Articolo metodologico

Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici

DOI:

10.3791/57831

⸱

25 ottobre 2018

 ,  ,  , 
1Division of Molecular Hematology, Lund Stem Cell Center, Lund University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alla rinfusa gene espressione misure nube singola cella differenze nelle popolazioni eterogenee delle cellule. Qui, descriviamo un protocollo per analisi di espressione genica e l'indice come unicellulare ordinano di Florescence attivato Cell Sorting (FACS) possa essere combinato per delineare eterogeneità e immunophenotypically caratterizzare popolazioni molecolarmente distinte delle cellule.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunophenotypic caratterizzazione e l'analisi molecolare sono stati utilizzati a lungo per eterogeneità di delineare e definire popolazioni distinte delle cellule. FACS è intrinsecamente un'analisi unicellulare, tuttavia prima di analisi molecolare, cellule bersaglio sono spesso prospetticamente isolate all'ingrosso, perdendo così la cella singola ad alta risoluzione. Analisi dell'espressione genica di singola cellula fornisce un mezzo per capire le differenze molecolari tra le singole celle in popolazioni eterogenee delle cellule. In analisi di massa cellulare una sovrarappresentazione di un tipo di distinte delle cellule provoca pregiudizi e occlusioni dei segnali dalle cellule rare con importanza biologica. Utilizzando FACS Indice ordinamento accoppiato all'analisi dell'espressione genica di singola cellula, popolazioni possono essere indagate senza perdita di risoluzione di singola cellula mentre le cellule con espressione di superficie dell'indicatore delle cellule intermedie vengono inoltre acquisite, consentendo la valutazione dei la rilevanza dell'espressione dei marker di superficie continua. Qui, descriviamo un approccio che combina cella singola trascrizione d'inversione quantitativa PCR (RT-qPCR) e FACS Indice ordinamento contemporaneamente caratterizzazione molecolare e immunophenotypic eterogeneità all'interno di popolazioni cellulari.

Contrariamente ai metodi di sequenziamento di cella singola del RNA, l'uso di qPCR con amplificazione del target specifico permette per misurazioni robusti di basso-abbondanza trascritti con meno interruzioni, mentre non è confuso da questioni legate alle variazioni della cellula--cellula in lettura profondità. Inoltre, da direttamente questo metodo buffer indice-ordinamento single-cellule in Lisi, permette per la sintesi del cDNA e target specifico pre-amplificazione per essere eseguite in un unico passaggio anche per quanto riguarda la correlazione delle firme molecolari successivamente derivate con superficie cellulare espressione del marcatore. L'approccio descritto è stato sviluppato per indagare su singolo-cellule ematopoietiche, ma inoltre sono stati usati con successo su altri tipi di cellule.

In conclusione, l'approccio descritto nel presente documento consente una misura sensibile dell'espressione di mRNA per un pannello di geni pre-selezionati con la possibilità di sviluppare protocolli per successivo isolamento futuri dei molecolarmente distinte sottopopolazioni.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogni singola cellula del sangue è creduto di risiedere in una gerarchia cellulare, dove le cellule staminali formano l'apice in cima a una serie di sempre più progenitori intermedi che alla fine terminalmente differenziarsi nelle cellule effettrici finale che trasportano specifici funzioni biologiche1. Molte delle conoscenze su come sono organizzati i sistemi di cellule staminali è stato generato nel sistema ematopoietico, in gran parte a causa della capacità di isolare prospetticamente distinte popolazioni ematopoietiche altamente arricchiti per le cellule staminali o vari progenitori2 ordinando FACS. Questo ha permesso per molti di queste popolazioni di essere analizzato funzionalmente o molecolare, principalmente attraverso profili di espressione genica3,4. Tuttavia quando l'analisi di espressione genica delle differenze individuali di popolazioni di massa tra cellule sono mediati e perso5. Così, incapacità di rilevare variazioni di cellula--cellula all'interno delle frazioni eterogenee delle cellule può confondere la nostra comprensione dei processi biologici critici se piccoli sottoinsiemi di cellule conto per la funzione biologica dedotta di quella popolazione6, 7. Al contrario, indagine di firme di espressione del gene a cella singola risoluzione offrono una possibilità delineare eterogeneità ed eludere adombrante influenze da sovrarappresentati sottoinsiemi di cellule8.

