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Articolo metodologico

Confronto ad alta risoluzione delle frequenze di Coniugazione batterica

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DOI:

10.3791/57812

⸱

10 gennaio 2019

 ,  , 
1Applied Chemistry and Biochemical Engineering Course, Department of Engineering, Graduate School of Integrated Science and Technology, Shizuoka University, 2Department of Bioscience, Graduated School of Science and Technology, Shizuoka University, 3Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Research Center

In questo articolo

Sommario

Con l'obiettivo di comprendere i comportamenti dei vari elementi coniugativi batterici di DNA in condizioni diverse, descriviamo un protocollo per la rilevazione di differenze nella frequenza di coniugazione, con alta risoluzione, per stimare quanto efficientemente il batterio donatore avvia la coniugazione.

Abstract

Coniugazione batterica è un passo importante nel trasferimento orizzontale di geni di resistenza agli antibiotici mediante un elemento di DNA coniugativi. Comparazioni approfondite di frequenza di coniugazione in diverse condizioni necessari per comprendere come l'elemento coniugativi si diffonde nella natura. Tuttavia, i metodi convenzionali per il confronto di frequenza di coniugazione non sono appropriati per i confronti approfonditi a causa l'elevato background causata dal verificarsi di eventi di coniugazione aggiuntive sulla piastra selettiva. Abbiamo ridotto con successo lo sfondo con l'introduzione di un metodo numero più probabile di (MPN) e una maggiore concentrazione di antibiotici per prevenire un ulteriore coniugazione in terreno liquido selettivo. Inoltre, abbiamo sviluppato un protocollo per la stima della probabilità di come spesso donatore cellule iniziano coniugazione di ordinamento celle singolo donatore nel destinatario di pool di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS). Utilizzando due plasmidi, pBP136 e pCAR1, le differenze nella frequenza di coniugazione in Pseudomonas putida cellule potrebbe essere rilevati in terreno liquido a diversi tassi di agitazione. Le frequenze dell'iniziazione di coniugazione erano più alti per pBP136 che per pCAR1. Utilizzando questi risultati, possiamo capire meglio le funzionalità di coniugazione di questi due plasmidi.

Introduzione

Coniugazione batterica di elementi genetici mobili, plasmidi coniugativi ed elementi integranti e coniugativi (CIEM) è importante per la diffusione orizzontale delle informazioni genetiche. Può promuovere l'adattamento e la rapida evoluzione batterica e trasmettere la resistenza del multidrug geni1,2. La frequenza di coniugazione può essere influenzata da proteine codificate sugli elementi coniugativi mobilitazione dei DNA (MOB) e formazione di accoppiamento coppia (MPF), tra cui pili di sesso, che sono classificati secondo MOB e MPF tipo3,4, 5. Esso può essere influenzata anche dal donatore e ricevente coppia6 e le condizioni di crescita delle cellule7,8,9,10,11,12 ( tasso di crescita, densità cellulare, superficie del solido o liquido, temperatura, disponibilità nutriente e alla presenza di cationi). Per capire come gli elementi coniugativi diffusione tra batteri, è necessario confrontare la frequenza di coniugazione in dettaglio.

La frequenza di coniugazione tra donatore e destinatario coppie dopo l'accoppiamento di solito sono stimati con i metodi convenzionali come segue. (i) in primo luogo, il numero di colonie di donatore e ricevente è contato; (ii) quindi, sono contate le colonie destinatario, che ha ricevuto gli elementi coniugativi (= transconjugants); (iii) e infine, la frequenza di coniugazione è calcolata dividendo l'unità formanti colonia (UFC della transconjugants) per quelli del donatore e/o destinatario13. Tuttavia, quando si utilizza questo metodo, lo sfondo è alto a causa di eventi di coniugazione aggiuntivi che possono verificarsi anche sulle piastre selettive utilizzate per ottenere transconjugants quando la densità cellulare è alta10. Di conseguenza, è difficile da rilevare piccole differenze nella frequenza (sotto una differenza di 10 volte). Abbiamo recentemente introdotto un metodo (MPN) numero più probabile, utilizzando il mezzo liquido che contiene una maggiore concentrazione di antibiotici. Questo metodo ha ridotto lo sfondo inibendo ulteriormente coniugazione in terreno selettivo; quindi, potrebbe essere valutata la frequenza di coniugazione con risoluzione superiore.

