Articolo metodologico

Il Barnacle Balanus BalanUs come modello Marine - coltura e l'espressione genica

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DOI:

10.3791/57825

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8 agosto 2018

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1Department of Marine Sciences, University of Gothenburg, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg, 3IVL Swedish Environmental Research Institute

In questo articolo

Sommario

Il barnacle BalanUs Balanus (Amphibalanus) è un modello per lo studio di osmoregolazione e antivegetativa. Tuttavia, riproduzione stagionale naturale produce un imprevedibile approvvigionamento di cyprid larve. Qui, un protocollo per la coltura di tutto l'anno di b. BalanUs è descritto, compresa la produzione di larve. L'uso di balani coltivate in studi di espressione genica è illustrato.

Abstract

Cirripedi sono crostacei marini con un adulto sessile e larve planctoniche, liberamente natante. Il barnacle BalanUs Balanus (Amphibalanus) è particolarmente rilevante come un modello per gli studi di osmoregulatory meccanismi a causa della sua estrema tolleranza alla salinità bassa. È inoltre ampiamente usato come un modello di sedimentazione biologia, in particolare in relazione alla ricerca di antivegetativa. Tuttavia, riproduzione stagionale naturale produce un rifornimento imprevedibile delle larve cyprid per gli studi. Un protocollo per la coltura di tutto l'anno di BalanUs b. è stata sviluppata e una descrizione dettagliata di tutti i passaggi nella linea di produzione è descritto (cioè, la creazione di culture adulte sui pannelli, raccolta e allevamento di larve di Barnacle e la somministrazione di mangimi per gli adulti e larve). La descrizione anche fornisce indicazioni sulla risoluzione dei problemi e vengono illustrati i parametri critici (ad esempio, la rimozione della contaminazione, la produzione di mangimi di alta qualità, la manodopera necessaria e l'importanza della qualità dell'acqua di mare). Ogni lotto dal sistema di coltura al massimo produce all'incirca 12.000 naupli e in una settimana, quindi fino a quasi 50.000 larve alla settimana possono essere prodotti in grado di fornire quattro batch. Il metodo utilizzato per cultura b. BalanUs è, probabilmente, in larga misura applicabile anche ad altri invertebrati marini con free-swimminglarvae. Protocolli sono presentati per la dissezione di vari tessuti da adulti, nonché la produzione di RNA di alta qualità per gli studi sull'espressione genica. È anche descritti come coltivati adulti e allevati cyprids può essere utilizzato in una vasta gamma di disegni sperimentali per l'esame di espressione genica in relazione a fattori esterni. L'utilizzo di barnacles coltivate nell'espressione genica è illustrato con studi di ruoli possibili osmoregulatory di Na+/k+ dell'atpasi e acquaporine.

Introduzione

Cirripedi sono crostacei marini con un adulto sessile e larve planctoniche, liberamente natante. La maggior parte delle 1.200 specie di barnacles abitano acque poco profonde e molti sono spesso esposti a bassa salinità. Una specie, il barnacle bay improvvisa Balanus (Amphibalanus) (b. BalanUs), può tollerare quasi d'acqua dolce e Charles Darwin descritto questa specie da un piccolo torrente nell'estuario del Rio de la Plata in Uruguay1. La salinità tolow estrema tolleranza rende BalanUs b. un modello particolarmente rilevante per gli studi di meccanismi osmoregulatory2,3. Questo barnacle preferisce condizioni salmastre ma è capace di vivere in acque con salinità da circa 1,6 psu ad un massimo di 40 psu4. È la specie di barnacle solo trovata nel Mar Baltico salmastro. B. BalanUs si ritiene provengano dalla costa orientale del continente americano, ma oggi si trova in tutto il mondo a causa di dispersione di spedizione5. È un importante organismo incrostazione e si trova comunemente su rocce, moli e scafi ed è quindi di interesse generale per la comprensione dei meccanismi di biofouling sulle costruzioni in acque marine e salmastre6,7.

Simile alla maggior parte altri barnacles, b. BalanUs è ermafroditi con fecondazione incrociata; riproduzione si verifica attraverso l'accoppiamento tra individui vicini utilizzando un pene allungata e fecondazione interna. Il periodo riproduttivo è principalmente da maggio a settembre. B. BalanUs ha sette stadi larvali pelagici (sei naupli seguite da una fase di cyprid8). L'ovulo fecondato si schiude in una larva nauplius che è liberamente natante e si nutre nella colonna d'acqua per fino a parecchie settimane prima muta in una larva di cyprid-di alimentazione. Il cyprid utilizza più segnali per trovare un luogo adatto per stabilirsi e poi subisce metamorfosi in un sessile barnacle giovanile9. Le specie possono essere coltivate in laboratorio e ha una durata di 1 – 2 anni nel mare (2-3 anni nella cultura di laboratorio). In media, b. BalanUs cresce fino a 10 mm di diametro (con un massimo di circa 20 mm) e raggiunge un'altezza massima di circa 6 mm (anche se può crescere più alto sotto condizioni di sovraffollamento). La specie può essere identificato dal suo guscio liscio anche calcareo (bianco o grigiastro), la base calcarea radialmente con motivi della piastra shell e la forma delle piastre tergal1,10.

Il barnacle BalanUs b. ha diverse caratteristiche vantaggiose come un modello per gli studi di osmoregolazione, con un focus sui meccanismi molecolari e fisiologici, nonché interazioni ecologiche e conseguenze evolutive. È inoltre ampiamente usato come modello per le indagini di sedimentazione biologia, in particolare in relazione alla ricerca di antivegetativa e i meccanismi coinvolti7,11,12,13. Tuttavia, riproduzione stagionale naturale produce un rifornimento imprevedibile delle larve cyprid per gli studi. La capacità di cultura questo barnacle attraverso il suo intero ciclo di vita tutto l'anno è, pertanto, una risorsa importante per consentire vari tipi di studi molecolari e meccanicistici. Inoltre, la presenza nelle acque marine/salmastre italiane consente una combinazione di campo e studi sperimentali. Allevamento controllato può anche produrre le famiglie dei pedigree noti per coltura a lungo termine14e un tempo di generazione di pochi mesi potrebbe consentire l'evoluzione sperimentale a lungo termine. C'è anche un genoma di bozza e trascrittomi diversi disponibili, e queste risorse sono state utilizzate per la clonazione di diversi geni (ad esempio, i geni di importanza nell'osmoregolazione)2,3.

L'obiettivo di questo protocollo è di descrivere le modalità stabilire e mantenere una cultura di barnacle b. BalanUs durante tutto l'anno al fine di eseguire studi di espressione genica su adulti o larve di questo organismo. Rittschof et al. 15 brevemente descritto un metodo per la coltura di barnacles dal rilascio di naupli per l'insediamento di cyprids per le specie Balanus amphitrite. Il protocollo è stato adattato per la coltura di tutto l'anno di b. BalanUs presso Tjärnö Marine Research Laboratory (Svezia), e una descrizione dettagliata di tutte le fasi della linea di produzione è delineata, compresa la produzione e allevamento di barnacle le larve, come pure la somministrazione di mangimi per gli adulti e le larve. Per una panoramica della procedura completa, vedere la Figura 1. L'uso del sistema di coltura è esemplificato con alcuni comuni set-up sperimentale e illustrata in studi di genomica funzionale di Na+/k+ dell'atpasi e acquaporine, chiarire le loro funzioni possibili nell'osmoregolazione2, 3. A volte è indispensabile esaminare l'espressione genica in tessuti specifici, e alcune delle basi della dissezione barnacle saranno coperti. Con una buona fornitura di acqua di mare di alta qualità, alla coltura di barnacle BalanUs b.e potenzialmente molte altre specie, dovrebbe essere possibile in laboratori marini in tutto il mondo.

