La purificazione dei canali ionici è spesso provocatorio, ma una volta raggiunto, potenzialmente può permettere le indagini in vitro delle funzioni e delle strutture dei canali. Qui, descriviamo le procedure graduale per l'espressione e purificazione delle proteine di mammiferi bestrophin, una famiglia di Ca2 +-attivato canali Cl– .
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Articolo metodologico
Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il genoma umano codifica quattro bestrophin paralogs, vale a dire BEST1, BEST2, BEST3 e BEST4. BEST1, codificata dal gene BEST1 , è Ca2 +-attivato Cl– canale (CaCC) espressi principalmente nell'epitelio retinico del pigmento (RPE). Il significato fisiologico e patologico del BEST1 è evidenziato dal fatto che oltre 200 mutazioni distinte del gene BEST1 sono state collegate geneticamente a uno spettro di almeno cinque disturbi degenerativi della retina, come migliori vitelliforme distrofia maculare (malattia di Best). Pertanto, comprendere la biofisica dei canali di bestrophin a livello di singola molecola contiene un enorme significato. Tuttavia, ottenere canali ionici dei mammiferi purificata è spesso un compito impegnativo. Qui, segnaliamo un protocollo per l'espressione delle proteine di mammiferi bestrophin con il sistema di trasferimento del gene baculovirus BacMam e loro purificazione di affinità e la cromatografia di esclusione dimensionale. Le proteine purificate hanno il potenziale per essere utilizzato nelle successive analisi funzionali e strutturali, quali registrazioni elettrofisiologiche in lipidici e cristallografia. D'importanza, questa pipeline può essere adattata per studiare le funzioni e le strutture di altri canali ionici.
Introduzione
Bestrophins sono una famiglia di canali ionici conservata attraverso specie variano da batteri a esseri umani1. In esseri umani, del gene BEST1 , localizzato sul cromosoma 11q12.3, codifica per la proteina di membrana Bestrophin-1 (BEST1) che si esprime principalmente nella membrana basolaterale delle cellule epitelio retinico del pigmento del occhi2,3 ,4. Composto da 585 aminoacidi, il primo ~ 350 di cui sono altamente conservati tra specie e contenere la sua regione transmembrana, BEST1 agisce come un CaCC in esseri umani1....
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Protocollo
1. produzione BacMam espressione Baculoviridae
- Inserire la sequenza di codificazione di una proteina desiderata bestrophin mammiferi il piolo BacMam vector18 con una sequenza di riconoscimento della proteasi Tobacco Etch Virus (TEV), seguita da un GFP-10 x His-tag al C-terminale della proteina.
- Transitoriamente transfect il plasmide di espressione in adesivo HEK293 cellule19,20,21,22,23. Verificare che l'espressione della proteina GFP-fusione sotto un microscopio ....
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Risultati
L'intensità di fluorescenza transfected transitoriamente di cellule HEK293 adesiva (Figura 1A) è un buon indicatore per il livello di espressione della proteina proiettata in cellule HEK293-F in sospensione (Figura 1B). Se la proteina dell'obiettivo non è ben espressa o mis-è localizzata nelle cellule HEK293 dopo trasfezione transiente, è consigliabile, è consigliabile modificare il costrutto di espressione (ad es., camb.......
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Discussione
Questo protocollo descrive una pipeline utile per espressione e purificazione dei canali ionici bestrophin mammiferi da utilizzare per le analisi future in vitro . Mentre il dispositivo FPLC è richiesto per la cromatografia di esclusione dimensionale, una pompa a siringa è sufficiente per tutti i passaggi di cromatografia di affinità tra cui associazione, lavaggio e medicati. Quando si utilizza una pompa a siringa a soluzioni di push (in una siringa) attraverso una colonna, è essenziale per sottofondo il lato de.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato finanziato da sovvenzioni NIH EY025290, GM127652 e Università di Rochester finanziamento di Start-up.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glicerolo | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazolo | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinina | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Fenilmetilsulfonilfluoruro | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM ThermoFisher | 10902179 | ||
| FreeStyle medium | Spettrofotometro ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop | Omogeneizzatore | ThermoFisher ND-2000 | |
| Avestin | Emulsiflex-C5 | ||
| Colonna HisTrap | GE | 17-5248-01 | |
| Colonna Superdex-200 | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 unità filtranti centrifughe | Millipore | UFC910024 | |
| unità filtranti centrifughe Ultra-4 Unità filtranti centrifughe | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Gel prefabbricato Mini-PROTEAN | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Termociclatore | Bio-Rad | 1861096 | |
| Reagente di trasfezione PolyJet | Vettore SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam | Ottenuto dal laboratorio di Gouaux dell'Istituto Vollum |
Riferimenti
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al.
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Ristampe e permessi