Coniugazione può essere suddiviso in tre passaggi: (1) allegato del donatore-destinatario coppia (2) l'inizio del trasferimento coniugativi e (3) la dissociazione della coppia14. Durante la procedura (1) e (3), non c'è interazione fisica tra il donatore e cellule recettive; così, la densità delle cellule e delle condizioni ambientali possono influenzare questi passaggi, anche se le caratteristiche di pili il sesso sono anche importanti. Passo (2) probabilmente è regolata dall'espressione di diversi geni coinvolti nella coniugazione in risposta ai cambiamenti esterni, che potrebbe essere influenzata da varie caratteristiche del plasmide, del donatore e del ricevente. Anche se il fisico allegato o distacco di coppie donatore-ricevente può essere matematicamente simulato utilizzando una stima delle cellule come particelle, la frequenza di passaggio (2) deve essere misurata sperimentalmente. Ci sono state alcune segnalazioni su osservazioni dirette di come spesso i donatori possono avviare coniugazione [passo (2)] mediante fluorescenza microscopia15,16; Tuttavia, questi metodi non sono ad alta velocità, perché un numero elevato di celle dovrà essere monitorato. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per stimare la probabilità di occorrenza di passaggio (2) utilizzando celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS). Il nostro metodo può essere applicato a qualsiasi plasmide, senza identificazione dei geni essenziali per coniugazione.

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Protocollo

1. preparazione di un donatore con la proteina fluorescente verde (GFP)- e kanamicina resistenza Gene-etichetta plasmidi