Ad oggi sono stati sviluppati molti protocolli per analisi di espressione genica di cella singola; ogni approccio avendo propri avvertimenti. Il primo metodo era RNA fluorescente in situ ibridazione (RNA-FISH), che misura un numero limitato di trascrizioni in un momento, ma è unico in quanto permette per indagine di RNA localizzazione9,11. I primi metodi usando PCR e qPCR per rilevare che un singolo o trascrizioni molto pochi sono stati anche sviluppati12. Tuttavia, questi ultimamente sono stati sostituiti da metodi basati su microfluidica che possono analizzare simultaneamente l'espressione di centinaia di trascrizioni per ogni cella in centinaia di cellule attraverso qPCR e pertanto consentono di dimensione elevata eterogeneità analisi utilizzando pre-determinato gene pannelli10,13. Recentemente la tecnologie basate su sequenze di RNA sono stato ampiamente usate per analisi unicellulare, come teoricamente possono misurare l'intero trascrittoma di una cella e quindi aggiungere una dimensione esplorativa alla eterogeneità analisi10, 14. Multiplexed qPCR analisi e sequenziamento di RNA di singole cellule hanno caratteristiche diverse, così lo spiegazione razionale per usando uno dei metodi dipende la domanda così come il numero delle cellule nella popolazione bersaglio. Ad alta velocità e basso costo per cella nonché caratteristiche imparziali, esplorative del sequenziamento di RNA di singola cellula sono consigliabili quando cella sconosciuto o grandi popolazioni sono studiati. Tuttavia, sequenziamento di RNA di singola cellula inoltre è sbilanciata verso il sequenziamento alte abbondante trascrizioni più frequentemente mentre trascrizioni con abbondanza bassa sono inclini ai forcellini. Questo può portare a dati notevolmente complessa che mette alto-richieste su analisi bioinformatica per rivelare importanti segnali molecolari che sono spesso sottili o nascosto nel rumore tecnico15. Così, per tessuti ben caratterizzati, qPCR cella singola analisi utilizzando pre-determinato pannelli primer selezionati per geni funzionalmente importanti o marcatori molecolari possono servire come un approccio sensibile, semplice per determinare l'eterogeneità di un popolazione. Tuttavia, dovrebbe essere notato che, rispetto a cella singola RNA-seq, il costo per ogni cella è generalmente maggiore per cella singola qPCR metodi. Qui, descriviamo un approccio che unisce unicellulare RT-qPCR (modificato da Teles J. et al. 16), all'indice di FACS ordinamento contemporaneamente analisi bioinformatica e17 18 al fine di caratterizzare l'eterogeneità molecolare e immunophenotypic all'interno delle popolazioni.

In questo approccio, la popolazione delle cellule di interesse è macchiata e singolo-cellule sono filtrate di FACS direttamente nel buffer di lisi in piastre PCR a 96 pozzetti. Contemporaneamente, i livelli di espressione di un ulteriore set di marcatori di superficie cellulare vengono registrati per ogni singola cella durante FACS-ordinamento, un metodo che è indicato come indice di ordinamento. Il materiale di lisato cellulare viene successivamente amplificato e l'espressione genica di un insieme selezionato di geni analizzati con RT-qPCR, utilizzando una piattaforma microfluidica. Questa strategia consente l'analisi molecolare della caratterizzazione del ordinato unicellulare, nonché simultanea dell'espressione di marcatori di superficie cellulare di ogni singola cella. Mappando direttamente molecolarmente distinte sottopopolazioni di cellule per l'espressione dei marcatori ordinati indicizzati, le sottopopolazioni possono essere collegate a un immunophenotype specifico che può essere utilizzato per il loro isolamento futuri. Il metodo è descritto passo per passo nella Figura 1. Un pannello di pre-determinato gene ulteriormente contribuisce a una maggiore risoluzione dell'espressione genica mirata, poiché aggira misura irrilevante geni abbondanti che altrimenti possono occludere segnali di espressione del gene sottile. Inoltre, l'amplificazione dell'obiettivo specifico, la trascrizione inversa di un passo e amplificazione permette misurazione robusto di basse trascrizioni espresse, come fattori di trascrizione o RNA non-poli-adenylated. Importante, qPCR metodi consentono per la misura di mRNA da proteine di fusione, che sono importanti durante l'analisi di alcune malattie maligne19. Infine, il numero concentrato di geni studiati, bassi tassi di abbandono, e limitate differenze tecniche tra cellule rendono questo metodo facilmente analizzabile rispetto ai metodi dimensionale superiore, come cella singola RNA-seq. Seguendo il protocollo, un intero esperimento può essere eseguito, da ordinamento celle a risultati analizzati, entro tre giorni, rendendo questo un metodo semplice e veloce per analisi di espressione genica di singole cellule sensibili, ad alta velocità.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparazione delle placche di lisi

