Articolo metodologico

Un approccio di mutagenesi romanzo saturazione: Unico passaggio caratterizzazione della proteina regolatrice siti in RNA usando fosforotioati di legame

DOI:

10.3791/57816

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21 agosto 2018

1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

In questo articolo

Sommario

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Proteine che legano specifiche sequenze di RNA giocano un ruolo critico nell'espressione genica. Caratterizzazione dettagliata di questi siti di legame è cruciale per la nostra comprensione della regolazione genica. Qui, è descritto un approccio passo-passo per mutagenesi di saturazione dei siti di legame delle proteine nel RNA. Questo approccio è rilevante per tutti i siti di legame delle proteine nel RNA.

Abstract

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Regolazione genica svolge un ruolo importante nello sviluppo. Numerose proteine DNA e RNA-associazione legano loro sequenze bersaglio con elevata specificità per controllare l'espressione genica. Queste proteine regolatrici controllano l'espressione genica a livello del DNA (trascrizione) o a livello di RNA (pre-mRNA che impiomba, poliadenilazione, trasporto del mRNA, decadimento e traduzione). Identificazione di sequenze regolatrici aiuta a capire non solo come un gene è acceso o spento, ma anche quali geni a valle sono regolati da una particolare proteina regolatrice. Qui, descriviamo un approccio one-step che consente la mutagenesi di saturazione di un sito di legame della proteina nel RNA. Si tratta di doping mascherina del DNA con non-selvaggio-tipo nucleotidi all'interno del sito di legame, sintesi di RNA separata con ogni nucleotide fosforotioato e l'isolamento della frazione legata dopo incubazione con proteine. Interferenze da parte di non-selvaggio-tipo nucleotidi provoca loro esclusione preferenziale dalla frazione legata alle proteine. Questo è monitorato mediante elettroforesi in gel dopo fenditura chimica selettiva con iodio di legami fosfodiesterei contenente fosforotioati (mutagenesi fosforotioato o PTM). Questo approccio di mutagenesi passo singolo saturazione è applicabile per la caratterizzazione di qualsiasi sito di legame della proteina nel RNA.

Introduzione

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Regolazione genica svolge un ruolo importante nella biologia. Geni possono essere regolati a livello di trascrizione, impionbatura pre-mRNA, 3' fine formazione, esportazione di RNA, traduzione, localizzazione di mRNA, decadimento, modificazione post-traduzionale/stabilità, ecc che entrambe le proteine DNA e RNA-associazione giocano un ruolo chiave nel gene regolamento. Mentre le analisi genetiche molecolari hanno identificato numerose proteine regolatorie, solo un piccolo sottoinsieme di esse sono state caratterizzate completamente per loro funzioni cellulari o associazione siti in vivo. Mutagenesi e l'analisi di sequenza filogenetica offrire approcci complementari per caratterizzare le interazioni DNA o RNA-proteina.

Le proteine RNA-leganti sono importanti nei processi di sviluppo, tra cui la differenziazione sessuale. La proteina di Drosophila Sex-lethal (SXL) o la proteina di sesso-interruttore generale è assente nei maschi, ma presente nelle femmine. Essa riconosce sequenze ricche uridina o pirimidina-tratti adiacenti ai luoghi specifici della giuntura in a valle pre-mRNA bersaglio (trasformatore, sesso-letalee maschio-specific lethal2) in cellule somatiche1,2 ,3,4. Inoltre, esso regola sito di poliadenilazione commutazione legandosi alle sequenze di enhancer poliadenilazione uridina-ricco in trascrizione rinforzatore di rudimentali (e(r))5,6. SXL probabile regola obiettivi supplementari sulla linea germinale femminile che devono ancora per essere identificati1,7,8,9,10,11, 12 , 13.