  1. Introduzione di geni marcatori nel bersaglio plasmide pBP136
    Nota: L'obiettivo del presente protocollo è quello di generare pBP136::gfp. I ceppi batterici e plasmidi utilizzati in questo studio sono elencati nella tabella 1.
    1. Coltivare colture di Escherichia coli DH10B che harboring pBP13617 a 5 mL di brodo di Luria sterile (LB) ed e. coli S17-1λpir18 che harboring pJBA2819 [contenente una kanamicina (Km)-resistenza gene e gfp mut3 * gene con il suo promotore e terminator in un mini-Tn5] in 5 mL di LB sterile contenente 50 μg/mL Km a 37 ° C durante la notte (O/N, 16 – 24 h) con agitazione a 200 giri al minuto (rpm).
    2. Raccolta e lavaggio
      1. Raccolta 1 mL di ciascuna cultura, metterlo in una microprovetta da 2 mL e centrifugare (10.000 × g, temperatura ambiente, 2 min). Quindi, eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS).
      2. Centrifugare nuovamente (10.000 × g, temperatura ambiente, 2 min) e risospendere in 500 μL di PBS sterile.
    3. Accoppiamento del filtro
      1. Preparare piatti della libbra sterile (con 1,6% agar) e inserire un filtro a membrana sterile 0.22 μm poro formato su di esso. Mix 500 μL di e. coli S17-1λpir pJBA28 harboring con Escherichia coli DH10B che harboring pBP136 e spot la miscela sul filtro sulla piastra LB. Incubare la piastra O/N a 30 ° C. Rimuovere il filtro dalla piastra LB, inserirlo in un tubo di plastica sterile 50 mL e aggiungere 1 mL di PBS sterile.
        Nota: pJBA28 può replicare in presenza di proteina Π, codificata dal gene pir 18e possono essere trasferiti da S17-1λpir a DH10B. pBP136 trasporta nessun marcatore gene17 e possono essere trasferiti da DH10B a S17-1λpir. Pertanto, non potremmo distinguere S17-1λpir che harboring pBP136 e pJBA28 da DH10B harboring pBP136 e il mini-Tn5 (recepita nel cromosoma o pBP136) in questa fase. Quindi, abbiamo usato miscele di essi come donatori nei passaggi successivi (1.1.4.–1.1.5.).
    4. Far crescere una cultura di O/N di miscela degli amori di cui sopra in LB sterile contenente 50 μg/mL Km a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min e una cultura di Pseudomonas putida KT2440 [Km-sensibili (Kms), sensibili alla rifampicina (Rif.s), gentamicina-sensibili (Gms) e tetraciclina resistente (Tcr)] in mezzo contenente Tc 12,5 µ g/mL a 30 ° C con agitazione a 200 giri/min.
    5. Dopo la raccolta e lavaggio le celle come descritto al punto 1.1.2 utilizzarli (accoppiamento miscela e KT2440) per il filtro per accoppiamento (O/N, 30 ° C) come descritto al punto 1.1.3.
    6. Preparare piatti della libbra sterile contenente 50 μg/mL Km e 12.5 μg/mL Tc (Tc + LB + Km piastre).
    7. Diluire la miscela sedimento su membrana filtrante con PBS sterile (101– 105-piega) e quindi diffusione ogni diluizione su LB + Km + Tc piastre e incubare le piastre a 30 ° C per 2 – 3 d.
    8. Pick colonie dalle piastre, far crescere una cultura di O/N in LB sterile contenente Km e Tc, nonché P. resinovorans CA10dm4RG (Rifr e Gmr)6 in LB sterile contenente Rif (25 μg/mL) e Gm (30 μg/mL) a 30 ° C e 200 giri/min.
      Nota: Come descritto nella nota precedente, le colonie sul LB + Km + Tc piastre (da 1.1.7.) potrebbe essere harboring pBP136 KT2440 portando un mini-Tn5 e KT2440 con un mini-Tn5, perché pJBA28 potrebbero essere trasferiti direttamente da S17-1λpir che harboring pBP136 e pJBA28 a KT2440. Ecco perché un altro accoppiamento con p. resinovorans CA10RG è necessaria per ottenere la pBP136 di destinazione con un mini-Tn5 nei passaggi seguenti.
    9. Dopo la raccolta e lavaggio le celle come descritto al punto 1.1.2, utilizzarli per il filtro per accoppiamento (O/N, 30 ° C) come descritto al punto 1.1.3.
    10. Preparare piatti della libbra sterile contenente Rif, Gm e Km (LB + Rif + Km Gm piastre).
    11. Risospendere la miscela sul filtro e quindi diluirlo 101– 105-piegare, diffonderlo sul LB + Rif + Km Gm piastre e incubare le piastre per 2 – 3 d a 30 ° C.
    12. Scegli le colonie e verifica se loro porto pBP136 mediante PCR utilizzando primers specifici per il plasmide.
  2. Introduzione di un gene marcatore selettivo il bersaglio plasmide pCAR1
    Nota: L'obiettivo del presente protocollo è quello di generare pCAR1::gfp
    1. Far crescere una cultura di O/N di p. putida KT2440 che harboring pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 a 200 giri/min e 30 ° C ed e. coli S17-1λpir18 che harboring pJBA28 in 5 mL di LB sterile contenente 50 μg/mL Km a 200 giri/min e 37 ° C.
    2. Dopo la raccolta e lavaggio le celle come descritto al punto 1.1.2, utilizzarli per il filtro per accoppiamento (O/N, 30 ° C) come descritto al punto 1.1.3.
    3. Rimuovere il filtro dalla piastra LB, inserirlo in un tubo di plastica sterile 50 mL e aggiungere 1 mL di PBS sterile.
    4. Diluire la miscela di sedimento con PBS sterile (101– 105-piega) e diffondere la miscela diluita sulla sterile selettiva LB + Tc + Km piastre.
      Nota: pCAR1 non replica in e. coli; così, p. putida KT2440 harboring pCAR1 con un mini-Tn5 può essere selezionato su LB + Tc + Km piastre.
    5. Scegli una colonia dalla piastra e far crescere una cultura di O/N in LB sterile contenente Km e Tc e una cultura di P. resinovorans CA10dm4RG in LB sterile contenente Rif e Gm (200 giri/min, 30 ° C).
    6. Dopo la raccolta e lavaggio come al punto 1.1.2, utilizzare le celle per il filtro per accoppiamento (O/N, 30 ° C) come descritto al punto 1.1.3.
    7. Risospendere la miscela sul filtro e quindi diluirlo, stendere su LB + Rif + Km Gm piastre e incubare le piastre per 2 – 3 d a 30 ° C.
    8. Scegli le colonie e verifica se loro porto pCAR1 mediante PCR con primers specifici per il plasmide.
  3. Confermare la trasferibilità dei plasmidi taggati e preparare i donatori per i prossimi passi
    Nota: L'obiettivo del presente protocollo è quello di confermare la trasferibilità dei plasmidi costruiti sopra e preparare i donatori per i passaggi successivi.
    1. Far crescere una cultura di O/N di p. resinovorans CA10dm4RG che harboring pBP136::gfp o pCAR1::gfp in LB sterile contenente Km e una cultura di p. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacI q, in cui PA1/O4/O3-gfpmut3* non è espresso a causa del relativo geneq cromosomiche lacI]21 in 3 mL di LB contenente Tc (200 giri/min, 30 ° C).
    2. Dopo la raccolta e lavaggio le celle come descritto al punto 1.1.2, utilizzarli per il filtro per accoppiamento (O/N, 30 ° C) come descritto al punto 1.1.3.
    3. Posizionare il filtro in un tubo di plastica sterile 50ml e risospendere con 1 mL di PBS sterile. Diluire la miscela di sedimento con PBS sterile (101– 105-piega), stendere l'impasto diluito sulla sterile selettiva LB + Tc + Km piastre.
    4. Scegli le colonie e verifica se loro porto di ciascuno dei plasmidi mediante PCR con primers specifici.
      Nota: Conferma della posizione di inserimento delle mini-Tn5 mediante sequenziamento diretto dopo l'estrazione del plasmide è facoltativo, per confermare che l'inserimento non pregiudica la funzione di trasferimento del plasmide.