  1. Usando una panchina libera di RNA/DNA, preparare abbastanza tampone di lisi per 96 pozzetti, con 10% extra, mescolando 390 µ l nucleasi acqua gratuita, 17 µ l di 10% NP-40, 2,8 dNTP mM 10 µ l, 10 µ l 0,1 M DTT e 5,3 µ l RNasi inibitore (Vedi Tabella materiali). Vortex e centrifugare.
  2. Distribuire 4 µ l di tampone di lisi in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 di PCR e sigillare le piastre con pellicola adesiva. Rotazione verso il basso tubi per raccogliere il liquido sul fondo delle piastre. Tenere piastre su ghiaccio fino alla cella ordinamento (massimo 24 ore).

2. preparazione delle cellule per l'ordinamento delle cellule

  1. Scongelare il numero adeguato di cellule (qui, arricchito staminali ematopoietiche CD34 e cellule progenitrici) per l'esperimento. 1 x 106 celle sono appropriate per l'ordinamento circa tre piastre da 96 pozzetti di singolo-cellule con controlli.
  2. Trasferire le cellule scongelate una provetta conica da 15 mL e aggiungere 1 mL FBS ogni 30 s fino a raggiunta un volume totale di 8 mL. Spin di cellule in una centrifuga a 350 x g per 10 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
  3. Risospendere le cellule in 8 macchiatura buffer (PBS con 2% FBS) e centrifugare a 350 x g per 10 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
  4. Risospendere le cellule in 200 µ l tampone e rimuovere celle di macchiatura per le macchie di controllo.
  5. Fanno la fluorescenza meno controlli uno (protocolli) per ogni fluoroforo, macchiando di una frazione di cellule in 50 µ l di tampone di colorazione. In questo esempio, 6 microcentrifuga con 20.000 celle è utilizzati come FMOSs. Si noti che il numero delle cellule dovrebbe essere regolato a seconda della popolazione studiata. Aggiungere tutti gli anticorpi alla stessa concentrazione come la macchia di campione ad eccezione di uno in ogni provetta.
  6. Rendere le macchie singole per ogni fluoroforo macchiando di una frazione di cellule in 50 µ l di tampone per ogni fluoroforo utilizzato. In questo esempio vengono utilizzati 6 microcentrifuga con 20.000 celle. Si noti che l'obiettivo per ogni anticorpo deve essere espressa dalle cellule utilizzate per i controlli. Aggiungere ogni anticorpo alla stessa concentrazione come la macchia di campione in tubi singoli. Inoltre tenere 20.000 celle non macchiate in 50 µ l come controllo non colorato.
  7. Per il campione di cellule, è necessario aggiungere gli anticorpi alle loro concentrazione appropriata. Usato qui sono CD34-FITC ad una concentrazione di 1/100, 1/50, CD38-APC CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 e lignaggio Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, e CD235a-PECy5 1/1000.
  8. Incubare le cellule con anticorpi per 30 min in ghiaccio al buio.
  9. Lavare le cellule con 3 mL di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule a 350 x g per 10 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
  10. Risospendere le cellule e ripetere il punto 2.9.
  11. Risospendere il campione in 500 µ l e protocolli in 100 µ l tampone con cellule 7AAD e filtro di 1/100 di colorazione attraverso un filtro di 50 µm per ottenere una sospensione unicellulare.