Caratterizzazione di un sito di legame coinvolge tipicamente, mutagenesi, ad esempio, per l'eliminazione o sostituzione di uno o più nucleotidi. Ogni sito di legame mutante, riguardante la sequenza di RNA wild-type, viene poi analizzata utilizzando una serie di concentrazioni di proteina per determinare la sua affinità di legame (dissociazioneKd o equilibrio costante) per la proteina di interesse; Kd è la concentrazione di proteine necessaria per ottenere 50% legame al RNA. Questo processo laborioso di mutagenesi dettagliata comporta generazione e analisi di numerosi mutanti — tre nucleotidi non-wild type per ogni posizione nel sito di legame. Così, c'è la necessità di un approccio alternativo per mutagenesi di saturazione più veloce, più semplice ed economica di siti di legame della proteina nel RNA.

Qui, descriviamo un approccio one-step che consente la mutagenesi di saturazione di un sito di legame della proteina nel RNA. Si tratta di doping mascherina del DNA con non-selvaggio-tipo nucleotidi all'interno del sito di legame, sintesi di RNA separata con ogni nucleotide fosforotioato e l'isolamento della frazione legata dopo incubazione con proteine. Interferenze da parte di non-selvaggio-tipo nucleotidi provoca loro esclusione preferenziale dalla frazione legata alle proteine. Questo è monitorato mediante elettroforesi in gel dopo fenditura chimica selettiva con iodio di legami fosfodiesterei contenente fosforotioati (mutagenesi fosforotioato o PTM). Questo approccio di mutagenesi passo singolo saturazione è applicabile per la caratterizzazione di qualsiasi sito di legame della proteina nel RNA.

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Protocollo

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Nota: Nella figura 1 viene fornita una panoramica di mutagenesi fosforotioato e riassume i passaggi chiave nel processo.

1. generazione di una libreria di mutanti — Doping mascherina del DNA con nucleotidi Non di tipo selvaggio

  1. Sintetizzare T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') di sintesi chimica su un sintetizzatore di DNA.
  2. Sintetizzare un oligonucleotide drogato (filamento complementare) di sintesi chimica su un sintetizzatore di DNA corrispondente al sito di legame della proteina. Utilizzare una miscela appropriata di phosphoramidites durante la sintesi chimica per ogni sito di doping (X qui sotto) con un rapporto di 90% A come il nucleotide di selvaggio-tipo e 10% T come il nucleotide di tipo non-wild (Vedi risultati rappresentativi per maggiori dettagli su questo rapporto).
    Nota: Qui, la sequenza dell'oligonucleotide drogato è 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. La sequenza sottolineata è il complemento inverso del sito di legame della proteina SXL, oltre a ulteriori nucleotidi all'esterno del sito di associazione che forniscono utili controlli confermando che non ogni cambiamento nel RNA effetti vincolanti, nonché controlli di caricamento per confronto e la normalizzazione dei nucleotidi all'interno del sito dell'associazione. La sequenza del sito di SXL-associazione UUUUUGUUGUUUUUUUU, che è presente in trasformatore pre-mRNA14,15,16,17, è stata utilizzata per elaborare la metodologia proposta. La sequenza in corsivo è complementare alla sequenza del primer T7 ed è il promotore T7 per trascrizione in vitro .

