Colture del tessuto ovarici possono essere utilizzati come modelli di atresia di sviluppo, l'ovulazione e follicolo pilifero e indicare i meccanismi regolatori dei processi dinamici ovarici.
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Articolo metodologico
Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le femmine dei mammiferi ovulano periodicamente un numero quasi costante degli ovociti durante ogni ciclo di estro. Per sostenere tale regolarità e periodicità, la regolazione avviene a livello ipotalamico-pituitario-gonadico e sullo sviluppo di follicoli nell'ovaio. Nonostante studi attiva, meccanismi per lo sviluppo del follicolo non sono chiari a causa dei diversi passaggi coinvolti dall'attivazione dormienti follicolo primordiale all'ovulazione e a causa della complessità del regolamento che è diverso in ogni fase follicolare. Per studiare i meccanismi di sviluppo del follicolo e le dinamiche dei follicoli durante tutto il ciclo di estro, abbiamo sviluppato un modello di coltura del tessuto ovarico del mouse che può essere usato per osservare lo sviluppo del follicolo tramite un microscopio. Sviluppo sistematico del follicolo, l'ovulazione periodica ed atresia del follicolo può essere riprodotto nel modello dell'ovaia coltivate, e le condizioni della coltura possono essere modulate sperimentalmente. Qui, noi dimostrare l'utilità di questo metodo nello studio dei meccanismi di regolazione dello sviluppo del follicolo e altri fenomeni ovarici.
Introduzione
Mouse femminile ovaie contengono parecchie migliaia di follicoli1, e l'ovulazione periodica matura circa dieci ovociti ad ogni ciclo di estro. Follicoli sono classificati in diversi stadi di sviluppo: primordial, primaria, secondaria, antral e follicoli di Graaf, a seconda della forma dello strato cellulare granulosa che circondano ogni ovocita. Maggior parte dei follicoli primordiali sono dormienti, e alcuni di essi sono attivati e crescere in follicoli primari a ogni ciclo di estro2. Dopo la fase follicolare secondaria, sviluppo del follicolo è regolato principalmente da gonadotropine, follicolare di stimolazione dell'ormone (FSH) e luteinizzante (LH). Tuttavia, lo sviluppo del follicolo primordiale e primario è indipendente della gonadotropina e i meccanismi regolatori che governano queste fasi rimangono scarsamente inderstood3,4,5. Oltre ai fattori di crescita e ormoni, il follicolo primordiale e primario è regolato dalle interazioni tra follicoli6,7. Pertanto, abbiamo eseguito le analisi delle dinamiche del follicolo in tessuti di topo dell'ovaia e studiato i meccanismi normativi associati utilizzando colture del tessuto ovarico8,9,10.
Qui, presentiamo due metodi di modello di coltura del tessuto ovarico. Il primo viene utilizzato per analizzare lo sviluppo del follicolo tramite la misura delle aree follicolare, e il secondo è usato per studiare il meccanismo regolatore durante lo sviluppo iniziale di follicolo da primordiale alla fase del follicolo secondario con topi transgenici. Per l'analisi di sviluppo del follicolo, abbiamo usato soprattutto le ovaie di topi femminili 4 - settimana-vecchi perché consentono per una visualizzazione semplice dei follicoli. Per indurre l'ovulazione periodica e modello in vivo lo sviluppo del follicolo, abbiamo riprodotto il picco di LH e osservato l'ovulazione, l'atresia del follicolo e secrezione dell'estradiolo in condizioni di coltura del tessuto. Immagini delle ovaie coltivate furono catturati, e i processi di sviluppo del follicolo sono stati analizzati dai cambiamenti di tracciatura in zona follicolare. Tuttavia, nelle analisi di microscopia del campo luminoso, la distinzione tra follicoli primari primordiale e all'inizio era poco chiara. Così, abbiamo sviluppato un metodo per rilevare piccoli follicoli e distinguere tra la primordiale, primaria, e follicolo secondario in coltivate ovarici tessuti utilizzando Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 e ovaie di topi transgenici R26-H2B-mCherry ai giorni 0 e 4 dopo nascita11. Oog1 espressione è rilevabile negli ovociti dopo l'entrata in meiosi e aumenta gradualmente con lo sviluppo del follicolo, permettendo l'osservazione della transizione da primordial follicoli primari utilizzando immagini time-lapse del tessuto ovario coltivate11 ,12. Anche se i metodi morfologici sono stati utilizzati per studiare i fattori che attivano i follicoli primordiali dormente13,14,15,16, lo sviluppo fisiologico del follicolo nelle ovaie è difficile da osservare, e gli effetti di vari fattori rimangono atipici. Gli attuali metodi di coltura sono stati progettati per affrontare questa scarsità in tempo reale analisi dei fattori di destinazione.
Nello studio presente, abbiamo rintracciato lo sviluppo follicolare, utilizzando un metodo di imaging time-lapse e caratterizzato il processo di sviluppo del follicolo. I nostri metodi innovativi offrono uno strumento senza precedenti per studiare la fisiologia delle ovaie.