3. cella ordinamento

  1. Assicurarsi che la macchina di FACS è impostata correttamente con ritardo di goccia e citometro installazione e monitoraggio (CST) che recentemente sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore, per garantire che le celle appropriate sono ordinate. Per cellule ematopoietiche, è consigliato l'uso della velocità 85 micron ugello e massimo di 4, mentre il tasso di eventi ottimale è compresa tra 800 e 2000 eventi/s.
  2. Correggere per sovrapposizione spettrale eseguendo compensazione di fluorescenza e impostare porte secondo FMO controlli o interno negativo.
  3. Eseguire una nuova analisi della popolazione bersaglio ordinando almeno 100 cellule bersaglio in un nuovo tubo del microcentrifuge con 100 µ l di tampone di macchia. FACS analizzare le cellule ordinate registrando il campione ordinato e assicurarsi che finiscono nel cancello di sorta.
  4. Set-up piatto unico cella ordinamento per la discesa nel pozzetto A1 in un piatto ben 96 di centraggio. Quando è centrata, è possibile ordinare 50 – 100 6 µm particelle in tutti i pozzetti intorno al bordo di un piatto ben 96 vuoto per assicurare che tutti i pozzetti otterrà una cella al centro di ciascun pozzetto.
  5. Se possibile, un controllo aggiuntivo per assicurare che le cellule vitali sono ordinate possa aggiungersi dall'ordinamento single-celle per la crescita in vitro . Cellule ematopoietiche possono essere coltivate in fondo U 96 pozzetti in 100 µ l SFEM con streptomicina 1% penicillina, 100 ng/mL FLT3L, TPO e SCF. Analizzare ogni pozzetto dopo 3 giorni nella cultura per le colonie delle cellule usando un microscopio.
  6. Rimuovere la pellicola adesiva da piastre. Ordinamento di una singola cella di interesse (qui Lin-CD34 + CD38-cellule) in 92 su 96 pozzetti, attivare l'ordinamento indice nel FACS ordinamento software per salvare il profilo di immunophenotypic per altri markers di interesse (qui CD45RA, CD49f e CD90) per ogni singola cella.
  7. Ordinare due pozzetti con cellule di 10 e 20 rispettivamente per i controlli di linearità nell'amplificazione di PCR. Wells H1 e H2 sono usati solitamente.
  8. Tenere due pozzi senza eventuali cellule come no-modello controlla, solitamente pozzi H3 e H4.
  9. Sigillare le piastre con film adesivo trasparente e girare le piastre a 300 x g per 1 min prima snap congelamento il ghiaccio secco.
  10. Memorizzare piatti congelati a-80 ° C.
    Nota: Punto di arresto sicuro. Ordinato e lisate di cellule possono essere mantenute a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.

4. inversa trascrizione e amplificazione dell'obiettivo specifico

  1. Preparare il mix di primer per tutti i 96 geni bersaglio aggiungendo 2 µ l di ogni coppia di primer, comprese le pulizie gene primer e primer per controllo a spillo-in RNA, in un 1,5 mL tube gratis RNasi su una panchina libera di RNA/DNA. Se si utilizza meno di 96 primer, aggiungere un volume equivalente di acqua gratuita di nucleasi per i primers mancanti. Primer devono essere ordinati separatamente per abbinare il pannello del gene desiderato.
  2. Rendere la trascrizione inversa e destinazione specifica amplificazione mescolare aggiungendo 632.5 µ l 2 x mix di reazione, 101,2 µ l Taq/SuperscriptIII, mix di Primer 151,8 µ l e 0,7 µ l a spillo nel controllo RNA. Questo passaggio su una panchina di DNA libero di preforme. Mescolare nel vortex e spin giù per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo. Conservare il ghiaccio fino aggiunta al campione.
  3. Marca no-reverse trascrizione controllo mix per quattro pozzi mescolando 27,5 µ l di miscela di reazione: 2x, 1.76 µ l di enzima Taq, 6,6 µ l di miscela primer e 2,64 µ l di acqua libera nucleasi. Spike nel controllo RNA. Eseguire questo passaggio su una panchina libera di DNA. Vortice e spin giù per raccogliere il liquido sul fondo del tubo e mantenere il ghiaccio fino a aggiunta al campione.
  4. Scongelare il lisato piastre sul ghiaccio. Aggiungere 8.75 µ l della trascrizione inversa precedentemente preparata e target specifico mix di amplificazione a 92 pozzi, compresi i controlli linearità e no-modello. Aggiungere 8.75 µ l del no-reverse trascrizione controllo mix quattro pozzetti rimanenti. Sigillare piastre con pellicola trasparente adesiva e spin giù per raccogli liquidi nella parte inferiore delle piastre.
  5. Preforme retrotrascrizione e amplificazione dell'obiettivo specifico eseguendo la piastra in una macchina PCR in base al programma di preamplificatore; passo 01:50 ° C per 60 min, passo 2: 95 ° C per 2 min, passo 3: 95 ° C per 15 s, passo 4: 60 ° C per 4 minuti, ripetere i passaggi 3 – 4 24 volte e infine passo 5: 8 ° C per sempre.
  6. Al termine della PCR, tenere la piastra a 8 ° C per la conservazione a breve termine e -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
    Nota: Punto di arresto sicuro. Materiale amplificato può essere tenuto a 8 ° C per la conservazione a breve termine e a-20 ° C per la conservazione a lungo termine.