2. calcolo della frequenza di coniugazione dal metodo MPN

  1. Preparare sterile LB + Km e LB Gm piastre.
  2. Far crescere una cultura di O/N di p. putida SMDBS che harboring pBP136::gfp o pCAR1::gfp in 3 mL di LB sterile contenente Km e una cultura di p. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) in 3 mL di LB contenente Gm (140 giri/min, 30 ° C).
  3. Dopo la raccolta e lavaggio le celle come descritto al punto 1.1.2, utilizzarli per il filtro per accoppiamento a 30 ° C per 45 min come descritto al punto 1.1.3.
  4. In serie diluito sopra donatore e del ricevente di cultura (101 – 107) e diffonderlo su LB + Km (donatore) o LB + Gm (destinatario) (ciascuno in triplice copia) piastre per contare le unità formanti colonia (UFC). Incubare le piastre a 30 ° C per 2 d.
  5. Risospendere la miscela sul filtro in LB sterile contenente Km e Gm e diluire in serie (da 21 224– 107.2) utilizzando una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti (in quadruplice copia).
  6. Incubare la piastra a 96 pozzetti per la durata appropriata (2 d a 30 ° C).
  7. Contare i CFU del donatore e del ricevente sulle piastre (punto 2.4.) e contare il numero di pozzetti in cui il transconjugants crescere.
  8. Calcolare il MPN e della sua deviazione utilizzando il programma di calcolo MPN sviluppato da Jarvis et al. 22, che è disponibile presso http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
    1. Immettere il nome dell'esperimento (es., 'test'), la data dell'esperimento (es., 9/4/2018), il numero di serie di test e il max. No. delle diluizioni (immettere '24') in lamiera di ferro #7 del 'Programma' di Excel il file ('MPN_ver5.xls').
    2. Immettere ' 2-1 (= 0.5) per 2-24 (= 5.96 × 10-8)' nella colonna 'fattore di diluizione d', '0,01' nella colonna 'volume in ml o g w'e 4' in ' No. di tubi n' nelle tabelle automaticamente prodotte ' dei dati di input'.
    3. Immettere il numero di pozzetti in cui il transconjugants crescere ad ogni diluizione del campione (0 – 4).
    4. Premere il pulsante 'Calcolare risultati' e quindi ottenere risultati (in MPN/μL) e loro limiti di confidenza di 95% (inferiore e superiore).
  9. I numeri del donatore e cellule recettive (CFU/mL) per calcolare la frequenza di Coniugazione dei plasmidi dividendo il numero di transconjugants (MPN/mL).

