 ° C per altri 5 min seguito da pipettaggio delicato. Il tempo totale in tripsina/collagenosi a 37 ° C non deve superare 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29).
  7. Aggiungere 5 mL di terreno RPE pre-riscaldato a tubo conico da 15 mL contenente le celle digerite. Rotazione a 200 x g per 5 min raccogliere le cellule. Risospendere e seme cellule su piatti prepatinato 35mm al confluency di 10 – 20% (ad es., un 100% confluenti bene su una piastra 12-pozzetti per cinque piatti di 35 mm per confluency di 10%).
    Nota: In ogni momento, evitare di pipettaggio vigorosa, che può causare morte cellulare significativo come rappresentato dai detriti di apparente cella buia nel sovranatante dopo centrifugazione. Cella singola ben separate seeding è essenziali per la registrazione di patch clamp.
  8. Eseguire la patch di cellule intere bloccare come precedentemente descritto18,26,27,28,29,30,31. Acquisire tracce corrente da una famiglia di potenziali di passaggio (da -100 a + 100 mV da un potenziale di detenzione di 0 mV) (Figura 5).
    Nota: Le ricette di soluzioni interne ed esterne sono descritti in tabella 3 e tabella 4, rispettivamente.

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Risultati

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Il passo più tecnicamente impegnativo è l'isolamento manuale, che mira a raggiungere un'elevata purezza di una popolazione di hPSC-RPE0 P differenziata. Dopo un successo isolamento, > 90% di cellule nella popolazione P0 sarà crescere e maturare per visualizzare morfologie di firma RPE (Figura 1). L'esistenza di una parte minore della non-RPE o cellule immature RPE nella popolazione P0 è quasi inevitabile, ma non interferisc...

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Discussione

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La procedura più importante per l'approccio di malattia nel piatto è di differenziare hPSCs con una mutazione patogenetica del lineage di cella corretta, ovvero RPE per BEST1. Così, dopo ogni esperimento di differenziazione, le cellule RPE hPSC risultante devono essere convalidate con attenzione per il loro stato maturo di morfologie RPE-specifici e proteina marker16,17,18. Per ridurre al minimo artefatto clonale, cloni...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo progetto è stato finanziato da sovvenzioni NIH EY025290, GM127652 e Università di Rochester finanziamento di Start-up.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Knock-Out (KO) DMEMThermoFisher10829018
Sostituzione del siero KOThermoFisher10829028
Aminoacidi non essenzialiThermoFisher11140050
GlutamminaThermoFisher35050061
Penicillina-streptomicinaThermoFisher10378016
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Activina-A umanaPeproTech120-14
MEM (una modifica)Sigma-AldrichM4526
Siero fetale bovino VWR97068-085
N1 integratoreSigma-AldrichN6530
Glutammina-penicillina-streptomicinaSigma-AldrichG1146
Aminoacidi non essenzialiSigma-AldrichM7156
TaurinaSigma-AldrichT0625
IdrocortisoneSigma-AldrichH0386
Triiodo-tironinaSigma-AldrichT5516
mTeSR-1 mediumStemcell Technologies5850
MatrigelCorning356230
CollagenasiGibco17104019
TripsinaVWR45000-664
M-PER Reagente per l'estrazione di proteine di mammiferoPierce78501
Sigma-Aldrich4693159001
RPE65 Anticorpo
CRALBPAbcamab15051
BEST1 anticorpoNovus BiologicalsNB300-164
Beta Actina anticorpoThermoFisherMA5-15739
Alexa Fluor 488-coniugato asino anti-topo IgGThermoFisherA-21202
Capra anti-topo IgGThermoFisherSA5-35521
Capra anti-coniglioIgG LI-COR Biosciences926-68071
Hoechst 33342ThermoFisher62249
HEKA EPC10 amplificatore a morsetto patchWarner Instruments895000
PatchmasterWarner Instruments895040
Cocktail di inibitori della proteinasi Anticorpo Novus Biologicals NB100-355

Riferimenti

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