Protocollo

1. raccolta di balani adulti nel campo per iniziare un nuovo riproduttori

  1. Distribuisce pannelli trasparenti in materiale termoplastico (poli-metilmetacrilato) (110 x 110 x 1,5 mm3) presso ≈ 1 – 3 m di profondità in acque calme per raccogliere barnacles adulto dal campo. Utilizzano i frame che possono prendere diversi pannelli (Figura 2A), praticare 2 fori (con un diametro di 6 mm) negli angoli superiori di ogni pannello e attachthepanelstotherackusingcableties. Così, thepanelswillhangverticallyin l'acqua.
    1. Quando l'insediamento di barnacles verificato (identificati come piccoli puntini bianchi duri sui pannelli), lasciare i pannelli per almeno 2 – 3 settimane per assicurarsi che i cirripedi sono grandi abbastanza (5 mm) da trasferire al laboratorio senza ottenere secchi o danneggiati.
  2. Portare i pannelli in laboratorio quando essi sono coperti con una costante BalanUs b. che hanno raggiunto una dimensione di ca. diametro 5 mm.
    Nota: Il tempo per gli adulti a sviluppare a 5 mm nel campo è altamente dipendente dalla disponibilità di cibo e la temperatura. Normalmente, questo richiede circa 3 settimane presso il laboratorio di ricerca Marine Tjärnö (58.87 ° N, 11,14 ° E). Più comunemente, pannelli per i nuovi riproduttori sono generalmente distribuiti a fine giugno e raccolti alla fine di agosto.
  3. Prima di introdurre i pannelli in centro di cultura, pulire altri organismi dai pannelli. È più importante rimuovere altre specie di barnacle. Siete pregati di notare che è importante pulire frequentemente i pannelli per sbarazzarsi di specie contaminanti durante la coltivazione, poiché ciò aumenterà in modo significativo le possibilità di sopravvivenza dei riproduttori.
  4. Posizionare i pannelli in verticale sul bordo in uno stand con scanalature fresate in un vassoio di polietilene (400 x 400 x 20 mm3) (figure 2 e 2E). Le scanalature nello stand sono distanziate di 15 mm.
  5. Al fine di preparare i vassoi, fare una porta di ingresso alla base e una porta di uscita in alto sul lato opposto di ogni vassoio. Collegare la porta di ingresso di ogni vassoio ad un serbatoio 100 L contenenti circa 30 L di acqua, con un ingresso di acqua di mare aperto a 20 ° C per consentire un flusso continuo ad una velocità di ca. 2 L / min.
    Nota: Fino a 8 vassoi sono stati collegati ad un singolo serbatoio 100 L.
  6. Collegare il serbatoio 100 L di acqua di mare a temperatura controllata (20 ° C) (ad es., fornita da una pompa di calore, lo scambio di calore dall'acqua di mare in ingresso).
    Nota: Il barnacle BalanUs b. può crescere e riprodursi a una salinità pieno Marina (30 – 35 psu); Tuttavia, ridurre la salinità a ca. 25 psu con l'aggiunta di acqua dolce al serbatoio 100 L aumenta la produzione di larve dalla cultura.

2. a partire di nuove generazioni di adulti da coltivate Cyprids

  1. Costruire cubi di pannelli termoplastici aperte nella parte superiore di nastratura 5 pannelli insieme usando un nastro non tossico, resistente all'acqua.
  2. Mettere il cubo in un piccolo vassoio (in caso di perdite) e riempire con acqua di mare (25 psu). Mantenere l'acqua a temperatura ambiente (ca. 20 ° C). Aggiungere circa 200 cyprids nella parte superiore del cubo.
  3. Nutrire i giovani con 100 mL di neritiche marinoi ogni altro giorno (vedi passo 5) mentre nel cubo.
    Nota: Barnacles giovanile può avere difficoltà con l'ingestione di Artemia salina (vedi passo 3) dal momento che sono grande e, quindi, difficile da digerire per un cirripede appena depositato.
  4. Cambiare l'acqua 1 volta a settimana.
  5. Dopo 2 settimane, quando i pannelli contengono i giovani abbastanza consolidati di almeno 5 mm di diametro, smontare il cubo e spostare i pannelli con i giovani ai vassoi con flusso-throughseawater e, successivamente, nutrire i cirripedi con naupli di Artemia salina a. .

3. cultura di naupli di Artemia salina come mangime per adulti Barnacles

  1. Impostare un sistema di coltura per a. salina utilizzando una bottiglia di plastica 1,5 L dove il bottomis tagliato fuori e la bottiglia è posizionata capovolto, in uno stand e illuminate dal lato. Montare il collo di bottiglia ad un tubo di silicone con una pinza e collegarlo ad una pompa di aerazione (Figura 2D).
  2. Per covare le uova, aggiungere circa 15 mL di riposa asciutte uova di Artemia per 1 L ofseawater.
    Nota: Artemia le uova si schiudono in larve nauplius dopo 24 – 48 h. Per ritardare la schiusa di naupli di Artemia salina a. (ad es., durante i fine settimana), la luce può essere spento per ridurre leggermente la temperatura.
  3. Per raccogliere i naupli di Artemia , spegnere l'aerazione e scurire la parte superiore della bottiglia con foglio di alluminio (o simili ad esempio, una lattina)... Per illuminare che la parte inferiore della bottiglia per 10 min. covato Artemia nauplii nuoterà verso la luce. Cisti non-covato affonderanno alla parte inferiore, e conchiglie di ciste galleggia alla superficie.
  4. Aprire il morsetto nella parte inferiore. Raccogliere la frazione intermedia come una densa popolazione di naupli di nuoto.
    Nota: Tutti i giorni (tranne il fine settimana), 1 L della sospensione di naupli di Artemia densa è stato aggiunto manualmente al serbatoio 100 L collegamento ai vassoi con i cirripedi adulti. Evitare qualsiasi alimentazione con gusci vuoti ciste, poiché essi non fornire nutrizione e causare principalmente dover pulire la cultura ad intervalli più frequenti.