5. preparazione del campione e piastre di dosaggio per analisi di espressione genica di Microfluidic Multiplex

  1. Preparare analisi piastra di caricamento di pipettaggio 3 µ l Assay caricamento di reagente in ciascun pozzetto di una piastra ben 96. Aggiungere 3 µ l di ogni primer a singoli pozzetti nell'analisi della piastra di carico.
  2. Sigillare la piastra con la pellicola adesiva e spin giù per raccogli liquidi nella parte inferiore delle piastre.
  3. Preparare piastra di diluizione di pipettaggio 8 µ l di nucleasi acqua gratuita in tutti i pozzetti di una piastra ben 96. Aggiungere 2 µ l di campione amplificato alla piastra di diluizione, rendendo una diluizione finale di 1:5.
  4. Sigillare la piastra con la pellicola adesiva, mescolare nel Vortex per 10 s e infine girare giù per raccogli liquidi nella parte inferiore delle piastre.
  5. Preparare la miscela di caricamento del campione mescolando accuratamente 352 µ l di mix master con 35,2 µ l di reagente di caricamento del campione. Preparare piatto di caricamento del campione aliquotare 3.3 µ l di mix in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 di caricamento.
  6. Aggiungere 2,7 µ l del campione diluito in ciascun pozzetto del campione piastra di carico.
  7. Sigillare la piastra con la pellicola adesiva e spin giù per raccogli liquidi nella parte inferiore delle piastre.

6. caricamento del Chip microfluidico

  1. Stipulare un nuovo chip microfluidici 96 x 96. Preparare insenature da loro frugando con una siringa con tappo su per assicurarsi che essi possono essere spostati.
  2. Rimuovere le bolle da siringhe. Aggiungere volume completo di siringhe ad ogni valvola mentre inclinando il chip 45 gradi e premendo verso il basso la valvola. Primo circuito integrato con il controller IFC.
  3. Caricare ogni entrata di dosaggio con 4,25 µ l da ciascuno dei pozzi nell'analisi della piastra di carico. Evitare le bolle. Se le bolle appaiono nel pozzo, rimuoverli con un puntale.
  4. Continuare a caricare ogni entrata di campione con 4,25 µ l da ciascuno dei pozzi della piastra di carico del campione, evitare bolle e se le bolle appaiono, rimuoverli con la punta della pipetta.
  5. Chip di carico con il controller IFC.
  6. Verificare che il chip sembra anche e che sono stati caricati tutti gli alloggiamenti. Rimuovere la polvere dalla superficie del chip toccandola con nastro. Eseguire il chip della piattaforma di espressione genica microfluidici multiplex.

7. esecuzione di Chip sulla piattaforma di Multiplex Microfluidic Gene Expression

  1. Dopo il caricamento circuito integrato nella piattaforma di espressione di gene multisala microfluidica, il nome del campione.
  2. Impostare ROX come tintura passiva. Impostare singola sonda e FAM-MGB come fluorescenza. Utilizzare 96 x 96 standard v2 come protocollo. Iniziare a correre.
  3. Rimuovere chip quando esegue è completa.