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Protocollo
Topi sono stati alloggiati in una stanza in ambiente controllata a 23 ± 1 ° C con un ciclo di 12 h luce/12 h scuro. Protocolli di cura degli animali e gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la sperimentazione animale all'Università di Aichi Medical e sono stati approvati dal comitato di uso e Animal Care incombente.
1. preparazione del terreno di coltura e piatti
- Per preparare il terreno di coltura di base, aggiungere siero bovino fetale (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) e la penicillina-streptomicina (penicillina, 100 U/mL; streptomicina, 100 mg/mL) al minimo essenziale medio (MEM-alfa) e mix in provette da 50 mL.
Nota: Volumi totali di terreni di coltura richiesto variano fra gli esperimenti, ma 1 mL di terreno di coltura è generalmente sufficiente per piastre di coltura di 3,5 cm con fondo di vetro. - Versare le aliquote di 1 mL di terreno di coltura mista in piastre di coltura di 3,5 cm con fondo di vetro e set posto 30 mm cella cultura inserti in piatti. Preriscaldare la media e piatti in un'incubatrice (5% CO2 e 37 ° C).
2. preparazione del tessuto ovarico
- Pre-riscaldare tampone salino (PBS) (−) e MEM-alfa contenente 5% FBS, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 100 mg/mL in un incubatore (5% CO2 e 37 ° C).
Nota: 3 mL circa aliquote di PBS (−) per ovaia sono sufficienti per l'utilizzo durante le dissezioni dell'ovaia, e le aliquote di 1ml di MEM-alfa sono sufficienti per l'archiviazione temporanea delle ovaie singole in piatti di 3,5 cm. -
Asportare le ovaie da topi ICR (denominata dopo l'Istituto di ricerca sul cancro) femmina 4 - settimana-vecchi e per tagliare i tessuti che circondano l'ovario con delle forbici, pinzette sotto un microscopio stereoscopico. Riserviamo le ovaie rimosse nel terreno di coltura (Vedi punto 2.1) fino all'utilizzo.
- Posto singole ovaie su carta da filtro inumidite con pre-riscaldati PBS (−) (Vedi punto 2.1) e tagliare in 4 pezzi usando una lama del microtomo sotto un microscopio stereoscopico.
Nota: Ovaie di topi ICR 4 - settimana-vecchi sono circa 2 mm di diametro. Il numero di pezzi dipende dalle dimensioni dell'ovaio; Tuttavia, circa 500 µm spessore pezzi consentono per le osservazioni del follicolo corretta (in pezzi di spessore superiore a 500 mm, trasparenza del tessuto è diminuito; in pezzi più sottile di 500mm, molti follicoli antrali sono rotti e caduti). - Dopo la dissezione, collocare gli esemplari di affettato ovaio in terreno di coltura pre-riscaldato a piatti di 3,5 cm (Vedi punto 2.1).
- Posto singole ovaie su carta da filtro inumidite con pre-riscaldati PBS (−) (Vedi punto 2.1) e tagliare in 4 pezzi usando una lama del microtomo sotto un microscopio stereoscopico.
3. ovarico coltura tissutale
- Goccia circa 0,5 µ l di terreno di coltura per affettato tessuto ovarico sull'inserto di cultura cellulare dove il tessuto ovarico sarà impostato utilizzando una micropipetta.
- Posizionare ogni provino a fette in una goccia di terreno di coltura sugli inserti di cultura cellulare usando la pinzetta.
- Cultura dei tessuti dell'ovaia in 5% CO2 a 37 ° C.
- Sostituire il terreno di coltura con medium fresco pre-riscaldato ogni 2 giorni.
Nota: La pianificazione per i cambiamenti medi per la cultura delle sezioni dell'ovaia da 4 - settimana-vecchi topi ICR è presentata nella Figura 1.- Per riprodurre l'impulso del LH, trattare coltivate le ovaie di topi ICR 4 - settimana-vecchie con il mezzo contenente 100 mU/mL FSH e LH per 12 h ogni 4 giorni (Figura 1).
4. microscopio immagini delle ovaie coltivate
- Avviare le ovaie colte di imaging dopo 1 giorni quando i tessuti hanno aderito sugli inserti di cultura cellulare ed eseguire analisi microscopio confocale o invertito a intervalli di 24 ore per consentire la crescita del follicolo sufficiente tra i punti di tempo.
Nota: La microscopia confocale è superiore alla microscopia invertita per osservare follicoli nelle ovaie tutto coltivate.
5. Time-lapse Imaging delle ovaie coltivate
-
Ottimizzare le condizioni di imaging time-lapse, tra cui laser intensità e tempi di esposizione, per il sistema di imaging (tabella 1).