4. raccolta e allevamento di larve di Barnacle

  1. Pulire i pannelli con i balani adulti spruzzando delicatamente con acqua dolce e, se necessario, rimuovere eventuali incrostazioni dai gusci di barnacle e pannelli utilizzando uno spazzolino morbido. Inoltre, pulire i vassoi (senza barnacles) e tubi a caldo (75 ° C) d'acqua dolce.
  2. Inserire un setaccio fatto di una rete di plancton 90 µm incollata all'estremità di un tubo in PVC tagliato (16 cm di diametro, 15 cm di altezza) in un vassoio di polietilene (30 x 20 x 10 cm3) con una porta di overflow. Raccogliere le larve di b. BalanUs nel setaccio durante la notte (Figura 2C).
    Nota: Il setaccio è stato posizionato appena sotto la porta di uscita del vassoio dei pannelli barnacle per ricevere l'acqua outflowing e filtrare i naupli di Artemia. Le larve sono rimasti nel setaccio mentre l'acqua di mare ha traboccato il piccolo vassoio. Questo piccolo vassoio ha garantito che il setaccio mai driedout.
  3. Mettere un secchio di 30 L in un bagno d'acqua di grandi dimensioni dove la temperatura è mantenuta a 26 ° C, con acquario pesce serbatoio riscaldamento (Figura 2E). L'aerazione e l'agitazione sono assicurate da bolle di aria attraverso il sistema.
  4. Riempire il secchio con 20 L di acqua di mare filtrata (0,2 µm; 25 psu). Aggiungere 1 litro nel secchio di un mix di 60/40 di microalghe 2 diatomea, S. marinoi e c. gracilis (vedi passo 5). Questo vi darà una densità iniziale di circa 5 x 104 diatomee / mL nel secchio.
    Nota: Le larve di Artemia Barnacle sono positivamente una. Le benne sono state fatte di plastica opaca bianca con coperchi che lasciano passare un po' di luce. Durante l'inverno, la camera era illuminata durante il giorno (08:00 – 17:00), ma buio durante la notte. Durante l'estate, la luce esterna è entrato in camera durante la maggior parte della giornata.
  5. Trasferire i raccolti b. BalanUs naupli per un piatto di cristallizzazione (300 mL; 90 mm di diametro e 50 mm di altezza).
  6. Illuminare il piatto dal lato, che attirerà le larve alla sorgente luminosa. Raccogliere i naupli di barnacle che raccolgono la luce in ingresso con una pipetta e trasferirli su un altro piatto di cristallizzazione. Rimuovere qualsiasi residuo delle larve di Artemia .
  7. Trasferire le larve di Artemia BalanUs b. in un recipiente con 1 L di acqua di mare filtrata.
  8. Contare il numero di naupli mescolando il becher delicatamente per ottenere una sospensione anche di larve e poi prendendo cinque campione 1 mL da luoghi diversi nel becher. Trasferire ciascun campione in una micropiastra per un'ispezione visiva con uno stereomicroscopio. Contare il numero di naupli di Artemia in ciascuno dei cinque campioni e aggiungerli up.
  9. Moltiplicare il numero contato per 200 (1.000 mL, 5 mL) per stimare quante migliaia di larve è nel becher intero. Se ci sono troppe le larve nauplius nel becher, diluire il campione fino a quando la densità è al massimo 14.000 larve/L (solitamente nella gamma di 11.000 – 12.000 larve/L).
  10. Aggiungere 1 L di b. BalanUs naupli a cucchiaia, aggiungendo così circa 11.000 – 12.000 larve per secchio.
    Nota: Assicurarsi di non aggiungere ulteriori naupli di Artemia, poiché questo comporta troppo poco cibo in relazione le larve e, quindi, aumentare la mortalità.
  11. Dopo 3 giorni, raccogliere naupli barnacle su un setaccio di 90 µm. Quindi pulire il secchio (con 75 ° C acqua dolce), riempirlo con acqua di mare filtrata, aggiungere un nuovo feed di diatomea (la stessa quantità come all'inizio) e infine aggiungere di nuovo i naupli di Artemia. Cyprids iniziano a comparire dopo circa 6 giorni (± 1 giorno).
  12. Raccogliere cyprids prima con un setaccio 90 µm (progettato come nel punto 4.2). Quindi separare naupli non mutato ad intervalli barnacle e cyprids con un setaccio 320 µm in cima un 160 µm setaccio. B. BalanUs naupli raccoglierà nel 320 µm setaccio e cyprids nel setaccio 160 µm.
    Nota: Le larve cyprid possono essere conservate a 10 ° C in un piatto di cristallizzazione nel buio per un uso successivo, fino a ca. 6 giorni. Tuttavia, il deposito può influenzare la qualità e le prestazioni delle larve barnacle, così gli esperimenti confrontando diversi trattamenti idealmente dovrebbero usare larve dal medesimo lotto (e tempo deposito simile) per evitare confusione effetti16.

5. la cultura di microalghe come mangime per le larve Nauplius Barnacle

Nota: Le alghe sono state coltivate in 3 diversi tipi di culture: (i) stock culture, che sono per il mantenimento a lungo termine dei ceppi che sono stati usati per l'inoculazione di scaling-up; (ii) inizio culture, che sono il primo passo in scala-up; e infine (iii) la cultura di produzione, che è la scala di produzione finale di grandi quantità di alghe come barnacle feed.

  1. Ordine della diatomea specie dalla cultura raccolta di alghe e protozoi (CCAP) ad essere impiegato come alimento per le larve nauplius barnacle. Le 2 specie neritiche marinoi (ceppo CCAP 1077/5) e interne simplex var. gracilis (ceppo CCAP 1085/3) entrambi danno buoni risultati come feed.
  2. Filtro acqua di mare tutti da utilizzare nelle colture algale, utilizzando un sistema di filtro della cartuccia con un diametro dei pori nominale di 0,2 µm. (l'acqua di mare filtrata è anche utilizzabile per la schiusa delle uova di a. salina e alla coltura delle larve nauplius barnacle). Sterilizzare in autoclave l'acqua di mare filtrata per le colture algali (a 105 ° C per 5 min).
  3. Preparare un supporto per le impostazioni cultura di microalghe, utilizzando in autoclave con acqua di mare arricchita con soluzione di f/2 di Guillard contenente nutrienti inorganici, metalli in traccia e vitamine (Vedi Guillard 197517 per la ricetta dettagliata). Inoltre, preparare una soluzione di silicato (Na2SiO3), ma tenere lo stesso separato dall'arricchimento di f/2 per prevenire una precipitazione solida.
    Nota: Le concentrazioni di soluzione di riserva di arricchimento e la soluzione di riserva di silicato sono state preparate per essere utilizzati come un'aggiunta di 1 mL di ciascuno per 1 L di acqua di mare.
  4. Autoclave tutte le apparecchiature utilizzate nella coltura Alga a 120 ° C per 20 min. provette con tappo a vite di Autoclave con 1 mL di arricchimento di f/2 e 1 mL di soluzione di silicato. Aggiungere le soluzioni di arricchimento e silicato di theseawater quando la cristalleria in autoclave e liquidi sono raffreddati a temperatura ambiente.
  5. Crescere le colture di riserva di microalghe in 40 mL provette con tappo a vite.
    1. Riempire le provette con circa 30 mL di acqua di mare arricchita. Inoculare le culture con una pipetta Pasteur sterile utilizzando circa 1 mL di una cultura stock 2 settimane di età. Il tappo a vite è quindi montato ma non serrato, per consentire qualche scambio di gas. Se disponibile, l'inoculazione deve avvenire in un flusso laminare per ridurre il rischio di contaminazione.
      Nota: La mira a mantenere le colture algali a lungo termine e di servire come inoculo per avviare culture le colture di riserva. Colture di riserva sono stati inoculati nuovamente ogni 2 settimane.
    2. Esporre la nuova cultura stock per una luce bianca con un'intensità di ca. 25 – 50 µmole m-2s-1 (con un ciclo luce-buio di 16:8 h). Spostare le vecchie colture stock a una bassa intensità di luce come un back-up. Scartare qualsiasi colture di riserva 2 settimane di età.
  6. Per la scala alla cultura di produzione di alghe, inoculare le culture di inizio da colture stock e farle crescere in 500 mL Erlenmeyerflasks.
    1. Matracci di Erlenmeyer autoclave 4, pipette e tappi di cotone con 300 mL di acqua di mare filtrata (0,2 µm) e 4 provette con 0,3 mL di arricchimento f/2 e 4 con soluzioni di silicato. Raffreddare l'arricchimento di f/2 e il silicato a temperatura ambiente e aggiungere le soluzioni per i matracci di Erlenmeyer. Inoculare loro con ca. 1 mL della cultura 2 - settimana-vecchia stock.
      Nota: Preparare 2 boccette con S. marinoi e 2 con c. simplex.
    2. Mettere i palloni su una tavola vibrante in un'intensità luminosa di 50 µmole m-2s-1. Quando le culture di inizio hanno acquisito dense popolazioni algali (giallo-marrone in colore), sono pronti per essere utilizzato come inoculo per le culture di produzione che forniranno il barnacle larve con il cibo.
  7. Coltivare culture produzione in bottiglie in policarbonato 4L con tappi in silicone con 2 porte forati dotati di tubi di vetro.
    1. Collegare 1 tubetto di vetro che arrivano fino al fondo della bottiglia per una pompa di aria tramite un tubo di silicone dotato di filtro aria 0,2 µm. Assicurarsi che l'estremità del tubo di vetro secondo appena sotto il tappo in silicone ed è riempito di cotone per consentire l'uscita dell'aria iniettata.
    2. Ogni settimana, riempire quattro 4 L bottiglie con autoclave e acqua di mare filtrata li insieme con i tappi. Inoltre, autoclave 4 provette con 4 mL di soluzioni di arricchimento e silicato di f/2.
    3. Dopo il raffreddamento, aggiungere l'arricchimento di f/2 e soluzioni di silicato per le bottiglie e poi li inoculare con metà del volume delle culture Start-up in matracci di Erlenmeyer.
    4. Mettete le quattro bottiglie di 4 L a un'intensità luminosa di 50 – 100 µmole m-2s-1.
    5. Raccogliere le culture di produzione dopo ca. 1 settimana; Essi sono quindi sufficientemente densi per essere utilizzato per alimentare il barnacle larve nauplius.
      Nota: Produzione culture hanno una durata di circa 2 settimane, il che significa che ci sono 8 bottiglie di produzione attiva in qualsiasi momento.