8. preliminare analisi di Chip Run

  1. Caricare i dati nel software di analisi Real-Time PCR.
  2. Caricare i nomi di gene e cella incollando layout genica e cellulare da un file delimitato da tabulazioni.
  3. Immagine vista aperta e selezionare ROX come colorante. Verifica se tutti i pozzi hanno tintura passiva ROX.
  4. Indagare se tutte le trame di amplificazione Guarda ok, con una curva di amplificazione liscia senza picchi (simile alla Figura 3E).
  5. Assicurarsi che tutte le singole cellule espressione di spillo-in controllo RNA per assicurarsi che tutti siano stati caricati correttamente.
  6. Assicurarsi che tutte le cellule hanno espressione genica delle pulizie e così sono state ordinate correttamente.
  7. Garantire che 10 e 20 controlli di linearità di cella hanno circa il CT 1 differenza per convalidare amplificazione lineare.
  8. Verifica se c'è espressione in campioni di controllo noRT. Se l'espressione viene rilevata in noRT pensare di cambiare sonde sonde che non rilevano il DNA genomico per le esecuzioni successive.
  9. Esportare dati in file csv per ulteriori analisi.

9. cella singola analisi utilizzando SCExV

Nota: Un filmato introduttivo è presenti20 per introdurre lo strumento. Qui, è presentata una breve raccomandazione di come eseguire analisi utilizzando i controlli introdotti nel protocollo.

  1. Connettersi al sito Web SCexV20.
  2. Caricare il file CSV esportati.
  3. Ha scelto il controllo a spillo-in RNA come controllo positivo. Rimuovere qualsiasi cella che ha un controllo CT RNA superiore a 25. Normalizzare i dati all'espressione mediana del controllo RNA.
  4. Fare clic su "qui -> Analyze". Rimuovere noRT, notemplate, 10 e 20 controlli di cella a escludere l'opzione di cella.
  5. Cluster di cellule con l'approccio clustering di scelta con il numero previsto di cluster. Esportare i valori analizzati.

10. l'ordinamento indice analisi

  1. Aprire il software di analisi FACS e caricare i campioni indicizzati.
  2. Aprire l'editor di script e di eseguire lo script disponibile da Quinn J. et al. 21
  3. Ora che il software di analisi di FACS sarebbe opportuno un cancello, per ciascuna delle singole celle, aprire l'editor di layout e colore le cellule secondo il raggruppamento da SCexV (disponibile nel file denominato "Sample_complete_Data.xls").

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descritto è altamente affidabile e veloce, facilmente eseguite. Nella Figura 1viene presentata una panoramica della disposizione sperimentale. L'intero protocollo, dalla selezione delle singole cellule, per amplificazione di target specifici, misure di espressione genica ed analisi preliminare può essere eseguito in tre giorni. Un esempio dei risultati analizzati sotto forma di una mappa di calore che rappresenta preliminari dati analizzati dall...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi anni, analisi di espressione genica di singola cellula è diventata una preziosa aggiunta per definire l'eterogeneità delle varie popolazioni di cellule23. L'avvento delle tecnologie di sequenziamento di RNA fornisce teoricamente la possibilità di misurare l'intero trascrittoma di una cella, tuttavia questi metodi sono complicati tramite le variazioni nella profondità della cellula--cellula sequenziamento e drop-out. Cella singola qPCR offre un'analisi sensibile e robusta dell'espressi...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è supportato da sovvenzioni dal Swedish Cancer Society, The Swedish Research Council, la società svedese per la ricerca medica, la svedese infanzia Cancer Foundation, la Fondazione di Ragnar Söderberg e The Knut e Alice Wallenberg Foundation