2. sintesi di RNA

  1. Sintetizzare il RNA in una reazione di trascrizione di 20 µ l, come descritto in precedenza18.
    1. Buffer della trascrizione mix T7 e oligonucleotide di T7 1 µM, 1 µM drogato del oligonucleotide, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2mm GTP, 1 mM ogni ATP, CTP e UTP (guanosina, adenosina, citidina e uridina trifosfato) e 2 U / µ l T7 RNA polimerasi.
    2. Aggiungere, in due separati per microcentrifuga, 0,167 mM α-thio ATP o 0,05 mM α-thio UTP incorporare RNAs fosforotioati (Vedi schemi nella Figura 2).
      Nota: Per protocolli alternativi, aggiungere 0,2 mM α-thio CTP o 0,2 mM α-thio GTP ad una reazione di trascrizione appropriata contenente un oligonucleotide drogato per testare i due rimanenti sostituzioni nucleotidiche.
    3. Incubare la miscela di reazione di sintesi di RNA per 2 ore a 37 ° C.
  2. Aggiungere 2,5 µ l fosfatasi alcalina termolabile e 2,5 µ l di tampone di 10xphosphatase al campione di RNA. Incubare la reazione 25 µ l per 10-30 min a 37 ° C per rimuovere 5' fosfati.
  3. Inattivare l'enzima fosfatasi alcalina mediante riscaldamento a 80 ° C per 2 – 5 min.
  4. Si l'estremità 5' del RNA defosforilato (5 pmole) utilizzando 1 µ l T4 polinucleotide chinasi e 1 µ l γ -32P ATP in un volume di reazione di 10 µ l. Incubare il mix di reazione per 30 – 60 min a 37 ° C.
  5. Inattivare l'enzima della chinasi di polinucleotide T4 da riscaldamento a 65 ° C per 20-30 min.
  6. Gel di purificare il RNA mediante elettroforesi in un 10% di denaturare i gel di poliacrilammide. Individuare RNA sul gel mediante autoradiografia. Asportare la fetta di gel contenente RNA radioattivo, schiacciare in un tubo del microcentrifuge premendo contro le pareti con un puntale e immergere nel buffer di proteinasi K (PK) (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% sodio dodecil solfato). Ruotare il tubo a temperatura da 2 h a tutta la notte.
  7. Centrifugare i residui di gel, scartare il gel e raccogliere la soluzione tampone.
  8. Estrarre la soluzione due volte con un volume uguale del fenolo-cloroformio e una volta con cloroformio e raccogliere la fase acquosa.
  9. Aggiungere il volume della fase acquosa 0,1 3M di acetato di sodio, pH 5.2, vettore tRNA o glicogeno e 2,5 volume di etanolo. Conservare il campione a-80 ° C per 1 h.
  10. Centrifugare il campione per 5 – 10 min in una microcentrifuga ad alta velocità a 16.873 x g. Rimuovere con attenzione la soluzione tampone/etanolo senza disturbare il pellet di RNA.
  11. Lavare la pallina con etanolo al 70% e centrifugare per 2 – 5 min Rimuovi etanolo con attenzione. Asciugare la pallina in aria.
  12. Risospendere il pellet in 20 – 50 µ l dietil pirocarbonato (DEPC)-acqua trattata. Conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Eseguire tutti i passaggi con RNA radioattivo utilizzando opportune precauzioni e uno scudo in plexiglass per proteggere da radioattività. Attualmente, colonne di spin sono più comunemente utilizzati e più conveniente per rimuovere radioattività prive di personalità giuridica, come alternativa alla purificazione del gel del RNA.