6. progettazione di studi sperimentali utilizzando Barnacles

  1. Collocare i pannelli con i balani giovanili o adulti negli acquari controllate dove possono svilupparsi sotto identicalconditions. Si tratta di un esperimento di giardino comune, che, per esempio, può essere utilizzato per comprendere gli adattamenti locali o plasticità fenotipica18, o per studiare i cambiamenti di espressione genica in relazione a fattori esterni (ad es., salinità, temperatura o pH).
    Nota: È anche possibile utilizzare barnacles direttamente raccolti dal campo sui pannelli. Un vantaggio dell'utilizzo di individui allevati in laboratorio è che gli effetti materni possono essere evitati quando si utilizza l'ultima generazione della prole.
    1. Esporre i balani alle specifiche condizioni ambientali durante un intervallo di chosentime, seguito dalla raccolta degli adulti (ad es., per gli studi sull'espressione genica)2.
  2. Per gli esperimenti con le larve di cyprid per lo studio di espressione genica3, posizionare il cyprids negli acquari controllati dove le larve possono essere coltivate in condizioni identiche.
    1. Raccogliere il cyprids dopo un periodo di tempo specificato filtrando con setacci (come descritto al punto 4.7) ed estrarre RNA secondo i protocolli qui sotto (punto 8).

7. dissezione di balani

  1. Pulire lo spazio laboratorio dove vengono eseguite la dissezione e il campionamento del DNA, bothbefore e tra gli individui, compresi tutti gli strumenti di dissezione. Questa operazione viene eseguita utilizzando cloro per il banco (o etanolo al 96% per il forcipe).
    Nota: Tubi etichettati contenenti mezzi di fissazione (etanolo o una soluzione di stabilizzazione di RNA) sono preparati in anticipo.
  2. Selezionare individui affamati grandi e a breve termine (non dar loro da mangiare per 2 giorni prima della dissezione). Pulire il guscio di barnacle con uno spazzolino da denti per minimizzare il rischio di contaminazione da parte di altre specie (ad es., batteri, alghe) e risciacquare con acqua.
    Nota: La ragione per la fame a breve termine degli individui prima della dissezione è quello di evitare qualsiasi contaminazione del DNA (per esempio, da cisti di Artemia nell'intestino).
  3. Posizionare i cirripedi individuali su una superficie piana, sia associata a un pannello o sciolta in un piatto. Sezionare i rispettivi tessuti dall'adulto. Ci sono diversi modi per sezionare barnacles, a seconda dello scopo dello studio.
    1. Metodo di dissezione r: fissaggio il barnacle intero più rapidamente possibile.
      1. Rimuovere il barnacle intero dal pannello utilizzando un bisturi, inserendola sotto il barnacle e vicino alla superficie del pannello.
        Nota: Nella maggior parte dei casi, questa manipolazione lascia la piastra basale quasi intatto, non influenzando così il barnacle all'interno.
      2. Attentamente rompere il guscio esterno su un lato con l'inserimento di forcipe (Figura 3). Questo viene fatto per facilitare l'intrusione di un mezzo fissanti all'interno del guscio.
        Nota: Se la shell non è rotto a tutti prima di mettere il barnacle in una provetta, può portare a un più lento processo di fissazione e una qualità inferiore del DNA più tardi.
      3. Mettere il barnacle rotto nella provetta contenente una soluzione di storage di RNA o etanolo. Lasciare il barnacle nella soluzione per almeno 24 h per la sua fissazione. Quando il barnacle è fissa, l'animale può essere preso fuori dalla media di fissazione e posizionato su un vassoio di dissezione. I cirri, mantello e soma (corpo) possono essere separati gli uni dagli altri e collocati in provette separate per ulteriori estrazioni di DNA o RNA.
        Nota: È importante osservare se lamelle di uovo con le uova fecondate sono presenti all'interno il barnacle. Se presenti, questi dovrebbero essere rimosse prima di procedere con le estrazioni di DNA per evitare di trovare più genotipi nel campione.
    2. Metodo b: rimuovere il barnacle dalla shell prima della sua fissazione di dissezione.
      Nota: Questo metodo non potrebbero sempre nel mantello campionato dato che è collegato all'interno della calcareousshell. Ma può essere un metodo rapido per il campionamento del DNA da un individuo.
      1. Rimuovere con cautela, usando il forcipe di dissezione, le piastre tergal e scutale (Figura 3) inserendo la punta della pinza tra le piastre tergal e scutale, afferrando il possesso di una piastra, e tirando delicatamente per rimuoverli.
      2. Gru a benna tenere dei cirri con il forcipe e tirare il barnacle verso l'esterno e inserirlo direttamente in etanolo al 96% o RNA stabilizzando la soluzione per il fissaggio...
        Nota: A volte, il mantello sarà anche campionato allo stesso tempo, come si è visto come un sottile epitelio con pigmentazione scura (in b. BalanUs). In caso contrario, il mantello può essere rimosso dall'interno della shell usando un bisturi e, successivamente, posto in etanolo o RNA soluzione di stabilizzazione.
        Nota: Le piastre tergal e scutale (se intatto) possono essere essiccate e salvate dal momento che sono utili per identificazione10 la specie. Una raccomandazione generale, se c'è qualche dubbio di specie, è quello di fotografare anche il barnacle intero prima dell'inizializzazione della dissezione.

8. RNA estrazione per PCR quantitativa

  1. Mettere gli adulti ad essere utilizzato per l'estrazione di RNA in un RNA soluzione di stabilizzazione, incubare loro durante la notte (fino a 24 h) a 4 ° C e poi salvarli a-80 ° C.
    Nota: Cyprid larve sono preferenzialmente a secco-congelato, senza RNA più tardi direttamente a-80 ° C, mettendoli in provette per criogenia e poi immergere brevemente i tubi (30 s) in azoto liquido prima di riporli a-80 ° C.
  2. Al momento dell'estrazione RNA, scongelare i cirripedi sul ghiaccio e utilizzarli intatto o sezionare i tessuti da utilizzare (vedi step 7).
    Nota: a causa di alta diversità genetica tra gli individui (variazione di 3 – 5% ≈ nella codifica delle regioni; Alm Rosenblad et al., dati non pubblicati) è consigliabile poola numero di individui adulti, che minimizza l'effetto di variazione di sequenza fra gli individui nel successivo passaggio qPCR.
  3. Per il RNAextraction, aggiungere 350 µ l di tampone di lisi fornito con un kit di preparazione di RNA nelle provette di omogeneizzazione contenente 2,8 mm di perle in ceramica.
    Nota: Perle di ceramica forniscono una migliore resa del RNA rispetto a sonicazione (Rappresentante risultati).
  4. Prendere un adulto barnacle (intera o tessuti) o raccogliere un minimo di 20 larve cyprid usando il forcipe e metterli nelle provette di omogeneizzazione.
  5. Procedere direttamente alla rottura e omogeneizzazione con un laminatoio del branello.
  6. Mettere i tubi di omogeneizzazione con il campione e perline in titolare di laminatoio del branello. Scuoterli con una frequenza di 4.0 m/s per 20 s. raffreddare il campione per 1 min sul ghiaccio. Ripetere 2 volte.
  7. Preparare il RNA secondo il protocollo del kit di isolamento del RNA commercialmente disponibili.
    Nota: Una valutazione dei rischi (tra cui una lettura di schede di sicurezza) deve essere eseguita prima di utilizzare metodi di estrazione di RNA, per identificare le sostanze chimiche pericolose che richiedono l'uso di una cappa aspirante e altri indumenti protettivi, inclusi i guanti (ad es., l'aggiunta di β-mercaptoetanolo nel buffer di lisi durante l'estrazione di RNA deve essere eseguita in una cappa aspirante).
  8. Quantificare il RNA. Preparare una soluzione di lavoro e aggiungere standard e campioni per un volume totale di 200 µ l. Vortex per 2 – 3 s e li Incubare per 2 min inserire le provette in un fluorimetro e prendere le letture.
  9. Controllare i campioni di RNA per le eventuali contaminazioni di proteina con uno spettrofotometro e controllare la loro integrità di RNA con un sistema di elettroforesi automatizzata (Rappresentante risultati).
    Nota: Per i preparati di buona qualità, RNA è consigliabile avere un rapporto di 260/280 nm di un DNA di circa 1,8 e 2 – 2.2. Valori inferiori indicano proteina contaminazioni e che la procedura di estrazione deve essere ottimizzato.