3. preparazione per la stima della probabilità di coniugazione avviate da donatore

  1. Far crescere una cultura di O/N di p. putida SMDBS che harboring pBP136::gfp o pCAR1::gfp in 3 mL di LB sterile contenente Km e una cultura di p. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) in 3 mL di LB sterile contenente Gm utilizzando 300 mL Boccette (140 giri/min, 30 ° C) come precultures.
  2. Trasferire 200 μL della coltura in 200 mL di fresca LB sterile contenente Km o Gm in flaconi da 500 mL e incubare a 30 ° C con agitazione a 140 giri/min.
  3. Misurare la torbidità a 600 nm (OD600) della cultura utilizzando un spettrofotometro UV-VIS e spot la cultura, diluito in LB (101– 108-piegare diluizioni), su un vassoio LB contenente Km o piastre di GM. Incubare questi LB a 30 ° C per 1 – 2 d e determinare il CFU.
  4. Tracciare i valori di600 OD e il CFU con il tempo di crescita per generare le curve di crescita del donatore e del ricevente.
  5. Coltivare culture del ceppo donatore e ricevente alla fase di Mid-registro, basata sulla curva di crescita.
  6. Dopo la raccolta e le cellule di lavaggio, preparare 101– 103 CFU del donatore in 10 μL di LB e 105– 107 CFU del destinatario in 100 μL di LB.
  7. Miscelare 10 μL del donatore e 100 μL delle culture destinatario a quote differenziate in piastre da 96 pozzetti (in triplice copia). Per esempio, mescolare 101 CFU del donatore e 105 CFU del destinatario e aggiungere a ciascuno dei 96 pozzetti e mescolare 101 CFU del donatore e 106 CFU del destinatario in un'altra piastra a 96 pozzetti, e così via.
  8. Incubare la miscela a 30 ° C per 45 min e quindi aggiungere le alte concentrazioni di antibiotici (100 μg/mL Km e 60 μg/mL Gm) ad ogni pozzetto per inibire ulteriormente coniugazione.
  9. Incubare la piastra a 30 ° C per 2 d.
  10. Contare il numero di pozzetti in cui transconjugants crescere.
  11. Scegliere la densità destinatario appropriato per stimare la probabilità di coniugazione donatore-avviata sulla base dei dati di cui sopra (transconjugants dovrebbe essere trovato in almeno 1 bene di una piastra a 96 pozzetti).
    Nota: Transconjugants si svilupperà in tutti i pozzetti, quando la densità delle cellule del donatore e del ricevente sono alti e più di una coniugazione si verifica in un pozzo. Al contrario, nessun transconjugants si troverà in qualsiasi pozzi quando la densità cellulare è troppo bassa. Nella sezione seguente, una cella singolo donatore viene ordinata in un pozzo. Di conseguenza, la densità di destinatario dovrebbe essere al massimo.