3. legame di reazione e la separazione di RNA legato alle proteine

  1. Esprimere la proteina ricombinante in e purificare da e. coli.
  2. Stimare la concentrazione di proteina ricombinante mediante spettrofotometria o separando in un gel di SDS-poliacrilammide vicino ad un'albumina di siero proteina nota standard, bovina (BSA). Visualizzare la proteina di interesse e la BSA standard macchiando il gel con Coomassie Brilliant Blue R-250. Quantificare la proteina rispetto alle quantità note di diluizioni di BSA sullo stesso gel.
    Nota: Conservare la proteina ricombinante a - 80 ° C fino all'utilizzo e diluire in 20 mM 4-(2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico l'acido (HEPES), pH 8.0, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,05% NP-40, 20% glicerolo. Uso di 0,5 – 1,0 mM proteasi inibitore fenilmetano sulfonil fluoruro (PMSF) è facoltativo.
  3. Eseguire la reazione di RNA-binding (20 – 100 µ l) in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 millimetro DTT, 50 mM KCl, inibitore di RNAsi 0,5 unità / µ l, 0.09 µ g / µ l acetilato albumina di siero bovino, 1 mM EDTA, 0.15 µ g / µ l tRNA, RNA 5'-fine radiomarcate e 6 µ l di concentrazione appropriata (un concentrazione in cui ~ 50% di RNA si lega alla proteina) della proteina.
    Nota: Questo buffer di associazione lavora per tre proteine RNA-leganti (SXL, U2AF65e PTB), ma deve essere standardizzato per una proteina di interesse. Stimare la concentrazione nella proteina empiricamente, utilizzando varie diluizioni per una preparazione data proteina, che è necessaria per ottenere circa il 50% legame al RNA. Questa condizione o Kd rappresenta la parte più sensibile della curva RNA-binding.
  4. Incubare la reazione di legame proteina per 20 – 30 minuti a 25 ° C (o ghiaccio).
  5. Separare la frazione di RNA proteina legata dalla frazione non associata utilizzando uno dei due approcci:
    1. Associazione del filtro di nitrocellulosa
      1. Applicare la reazione di associazione (20 – 100 µ l) su un filtro di nitrocellulosa collegato ad un collettore sottovuoto a temperatura ambiente.
        Nota: Solo il complesso della RNA-proteina viene mantenuto sul filtro e non associati flussi di RNA attraverso il filtro. L'approccio di associazione di filtro permette di recupero superiore del RNA associato ed è più veloce e più semplice, rispetto per l'analisi dello spostamento di mobilità gel. Ponendo una membrana DEAE sotto il filtro di nitrocellulosa è anche possibile raccogliere la frazione non legata di RNA o RNA i gratuiti per confronto con la frazione legata.
      2. Tagliare la parte del filtro di nitrocellulosa contenenti mantenuto RNA radioattivo in pezzi più piccoli per adattarsi in un tubo del microcentrifuge, ammollo in buffer sufficiente PK (300 – 500 µ l contenente 10 – 20 µ g PK) per immergere i pezzi di filtro ed eluire RNA dal filtro per 2 – 3 h o durante la notte.
      3. Estrarre con fenolo-cloroformio, cloroformio e raccogliere la fase acquosa. Aggiungere etanolo e acetato di sodio e, dopo incubazione in congelatore, centrifugare, lavare, asciugare e risospendere RNA in acqua trattata con DEPC. Seguire questi passaggi come descritto in procedura 2.10 a 2.14 sopra.
    2. Spostamento di mobilità del gel
      1. Preparare e polimerizzare un gel di poliacrilammide nativo di 5% (60: 1 Acrylamide:bis-acrilammide) in 0,5 x TBE (tampone Tris-Borato-EDTA standard) prima di iniziare la reazione di associazione, come un'alternativa per il metodo di associazione di filtro.
      2. Pre-corsa il gel per 15 min a 250 V in una camera fredda (4 ° C).
      3. Caricare ogni reazione obbligatoria (sopra) in pozzetti separati del gel pre-esecuzione sopra.
        Nota: Il buffer di deposito di proteine fornisce sufficiente glicerolo per caricamento dei campioni nei pozzetti.
      4. Separare il RNA legato alle proteine mediante elettroforesi su gel in una stanza fredda 250 V per 1 o 2 h, a seconda della dimensione del RNA e proteina specifica.
      5. Individuare la posizione del complesso della RNA-proteina sul gel mediante autoradiografia. Asportare la fetta di gel contenenti il complesso della RNA-proteina. Eluire il RNA dal gel slice di schiacciare la fetta di gel e ammollo nel buffer di PK.
      6. Estrarre con fenolo-cloroformio, cloroformio e raccogliere la fase acquosa. aggiungere etanolo e acetato di sodio e, dopo incubazione in congelatore, centrifugare, lavare, asciugare e risospendere RNA in acqua trattata con DEPC. Seguire questi passaggi come descritto in procedura 2.10 a 2.14 sopra.