9. Gene Expression: sintesi del cDNA e qPCR

  1. Trattare la dnasi RNAwith ottenuti per rimuovere qualsiasi remainingDNA prima di effettuare il cDNA per qPCR.
    1. Verifica di contaminazione di DNA genomico con l'aggiunta di un campione di RNA ma nessun trascrittasi inversa durante la preparazione del cDNA. Se c'è un'amplificazione di PCR del gene selezionato il cDNA fatto senza trascrittasi inversa, non c'è contaminazione da DNA a RNA.
      Nota: Per i campioni da utilizzare per RNA-seq (RNA-sequenziamento utilizzando tecnologia di sequenziamento di nuova generazione), il passo di dnasi è meno critico. In particolare, per i campioni con bassi livelli di RNA, il passo di dnasi può essere omesse per non perdere troppo del RNA nel processo.
  2. Eseguire sintesi del cDNA RNA dnasi-trattati usando una quantità di RNA all'interno dell'intervallo specificato nel kit di sintesi di cDNA commerciale, ma di solito uso almeno 50 ng.
  3. Disegnare primers di qPCR affinché essi tempri parti del gene di interesse dove l'identità di sequenza tra individui è più in alto possibile, ma l'identità di sequenza tra gene paralogs è più basso possibile. Si prega di consultare le pubblicazioni corrispondenti per le coppie di primer specifiche utilizzate per studi di espressione genica di Na+/k+ ATPasi3 e acquaporine2 (Figura 5).
    Nota: Per questo scopo, i dati di sequenza di RNA-seq da centinaia di cyprids o parecchi adulti possono essere utilizzati.
  4. Disegnare primers per un gene da utilizzarsi per la normalizzazione dei livelli di espressione (ad esempio, l'actina). I primers utilizzati con successo per l'actina sono, in avanti: 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3' e d'inversione: 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'.
    Nota: L'actina è un gene di controllo comunemente utilizzato. Tuttavia, gli altri sono stati suggeriti come un riferimento e testati su barnacles19. Oltre l'actina, l'uso di RPL8, 36B4, EF1 e NADHd1 come riferimento è stato testato3. Si è concluso che non ci sono differenze grandi nei livelli di espressione dei geni rispettivi riferimento tra soma, cirri, adulto o cyprids.
  5. Ottimizzare la temperatura di ricottura per il primer progettato aggiungendo gli importi aumentanti di cDNA (tipicamente nella gamma di 0,25 – 50 ng) ad una miscela contenente SYBR Green, dNTP, polimerasi e 0,3 µM ciascuna di primer forward e reverse.
  6. Eseguire protocolli di qPCR a diverse temperature di ricottura come segue: una temperatura di denaturazione iniziale di 95 ° C per 3 min, un punto di denaturazione a 95 ° C per 20 s, ricottura temperature di 55-63 ° C per 20 s e un allungamento a 72 ° C per 30 s. In totale, eseguire 40 cicli di PCR.
    Nota: Primer efficienze dovrebbe trovarsi nella gamma di 90-105% e sono calcolate come E = (10^(-1/slope)-1) x 100 dove la pendenza è la pendenza della curva ottenuta durante la stampa il valore di registro delle concentrazioni del cDNA contro i valori di soglia (Ct) del ciclo.
  7. Eseguire qPCR utilizzando una quantità appropriata di cDNA, solitamente 1 – 10 ng, utilizzando il protocollo PCR descritto nel passaggio 3 con la temperatura di annealing ottima trovata.
    Nota: La quantità maggiore di cDNA è utilizzata solo per geni che sono espressi in quantità estremamente bassa.

Risultati

Con la procedura descritta per la coltura delle adulto barnacles di BalanUs b., fino a quattro lotti di nauplius larve possono essere prodotto a settimana. Sarebbe possibile raccogliere larve nauplius quasi ogni notte, ma questo richiede sempre più persone e infrastrutture (con molti barnacles nei riproduttori, una cultura rilascerà larve continuamente). Un ulteriore fattore limitante per la produzione di larve sembra essere la disponibilità di mangimi di alta qualità, in particolare per quanto riguarda la diatomea neritiche. Al massimo, ogni batch dal sistema di coltura è costituito da circa 12.000 naupli di Artemia, quindi possono essere coltivate fino a 50.000 naupli a settimana. Tuttavia, alcune settimane ci possono essere fino a dieci volte meno larve prodotte. Un adulto può produrre fino a 7.000 larve per giorno14, che significa che 1 – 2 adulti stanno rilasciando larve per ogni batch. Entro una settimana, circa il 70-90% dei raccolti naupli si svilupperà in cyprids (producendo circa 30.000 cyprids alla settimana, al massimo) che può essere utilizzato per insediamento le analisi e gli studi molecolari.

Va sottolineato che ci sono variazioni nelle caratteristiche cyprid tra lotti, e in generale, ci sono grandi variazioni tra lotti di lotti all'interno . Ad esempio, il successo di sedimentazione in saggi di insediamento varia tra 30 e 70% per lotti diversi. Molto probabilmente, questo è causato dalla variazione genetica individuale tra le specifiche coppie di adulti rilasciando larve durante i periodi di campionamento diverso. Naturalmente, si consiglia che esperimenti ripetuti (replica biologico) devono includere cyprids da un numero di batch se più generale dichiarazioni circa i risultati devono essere effettuati. La variazione lotto mette richieste sul disegno sperimentale, dove devono essere applicate controlli adeguati e normalizzazioni in studi di espressione genica. Tuttavia, anche dopo che sono state implementate diverse procedure di normalizzazione statistica che riducono notevolmente la variazione tra lotti, alcuni effetti del batch sono solitamente ancora apparenti (dati non pubblicati).

Seguendo il protocollo fornito, è possibile ottenere, in media, 500 ng di RNA di alta qualità da cyprids appena 20, indipendentemente dalla fase di insediamento barnacle (tabella 1). La qualità del RNA viene solitamente misurata come rapporto tra i picchi 18S e 28S (posizione prevista dei due picchi sono indicate nella Figura 4). Tuttavia, nel caso di barnacles e molti altri artropodi, il rRNA 28S si rompe quando riscaldato (come parte del metodo di analisi) e migra insieme con il picco di 18S20. Ecco perché c'è, in linea di principio, un singolo picco di rRNA in questo tipo di analisi per barnacles. È chiaro da questo test (Figura 4) che un'omogeneizzazione di perle in ceramica fornisce il RNA con la massima integrità ed è, pertanto, il metodo di scelta. il RNA è sufficiente in quantità e qualità per generare le librerie di sequenziamento di alta qualità per il sequenziamento, conseguente a una media di 70 milioni di letture per campione (il numero di letture, naturalmente, dipende dal livello di multiplazione durante la sequenziazione). La quantità di RNA è anche sufficiente per l'analisi di espressione di sintesi e qPCR cDNA di un gran numero di geni.