4. stima della probabilità di coniugazione avviate da donatore

  1. Preparare 200 mL di una cultura di Mid-registro fase del donatore p. putida SMDBS che harboring pBP136::gfp o pCAR1::gfp e quello del destinatario p. putida KT2440RGD, come descritto in 3.6 – 3.7.
  2. Posto 106 CFU del destinatario in 100 μL di LB in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  3. Impostare il sistema FACS (selezionatore delle cellule e citometria a flusso con un braccio robotico, un laser di argon 488 nm e un foro dell'ugello di 70 μm). Impostare su forward scatter (FSC), con una soglia di 1% come il trigger di acquisizione. Regolare il guadagno di H e un guadagno di FSC e side scatter (SSC) alla massima sensibilità, che può escludere falsi segnali positivi, utilizzando PBS come controllo negativo. Impostare la porta di ordinamento basata su FSC e SSC e modalità di ordinamento di goccia 0,5 per purezza massima sorta.
  4. Ordina una cella singolo donatore di FACS su una piastra di LB (384 punti diversi), incubare la piastra a 30 ° C per 2 d e poi contare quante colonie compaiono sulla lastra dalle cellule ordinate.
    Nota: Questa procedura è per la convalida del cancello set. Se ci sono 384 colonie sulla piastra, vuol dire che il 100% delle cellule ordinate potrebbe formare colonie. La validità media di ordinamento è sempre 90 – 95%.
  5. Ordinare una cella singolo donatore di FACS in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con il destinatario (4.2).
  6. Incubare la piastra per 45 min a 30 ° C e quindi aggiungere le alte concentrazioni di antibiotici (100 μg/mL Km e 60 μg/mL Gm) in ogni pozzetto per impedire ulteriore coniugazione.
  7. Incubare la piastra a 30 ° C per 2 d.
  8. Contare il numero di pozzetti in cui transconjugants si è sviluppato come determinato mediante ispezione visiva con l'occhio nudo.
  9. Calcolare la probabilità di coniugazione avviate da donatore dividendo il numero di pozzetti con transconjugants per il numero totale dei pozzi in cui il donatore è stato risolto.

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Risultati

Confronto tra frequenza di coniugazione dal metodo MPN

Nel nostro rapporto precedente, abbiamo confrontato le frequenze di coniugazione di pBP136::gfp e pCAR1::gfp in triplice mezzo liquido diluito LB (1/3 LB) con diversi tassi di agitazione dopo 45 min accoppiamento usando 125ml spinner boccette10. Abbiamo confrontato le frequenze di coniugazione di pBP136::gfp e pCAR1::gfp

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Discussione

Qui, presentiamo un protocollo ad alta risoluzione per individuare differenze nella frequenza di coniugazione in condizioni diverse, utilizzando un metodo MPN per stimare il numero di transconjugants. Un passo importante nel protocollo è diluire la miscela del donatore e del ricevente dopo l'accoppiamento fino a quando non transconjugants crescere. Un altro passo è aggiunta di alte concentrazioni di antibiotici al mezzo liquido selettivo per prevenire ulteriori coniugazione. Queste procedure possono ridurre lo sfondo cau...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. K. Kamachi del National Institute of Infectious Diseases (Giappone) per la fornitura di pBP136 e Dr. H. Nojiri dell'Università di Tokyo (Giappone) per la fornitura di pCAR1. Siamo anche grati al Professor Dr. Molin Sølen della Technical University of Denmark per fornire pJBA28. Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI (Grant numeri 15H 05618 e 15KK0278) per MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MoFlo XDPBeckman-CoulterML99030FACS
IsoFlowBeckman-Coulter8599600Guaina soluzione
Fluorosfere (10 μ m)di 6605359Beckman-Coulterper l'installazione dell'incubatore FACS
YamatoScientific Co. Ltd211197-IC802
Spettrofotometro UV-VIS UV-1800SIMADZU CorporationUV-1800
Piastre a 96 pozzettiNIPPON Genetics Co, LtdTR5003
micropiastra tipo Piastra di PetriAXEL1-9668-01per la convalida della selezione
filtro a membranaADVANTECC045A025Aper filtri di accoppiamento
pippettesNichiryo CO. Ltd00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000		0.5-10 μ L, 20-200 μ L, 100-1000 μ L
pippetes multicanaleNichiryo CO. Ltd00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP		0.5-10 μ L, 20-200 μ L
TryptoneBD Difco211705
Estratto di lievitoBD Difco212750
NaClSigmaS-5886
AgarNakarai tesque01162-15
rifampicinaWako185-01003
gentamicinaWako077-02974
kanamicinaWako115-00342
Piastra di PetriAXEL3-1491-51JPND90-15
microprovetteFukaekasei131-815C
500 mL pallone monousoCorningCLS3578
Perline

Riferimenti

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