- Selezionare gli esemplari accoppiati ovaia da topi singolo per uso come gruppi di controllo e di trattamento. Variare l'intensità del laser e tempo di esposizione per ottenere le migliori immagini (tabella 1).
- Confrontare la crescita del follicolo in ciascuna condizione di cultura misurando aree follicolo in immagini di campioni di controllo a intervalli di 24 h e in time-lapse campioni imaging (Vedi punto 6). Contemporaneamente, contare il numero di ovociti ovulati in ogni set di ovaio e scegliere le condizioni ottimali di imaging time-lapse.
- Acquisizione di immagini ad intervalli di 30 min con il sistema di imaging time-lapse sotto determinate condizioni (tabella 1).
6. analisi di crescita del follicolo
-
Per analizzare lo sviluppo del follicolo, misurare le aree di follicolo in immagini catturate utilizzando software ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- Inizialmente, è possibile impostare la scala dell'immagine facendo clic su "Imposta scala" sotto "Analizza" nella barra degli strumenti. Immettere le lunghezze laterali dell'immagine catturata e i corrispondenti numeri di pixel nei campi vuoti di "Distanza di noto" e "Distanza in pixel", rispettivamente.
- Fare clic su "Mano libera" nella barra degli strumenti e delineare i follicoli nelle immagini catturate campo luminoso.
- Nella barra degli strumenti, fare clic su "Misura" sotto "Analizza".
Nota: Se altri dati di misura sono desiderati, fare clic su "Set misura" sotto "Analizza" nella barra degli strumenti e seleziona le caselle appropriate nell'elenco.
7. analisi dello sviluppo del follicolo utilizzando topi transgenici
- Raccogliere le ovaie da giorni postnatali 0 e 4 (P0 e P4) femmina topi transgenici contenenti i transgeni Oog1pro3.9 e R26-H2B-mCherre cultura su inserti come descritto passaggi 1.1 – 3.2, tranne non fetta P0 e ovaie P4.
- Sostituire il terreno di coltura con medium fresco, pre-riscaldato in piatti di 3,5 cm in un'incubatrice che contiene 5% CO2 a 37 ° C ogni 2 giorni.
Nota: La concentrazione di LH nel terreno di coltura delle ovaie P0 e P4 può rimanere costante perché picchi di LH non si verificano nei topi P0 e P4. - Impostare il microscopio per visualizzare solo follicoli primari di AcGFP1-positivi in coltura P4 ovaie (tabella 1).
Nota: Solo primordiale e primari follicoli sono presenti nelle ovaie femminili del mouse P4. - Catturare immagini di colta P0 Oog1pro3.9/ ovaie di topi transgeniciR26-H2B-mCherry ad intervalli di 30 min utilizzando le impostazioni utilizzate per P4 ovaie (Vedi punto 5.2).
- Tracciare e analizzare lo sviluppo del follicolo utilizzando segnali AcGFP1 e H2B-mCHerry.
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Risultati
La figura 1 Mostra il protocollo per i cambiamenti nei mezzi di comunicazione durante la coltura del tessuto ovarico. Seguendo questo programma, le ovaie di topi ICR 4-settimana-vecchio erano coltivate e ripreso a intervalli di 24-h usando la microscopia confocale (Figura 2). Durante la coltura dei tessuti dell'ovaia per 3 settimane, più follicoli antrali e secondari sono stati degenerati da atresia del follicolo e alcuni erano o...
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Discussione
In questo studio, abbiamo sviluppato due nuovi metodi per studiare lo sviluppo del follicolo nelle ovaie del mouse. Il primo metodo comporta la cultura dei tessuti di topi adulti ovarico affettato seguita da analisi dello sviluppo del follicolo, e il secondo prevede l'utilizzo di time-lapse imaging per visualizzare lo sviluppo iniziale del follicolo durante la fase di gonadotropina-indipendente. In precedenza, abbiamo usato il presente metodo di coltura del tessuto ovario per valutare l'effetto di fattore inibitorio di l...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) per fornire i topi Oog1pro3.9 . Questa ricerca è stata sostenuta da JSP (KAKENHI # JP15H06275) e la Fondazione di Nitto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ormone follicolo-stimolante dall'ipofisi umana | SIGMA | F4021 | |
| Ormone luteinizzante dall'ipofisi equina | SIGMA | L9773 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, senza nucleotidi | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Piatto con fondo in vetro | MatTek | P35G-0-10-C | Piatto da 35 mm, vetrino coprioggetti n. 0, diametro del vetro 10 mm |
| Inserto per colture cellulari Millicell | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diametro: 315 mm, dimensione dei pori: 0,4 mm, materiale: PTTE idrofilo |
| Piastre per colture cellulari da 3,5 cm | Greiner Bio-One | 627160 | |
| 50ml / provetta da centrifuga con tappo a tripla tenuta | IWAKI | 2345-050 | |
| Lame monouso a basso profilo 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Microscopio confocale | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Imaging time-lapse | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Imaging time-lapse |
Riferimenti
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