La figura 5 Mostra il risultato dalle analisi qPCR delle acquaporine e di Na+/k+ ATPasi (NAK1) della giuntura varianti, dove i cambiamenti di espressione sono stati studiati in risposta ai cambiamenti di stimoli ambientali2,3. Un confronto tra l'espressione relativa di lungo e breve di giuntura varianti di spettacoli NAK1 un duplice aumento per il mRNA di NAK1 lunga bassa salinità in relazione breve NAK (Figura 5A). Quindi, i dati indicano che lo splicing alternativo rende la forma lunga predominante in condizioni di bassa salinità. Nel caso di acquaporine, è evidente che i due-il trasporto di acqua paralogs AQP1 e AQP2 visualizzare l'espressione differenziale (Figura 5B). In particolare, nel tessuto del mantello, è evidente che l'AQP1 è sostanzialmente down-regolato a bassa salinità, che non si vede per AQP2. AQP2 Mostra invece un'espressione leggermente aumentata a bassa salinità, ma nel soma. Questi risultati forniscono una base per le indagini dei ruoli funzionali dei diversi trasportatori dello ione b. BalanUs e acquaporine nell'osmoregolazione barnacle.

Diagramma del ciclo di vita marino: campionamento di DNA/RNA, coltivazione di naupli e cipridi, processo di insediamento degli adulti.
Figura 1 : Panoramica di tutta la procedura e l'estrazione di RNA per studi di espressione genica negli adulti la coltura. Per avviare una nuova cultura, i pannelli sono fissate ad un telaio e distribuiti nel mare a 1-3 m di profondità. Dopo diverse settimane, i pannelli con adulti/giovani sono disposti verticalmente in rack in vassoi in laboratorio. Ogni vassoio contiene circa 40 pannelli con gli adulti. Con circa 100 adulti per pannello, in totale ≈ 4.000 individui adulti sono coltivati per vassoio. I cirripedi adulti sono nutriti con Artemia e può essere mantenuti anno-intorno. Le larve Nauplius sono raccolte più volte a settimana dalla vassoi tramite un filtraggio attraverso un setaccio. I naupli raccolti vengono trasferiti ai bucket mantenuto a 26 ° C in un bagno d'acqua e nutriti con microalghe. Naupli di Artemia sono allevati fino a quando non si muta in cyprids-di alimentazione, che sono raccolti dal filtro. Nuovi pannelli possono essere ottenute in laboratorio la sedimentazione del cyprids su pannelli, sia per fornire nuovi pannelli per l'anno-nei dintorni di cultura o da utilizzare per specifiche configurazioni sperimentali con alterate condizioni esterne. RNA viene poi Estratto da giovani/adulti alla fine dell'esperimento o a intervalli di tempo specifici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Esperimento di filtrazione acquatica; attrezzature e fasi di processo; configurazione della separazione dei sedimenti; ricerca.
Figura 2 : Immagini di alcuni passi importanti nella coltura procedura. (A) questa immagine mostra i fotogrammi con pannelli per la raccolta di nuove popolazioni dal campo. (B) questa immagine mostra i pannelli con adulto barnacles di b. BalanUs in rack che vengono inseriti nei vassoi. I pannelli sono posizionati circa 2 cm tra loro. (C) questa immagine mostra i vassoi con il barnacle pannelli e il serbatoio di alimentazione a sinistra. Da ogni cassetto, c'è una presa di corrente dove sono collocati i setacci per la raccolta delle larve nauplius. (D) questa immagine mostra che la produzione di artemie mangime per i cirripedi adulti. (E) questa immagine mostra l'allevamento di naupli di Artemia in secchi messi in un bagnetto ad acqua settato a 26 ° C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma anatomico dei cirripedi; placche opercolari, guscio, dettagli del corpo; studio biologico.
Figura 3 : Descrizione dei passi iniziali dissezione di balani adulti: rimozione del corpo dal suo guscio. (A) afferrare una delle piastre opercular inserendo forcipe delicatamente attraverso l'apertura. Tirare delicatamente per rimuovere la piastra ed esporre l'animale. (B) tirare fuori l'animale afferrando la parte di soma appena sotto i cirri. (C), questo pannello mostra l'anatomia generale di barnacles di ghianda. Il mantello e potenzialmente fecondati (nell'ovaia) rimanere nella cavità shell quando il corpo è tirato fuori. Una nota sull'anatomia di barnacle (per un resoconto più approfondito, Vedi Anderson)9: placche a muro di un cirripede pendenza verso l'interno, e insieme formano un cono di vulcano-come. Un'apertura, l'apertura, è coperto da due placche opercolare, che formano una porta, o un opercolo, a chiudere il diaframma. Barnacles di ghianda in genere hanno una piastra basale calcarea che è incollata saldamente al substrato; Tuttavia, alcune specie di balani mancanza questo piatto calcareo (ad es., S. balanoides). Barnacles secernono l'esoscheletro dal mantello scuro pigmentato (carapace). La superficie esterna del mantello a doppio strato è calcificata per diventare rigidi, mentre la superficie interna del mantello non è calcificata ed è quindi flessibile. All'interno l'apertura, i cirri sono presenti in una posizione retratta. Queste sono le appendici toraciche che barnacles utilizzare per l'alimentazione di sospensione. Le ovaie si trovano vicino alla base del barnacle, mentre i testicoli si trovano nel soma. Questa figura è stata adottata da Panova et al. 21 ed è stata pubblicata con il permesso di Springer. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Grafico del tempo di fluorescenza in funzione dell'intensità, analisi dei dati dei picchi di emissione, studio spettroscopico.
Figura 4 : Determinazione della integrità di rRNA mediante elettroforesi capillare. RNA è stato preparato da due metodi diversi di omogeneizzazione: sonicazione (A) e (B) perle in ceramica. L'unità sull'asse y, FU, acronimo di unità di fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Grafici a barre che confrontano gli effetti della salinità e della pCO₂ sull'espressione di NKA-L1/NAK-S; Espressione dell'acquaporina nei tessuti.
Figura 5 : Espressione genica deriva da due diversi studi di geni importanti per osmoregolazione in b. BalanUs. (A), questo pannello mostra l'espressione differenziale come misurato da qPCR di varianti di splicing del Na+/k+ dell'atpasi NAK1 in risposta a varie salinità e pCO2 livelli3. Nel trattamento bassa salinità, l'espressione dell'isoforma lunga (NAK1-L) è aumentato relativamente breve (ANOVA, P < 0,001). (B), questo pannello mostra l'espressione delle acquaporine in adulti di BalanUs b. durante la loro esposizione a varie salinità2. qPCR è stato utilizzato per determinare i livelli di espressione di aquaporin rispetto l'actina. Gli individui adulti sono stati incubati a 3 diverse salinità (3, 20 e 33 PSU) per 14 giorni. Per la preparazione di RNA, il soma, cirri e mantello degli adulti sono stati separati. In entrambe le figure, le barre di errore indicano la deviazione standard. Il * * e * * * indicare il livello di significatività (ANOVA), 0,01 e 0,001, rispettivamente. Queste cifre sono state modificate da Lind et al. 2 , 3. entrambe le figure sono pubblicate con l'autorizzazione di PLoS ONE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fase di stabilimentoQuantità totale di RNA (ng)
Libero per il nuoto512
Esplorazione: Chiudi ricerca518
Cyprid allegata550
Appena metamorfosato giovanile832

Tabella 1: rendimenti di RNA. Questa tabella mostra la quantità di RNA estratta con un kit di preparazione di RNA da piscine di 20 individui cyprid raccolti in diverse fasi durante il processo di liquidazione.

Discussione

La cultura di barnacle presso Tjärnö Marine Research Laboratory (Svezia) è stato in esecuzione più di 20 anni ed è stata utilizzata per studi in molti settori di ricerca diversi. Oltre 30 articoli scientifici sono stati pubblicati che hanno utilizzato il sistema di coltura negli ultimi anni, compreso gli studi in antivegetativa13,22, idrodinamica23, ecologia chimica24, cambiamenti climatici16 , biologia evolutiva5e biologia molecolare2.