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CD14 PECY5eBioscience15-0149-42Clone: 61D3
CD16 PECY5Biolegend302010Clone: 3G8
CD56 PECY5Biolegend304608Clone: MEM-188
CD19 PECY5Biolegend302210Clone: HIB19
CD2 PECY5Biolegend300210Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5Biolegend300310Clone: HIT3a
CD123 PECY5Biolegend306008Clone: 6H6
CD235A PECY5BD Pharma 559944Clone GAR2
CD34 FITCBiolegend343604Clone: 561
CD38 APCBiolegend303510Clone: Hit2
CD90 PEBiolegend328110Clone: 5E10
CD45RA BV421BD bioscience560362Clone: HI100
CD49f Pecy7eBioscience25-0495-82Clone: eBioGOH3
FBSHyCloneSV30160.3
PBSHyCloneSH30028.02
Piastra u-bottom a 96 pozzettiVWR10861-564
SFEMTecnologie delle cellule staminali9650
Penicillina streptomicinaHyCloneSV30010
TPOPeprotech300-18
SCFPeprotech300-07
FLT3LPeprotech300-19
Falcon Tube 15 mLSarstedt62.554.502
Eppendorph tubeSarstedt72.690.001
CST beadsBD
Perline AccudropBD3452496 µ particelle m 
Pellicola adesiva ClearThermo scientific AB-1170
Pellicola adesiva LaminaThermo scientific AB-0626
Piastra PCR a 96 pozzettiAxygenPCR-96M2-HS-C
PCR provetta da 1,5 mLAxygenMCT-150-LC
T100 PCR cyclerBioRad186-1096
10% NP40Thermo scientific 85124
10 mM dNTPTakara4030
0,1 M DTTInvitrogenP2325
RNAsoutInvitrogen10777-019Cellule inibitrici dell'RNAsi
Kit qRT-PCR One-StepInvitrogen11753-100
Acqua libera NeucleaseInvitrogen11753-100da CellsDirect kit
2x Miscela di reazioneInvitrogen11753-100del kit CellsDirect
SuperScript III RT/Platinum Taq MixInvitrogen11753-100del kit CellsDirect
Platinum  Taq  Kit10966026Invitrogen
Xeno RNA ControlInvitrogen4386995da TaqMan Cells-to-CT Control
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression AssayInvitrogen4386995da TaqMan Cells-to-CT
Kit 96.96 Kit di campionamento/caricamento... 10 IFCsFluidigmBMK-M10-96.96
Fluidigmreagente di caricamento del saggioda 96.96 Kit di caricamento del campione/
20x Reagente di caricamento del campione GEFluidigmda 96.96 Kit di campionamento / caricamento
del fluido della linea di controllo Fluidigmda 96.96 Kit campione/caricamento
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4369016
BioMark HDFluidigmBMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFCFluidigmBMK-M10-96.96GT
ExcelMicrosoftMicrosoft
FlowJo V10TreeStarTreeStar
Analisi PCR in tempo reale FluidigmFluidigm
CD179a.VPREB1Thermofisher scientificHs00356766_g1
ACEThermofisher scientificHs00174179_m1
AHRThermofisher scientificHs00169233_m1
BCR_ABL.52Thermofisherscientific Hs03043652_ft
BCR_ABL41Thermofisher scientificHs03024541_ft
BMI1Thermofisher scientificHs00995536_m1
CCNA2Thermofisher scientificHs00996788_m1
CCNB1Thermofisher scientificHs01030099_m1
CCNB2Thermofisher scientificHs01084593_g1
CCNCThermofisher scientificHs01029304_m1
CCNE1Thermofisher scientificHs01026535_g1
CCNFThermofisher scientificHs00171049_m1
CCR9Thermofisher scientificHs01890924_s1
CD10. MMEThermofisher scientificHs00153510_m1
CD11aThermofisher scientificHs00158218_m1
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Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  2. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  3. Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27(2017).
  4. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
  5. Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
  6. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  7. Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  8. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  9. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  10. Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019(2017).
  11. Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57(2014).
  12. Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
  13. Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63(2008).
  14. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096(2013).
  15. Tung, P. -Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921(2017).
  16. Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
  17. Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
  18. Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320(2015).
  19. de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
  20. Lang, S., et al. SCExV. , Available from: http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/ (2015).
  21. Quinn, J. indexed-sorting. , Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016).
  22. Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
  23. Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
  24. Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
  25. Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
  26. Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692(2017).
  27. Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
  28. Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83(2016).
  29. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).

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