4. analisi di iodio-spaccati fosforotioato prodotti per il rilevamento delle posizioni del Nucleotide mutante

  1. Aggiungere lo iodio 1 mM in un 20 µ l di acqua trattata con DEPC contenente fino a 10 µ g vettore tRNA fendere il RNA (RNA totale e non associato) presso i siti di fosforotioato incorporazione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    Nota: Ulteriori dettagli sulla fenditura di iodio con condizioni leggermente diverse — iodoethanol 7% (v/v), riscaldamento a 95 ° C per 3 min — possono essere trovati a Gish & Eckstein 198819.
  2. Precipitato spaccati RNA aggiungendo sodio acetato/etanolo, come descritto in precedenza. Risospendere in una tintura di caricamento per denaturare i gel. Calore e caricare l'esempio per separare frammenti di RNA mediante elettroforesi in un gel di poliacrilammide denaturante di 15 – 20%.
  3. Esporre il gel di poliacrilammide ad una pellicola di raggi x.
  4. Individuare bande nella frazione legata contro pool totale mediante autoradiografia.
    Nota: Eseguire tutti i passaggi con iodio in una cappa di scarico. Per la separazione di RNA mostrato qui, è impiegato un gel a forma di Cuneo, che si ottiene raddoppiando lo spessore di entrambi i distanziali nella parte inferiore delle piastre gel inserendo un distanziale extra pollice-lungo nella parte inferiore del gel. Questa forma permette maggiore spaziatura uniforme o più vicino tra più brevi frammenti di RNA. In alternativa, può essere utilizzato un phosphorimager piuttosto che pellicole di raggi x per la rilevazione e quantificazione della radioattività.

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Risultati

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Principio di mutagenesi di saturazione mediante doping:

Per un adeguato rapporto molare di wild-type e altri nucleotidi, è necessario utilizzare una miscela uguale di tutti i quattro nucleotidi se solo una posizione è da analizzare. Tuttavia, se posizioni multiple sono analizzati simultaneamente, il rapporto di tipo selvaggio ai nucleotidi di selvaggio-tipo deve essere regolato, cioè, ridotto. In caso contrario, oltre a si...

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Discussione

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Mutagenesi lungo è stata utilizzata per caratterizzare i siti di legame proteico. In primo luogo, una serie di mutanti può essere costruita e testata singolarmente nelle analisi per analizzare i loro effetti sull'affinità di legame di associazione. Mentre un approccio di mutagenesi standard offre un modo per analizzare diverse sequenze, più passaggi coinvolti nell'approccio standard, quali costruzione di mutanti e l'esecuzione di una serie di reazioni per ogni mutante di associazione, è laboriosa e richiede tempo e non p...

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Dichiarazioni

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L'autore non dichiara concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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L'autore ringrazia il National Institutes of Health per il finanziamento di passato e grazie Michael R. Green per la sintesi di oligonucleotidi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Uridina 5' a-tio trifosfatoNEN (Boston, Massachusetts)NLP-017
Adenosina 5' a-tio trifosfatoNEN (Boston, Massachusetts)NLP-016
Collettore a vuotoFisher ScientificXX1002500Millipore  25  mm Filtro sottovuoto per microanalisi in vetro
Collettore per vuotoMilliporeXX27025521225 Collettore per vuoto di campionamento
NitrocellulosaMilliporeHAWP
NitrocellulosaSchleicher & SchuellPROTRAN
Kit di defosforiazioneNEBM0508
T4 Polinucleotide chinasiNEBM0201S
Proteinasi KNEBP8107S
T7 RNA polimerasiNEBM0251S
RNasinPromegaRNase inibitore
Piastre di vetroStandardStandard
Apparecchiature per elettroforesi su gelStandardStandard Pellicole
radiograficheStandardStandard Soluzioni
in gel di poliacrilammideStandardStandard

Riferimenti

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