Per evitare la selezione di alcuni individui che sono più adattate all'ambiente di laboratorio (individui che potrebbero non essere rappresentativi della popolazione selvatica), si consiglia di raccogliere un nuovo riproduttori dal campo ogni anno. Inoltre, è anche consigliabile per ringiovanire la cultura annualmente, dal momento che vi è circa 50-80% di mortalità in adulti durante un anno normale. Tuttavia, se l'obiettivo è di produrre linee inbred o impostare studi di evoluzione sperimentale, allevati in laboratorio solo le famiglie devono essere utilizzati.

Un buon momento per raccogliere BalanUs b. sui pannelli al Tjärnö Marine Research Laboratory è in giugno – agosto perché in quel momento, c'è una buona fornitura di cyprid larve nel mare. Controllare i pannelli settimanale per vedere quando inizia l'insediamento barnacle e rimuovere manualmente altri si stabilirono specie di BalanUs b. (ad es., cozze, tunicati, briozoi, idrozoi, nemerteans/qualche spirografo e altre specie di barnacle) dalla pannelli (ad esempio, con uno spazzolino da denti). Intorno Tjärnö, ci sono tre specie di acque poco profonde barnacle presenti (BalanUs b., Semibalanus balanoidese Balanus crenatus). Tuttavia, b. BalanUs è la dominante malvagie di superfici lisce dure nel mese di luglio – agosto. S. balanoides ha il suo periodo di insediamento nel corso della primavera e preferisce soprattutto i substrati naturali (ad es., pietre). B. crenatus può verificarsi ai numeri bassi sui pannelli durante l'estate.

È anche possibile avviare nuove generazioni di adulti barnacle da cyprids coltivate, che sarebbe essenziale se determinate linages con tratti specifici sono stati stabiliti, o negli studi di evoluzione sperimentale. Il modo più conveniente per iniziare nuove generazioni di adulti è da pagare cyprids in pannelli termoplastici in laboratorio. Questi pannelli con cyprids recentemente depositato potrebbero essere utilizzati anche in trattamenti sperimentali o per l'esposizione nel campo. In caso di emergenza, si possono usare anche gli adulti su massi da un sito nelle vicinanze (ad es., Idefjorden nel caso la Tjärnö Marine Research Laboratory) dove b. BalanUs è comune. Questi adulti già affermati sono trattati nello stesso modo degli adulti sui pannelli, essendo così disponendi in vassoi e alimentati tramite il flusso-attraverso il sistema. Celle di flusso consente anche di stabilire pannelli con barnacles25. Queste sono le camere di flusso continuo con plancton netto sui lati su cui il cyprids non stabiliscano con pannelli come la superficie di stabilimento solo per le larve.

Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per la creazione di una cultura barnacle funzionante a lungo termine, comprese tutte le fasi di vita. I metodi utilizzati per cultura b. BalanUs sono probabilmente, in grande misura, applicabile anche ad altri invertebrati marini con liberamente natante, larve di planktotrophic. Procedure di coltura per alcune specie sono già ben descritte (ad es., per mitili e diverse specie di ostriche)26, mentre per altri invertebrati marini, ci sono solo pochi esempi di colture a lungo termine che attraversa tutta la loro vita ciclo. Uno dei primi tentativi riusciti di barnacles di cultura (B. amphitrite) è stato fatto da Rittschof et al. 15. risorse finanziarie e personali a lungo termine dovrebbero essere a posto prima di considerare un cirripede coltura struttura che istituisce. La manutenzione di questo tipo di anno-nei dintorni di barnacle cultura richiede almeno una metà-orario di lavoro di persona. Ci possono essere alcune potenzialità per il futuro automazione di alcuni passi nella linea di produzione, principalmente alla coltura delle microalghe27. Inoltre, per avere successo, è essenziale avere accesso a grandi quantità di acqua di mare di alta qualità. Alla coltura delle microalghe, Artemia e barnacles non riguarda eventuali procedure particolari di sicurezza. Tuttavia, test di alcuni antivegetativa sostanze o prodotti chimici tossici potrebbe essere necessario precauzioni speciali.

I pannelli sono stati controllati più volte a settimana per le contaminazioni. L'acqua di mare utilizzata nella cultura è stato pompato da una profondità di 40 m nel fiordo Koster fuori dal laboratorio di ricerca Marine Tjärnö e passò attraverso due filtri a sabbia prima di entrare nel sistema di acqua di laboratorio. Se nessun filtro dell'acqua era stato fatto, ci sarebbe molto più contaminazione nella cultura. È essenziale per pulire regolarmente i pannelli nella cultura da detriti e altri invertebrati (ad es., stolone-edificio idroidi e animali predatori) che entrano nel sistema attraverso la fornitura di acqua di mare dal campo. Ad esempio, se non le larve sono prodotte nonostante il fatto che la cultura è stata ben nutriti e altrimenti sembra di essere in buone condizioni, il problema potrebbe essere la presenza di animali che sembrano inibire l'accoppiamento. Naturalmente, molti degli organismi contaminanti nella cultura presso il laboratorio di ricerca Tjärnö Marine erano specifici per la costa occidentale svedese, e altri tipi di contaminanti organismi saranno prevalenti ed essere più di una sfida in altre aree geografiche. Sulla costa occidentale della Svezia, è raro trovare contaminazione di altre specie di barnacle sui pannelli. Occasionalmente, l'istituzione di S. balanoides è stato trovato, ma questo è un problema molto marginale (al massimo, un s. balanoides contaminante per 10.000 campioni di BalanUs b. ). La mancanza di specie contaminanti era molto probabilmente dipenda dal regime di stabilire nuove culture durante l'estate, quando larvaefrom b. BalanUs erano altamente dominante. Inoltre, c'era anche un arricchimento chiaro di b. BalanUs sui pannelli, dal momento che questa specie è selettiva per superfici lisce13.

È essenziale per rimuovere barnacles morto adulto. Se i gusci vuoti vengono lasciati sui pannelli, possono diventare un rifugio per varie specie contaminanti sia naupli di Artemia . Inoltre, è stato notato che gli individui morti influenzano il benessere della vicina individui, probabilmente con il rilascio di composti tossici durante la decomposizione. Un'ulteriore conseguenza di mortalità adulti è che alcuni individui saranno lasciati da solo e troppo lontano da qualsiasi altri adulti per consentire l'accoppiamento (anche se barnacles hanno il pene più lungo del mondo animale rispetto al relativo formato)28. Questi individui sopravviveranno ma sono non-produttiva per le larve. Tuttavia, questi individui adulti solitari delicatamente possono essere rimosso senza danneggiare la piastra di base ed essere disposto orizzontalmente vicini ad altri per consentire l'accoppiamento. Barnacles può anche essere accoppiato inserendo pannelli con un adulto su ciascuno ma abbastanza vicino in modo che la fecondazione incrociata può verificarsi. In questo modo, linee genetiche possono essere prodotta14.

È fondamentale per produrre un feed di alta qualità e per nutrire le colture quasi ogni giorno. Anche un paio di giorni senza cibo può causare un rilascio decrescente delle larve. Test precedenti della composizione della dieta hanno mostrato che le diatomee sono essenziali per la crescita e la sopravvivenza dei naupli di barnacle. Diverse specie della diatomea sembrano adeguate come feed, anche se piccole o solitarie celle (meno di 10 µm di diametro) possono essere necessarie per ingestione di naupli di Artemia. La specie S. marinoi, simplex di c.e T. tricornutum tutti hanno dimostrato di essere un'adeguata alimentazione per naupli di BalanUs b. , oltre che facile da coltivare. Inoltre, la qualità del foraggio è generalmente superiore per alghe che crescono in modo esponenziale. Inoltre è stato segnalato che le diatomee sono essenziali per l'instaurazione delle colture produttive di amphitrite B.15. Una teoria dell'importanza di diatomee è che hanno un profilo unico degli acidi grassi e sono particolarmente ricchi di acidi grassi altamente polinsaturi 20:529. Esso è stato dimostrato che alcuni acidi grassi sono importanti per lo sviluppo positivo di ostrica larve30.

Nel corso degli anni, non ci sono stati nessuna incidenza di malattie dannose nella cultura barnacle. In molti commerciale acquicolture invertebrati marini, come le ostriche e cozze, malattie sono piuttosto comuni e possono essere molto dannosi. Effetti dannosi di virus sono stati segnalati anche da popolazioni selvatiche. L'ostrica nativo in Francia è stato sostituito dall'ostrica portoghese Crassostrea angulata nel 1925, ma questa specie è stata spazzata via da un iridovirus intorno 197031. Più recentemente, ci sono stati eventi di mortalità massiccia in ostrica del Pacifico Crassostrea gigas in culture in tutto il mondo, che sembra essere associato con il ostreid herpesvirus 132. Nessun rapporti su agenti patogeni, batteri o virus su barnacles sono stati pubblicati finora. Tuttavia, nel genoma-progetto in corso su b. BalanUs, sequenze del virus sono stati trovati (Alm Rosenblad et al., dati non pubblicati), ma con nessuna apparente legame ai sintomi di malattie. Miscele di antibiotici in precedenza sono state applicate alle colture per ridurre al minimo il rischio di infezioni batteriche; Tuttavia, questa procedura è attualmente abbandonata e finora, questo non ha causato alcun problema di contaminazione.

Se l'acqua di mare è riscaldata (come descritto sopra), il surriscaldamento può essere il rischio più grave nella linea di produzione di cultura. È, naturalmente, difficile da salvaguardare contro il surriscaldamento, anche se i sensori e sistemi di allarme appropriati possono essere usato (per esempio, l'invio di messaggi e-mail o SMS alle persone responsabili). Incidenza di questo tipo in passato hanno provocato l'uccisione sostanza degli adulti nella cultura. Questo può, naturalmente, essere devastante e rovinare gli investimenti a lungo termine di tempo e denaro. In particolare, questo sarebbe catastrofico se linee «inbred» genetiche sono state stabilite. Per garantire la longevità di tali linee e proteggerli da perdite accidentali, sarebbe auspicabile sviluppare una metodologia di crioconservazione per barnacles. È stato segnalato che le larve da ostrica del Pacifico possono essere congelate giù e rianimate con successo parziale33. Cryobanking è stato anche un prezioso strumento per preservare le risorse genetiche di una vasta gamma di specie34. Anche naupli da B. amphitrite sono segnalati per sopravvivere congelamento35, ed è stato trovato che il 20% degli individui congelato discesa trasformato con successo in cyprids36. Tuttavia, l'applicazione di congelamento per la sostenibilità a lungo termine delle culture finora non è stato adottato, ma questo sarebbe infatti necessario per il mantenimento delle righe selezionate; Questo sarebbe un passo essenziale per stabilire saldamente BalanUs b. in un potente modelsystem marino.

Qui, è stato presentato un protocollo per la dissezione di vari tessuti da adulti di BalanUs b. (cioè, cirri, soma e mensola del camino). Tuttavia, si deve sottolineare che altri tessuti possono anche essere estratte. Per esempio, i tessuti molli tra il mantello esterno e interno delle specie membranosa-base Tetraclita japonica formosana sono stato accuratamente isolato e utilizzato per un'estrazione del RNA e l'analisi di RNA-seq del gene espressione37. Il protocollo di estrazione ottimizzata delineato qui descritto fornisce una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per la sequenza da una quantità minima di materiale di partenza. In primo luogo, la raccolta delle larve individuali direttamente nelle provette omogeneizzazione riduce al minimo eventuali perdite durante il trasferimento da una provetta a altra. Inoltre, tra i vari metodi testati, l'omogeneizzazione con integrità, rispetto alla omogeneizzazione di sonicazione o pestello e perle di ceramica ha dimostrati di essere resa il più efficiente in termini di RNA. Durante la pianificazione di espressione genica o esperimenti di genomica, bisogna tenere a mente la sfida l'alta variabilità genetica in barnacles, almeno per b. BalanUs. Barnacle ha una diversità genetica nel range 3 – 5%, anche in regioni (Alm Rosenblad et al., dati non pubblicati) codificanti. Questo, naturalmente, pone esigenze specifiche sulla progettazione degli iniettori per analisi qPCR, dove più conservate regioni dovrebbero essere identificate e utilizzate come modelli per gli iniettori, al fine di ottenere coerente espressione risultati betweenbatches. Regioni conservate per geni bersaglio, come acquaporine e Na + /K + atpasi, possono essere identificati attraverso lo studio della variabilità di sequenza di questi geni in RNA-seq dati ottenuti dalle popolazioni di cyprids contenente centinaia di individui. Per un'analisi del genoma, DNA sarà campionato. Tuttavia, ottenere il DNA di alta qualità da BalanUs b. può essere difficile21.

In conclusione, la cultura consolidata barnacle ha dimostrato di essere strumentale in diversi tipi di studi sperimentali. In particolare, la produzione larvale tutti-anno-intorno ci permette di condurre esperimenti senza essere limitato al periodo di deposizione delle uova naturale (per b. BalanUs, questo è durante l'estate). Larve ottenute consente di eseguire una vasta gamma di studi sperimentali, tra cui saggi di insediamento, comportamento saggi, studi di espressione su geni specifici, come pure studi genoma transcriptome.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzione 2017-04559 il Consiglio svedese per la ricerca (VR) e il progetto supportato UE lungomare a Anders Blomberg. In particolare, l'istituzione del fondo coltura è, nel corso degli anni, stata sostenuta da sovvenzioni a Per R. Jonsson dalle seguenti agenzie di finanziamento: SSF (Fondazione svedese per la ricerca strategica) attraverso il programma Marine Science and Technology e MISTRA attraverso il programma Marine Paint. Kent Berntsson è stato determinante nelle prime fasi di impostazione del culturingfacility. Ulteriori finanziamenti per stabilire la struttura di coltura è giunto dal centro per biologia evolutiva (www.cemeb.science.gu.se), che è sostenuta da una sovvenzione Linnaeus la svedese ricerca consigli FORMAS e VR.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pannelli in plexiglas (polimetilmetacrilato)Produttore di plastica, Bromma, Sveziavetro trasparente
1,5 L bottiglia
ArtemiaINVE Acquacoltura, BelgioAbbiamo testato diverse aziende; questo è davvero il migliore
Skeletonema marinoi (CCAP ceppo 1077/5)CCAP (Collezione di colture di alghe e protozoi); Scozia ceppo 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP ceppo 1085/3)CCAP (Collezione di colture di alghe e protozoi); Scozia strain 1085/3
Sistema di filtraggio a cartucciaMillipore Millipore 
cartuccia con una dimensione nominale dei pori di 0,2 & micro; mMillipore cartuccia CWSS01S03Alta capacità per grandi volumi
flacone in policarbonatoNalgeneautoclavabile
RNA successivamenteQiagen76106  Soluzione di fissaggio per preservare l'RNA
TURBO Kit senza DNAInvitrogen/Thermofisher Scientific   AM1907Kit DNAsi per rimuovere il DNA dall'RNA preparato
Kit di sintesi iScript cDNA Kit di sintesi1708890Biorad
SYBR Green supermixBiorad1708880Dye per QPCR
RNeasy minikitQiagen74104Estrazione di RNA di adulti o molti cipridi Omogeneizzazione
dei tessuti molli CK 14, provette da 2 mlPrecellysKT03961-1-003.2Perle in ceramica per omogeneizzazione
RNeasy micro kitQiagen74004Estrazione di RNA di pochi cipridi
in PET

Riferimenti

  1. Darwin, C. A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , Ray Society. London, UK. (1854).
  2. Lind, U., et al. Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity. PLoS ONE. 12 (7), 0181192(2017).
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