In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni

Sommario

L'obiettivo del presente protocollo è effettuare ibridazione in situ su adulti coralli campioni che sono stati inclusi in paraffina e sezionati su vetrini. Si tratta di un metodo qualitativo permette di visualizzare l'espressione spaziale di una sonda di RNA anti-senso in tessuti paraffina-incastonati.

Abstract

I coralli sono invertebrati oceano importanti che sono critici per la salute generale dell'oceano così come la salute umana. Tuttavia, a causa di impatti antropici come aumento delle temperature dell'oceano e l'acidificazione degli oceani, coralli sono sempre più minacciati. Per affrontare queste sfide, i progressi nella biologia cellulare e molecolare hanno dimostrato di essere fondamentale per la diagnosi della salute dei coralli. Modificare alcune delle tecniche comunemente utilizzate in medicina umana potrebbe migliorare notevolmente la capacità dei ricercatori di trattare e salvare i coralli. Per risolvere questo problema, un protocollo per l'ibridazione in situ utilizzato principalmente in medicina umana e biologia inerente allo sviluppo evolutiva è stato adattato per l'uso in adulti Coralli sotto stress.

Lo scopo di questo metodo è quello di visualizzare l'espressione spaziale di una sonda RNA in tessuto adulto corallo che è stato incastonato in paraffina e sezionato su vetrini. Questo metodo si concentra sulla rimozione della paraffina e reidratazione del campione, il pretrattamento del campione per garantire permeabilità del campione, pre-l'ibridazione incubazione, ibridazione della sonda RNA e la visualizzazione della sonda RNA. Si tratta di un metodo potente quando si utilizza organismi non-modello per scoprire dove sono espressi geni specifici, e il protocollo può essere facilmente adattato per altri organismi non-modello. Tuttavia, il metodo è limitato in quanto è soprattutto qualitativa, perché espressione intensità può variare a seconda della quantità di tempo utilizzata durante il punto di visualizzazione e la concentrazione della sonda. Inoltre, pazienza è necessaria, in quanto questo protocollo può richiedere fino a 5 giorni (e in molti casi, più a lungo) a seconda della sonda viene utilizzata. Infine, una colorazione di fondo non specifico è comune, ma questa limitazione può essere superata.

Introduzione

Coralli sono costruttori di ecosistema critico e importante per la biodiversità nell'oceano e salute umana^1,2,3. Sono minacciata a causa del cambiamento climatico e altri fattori di stress antropogenici, e molte specie di corallo sono considerate in pericolo critico. Così, c'è un forte bisogno di strumenti molecolari e cellulari per diagnosticare Coralli sotto stress. Inoltre, là poco è capito circa dove i geni sono espressi all'interno di tessuto adulto corallo e quindi poca comprensione delle funzioni di questi geni. Per risolvere questo problema, abbiamo adattato il in....

Protocollo

1. rimozione di paraffina

Attenzione: Eseguire la procedura seguente sotto cappa aspirante.

1. Sparaffinatura le diapositive di paraffina sottile-sezionato con xilene 100% sotto il cofano in barattoli di vetro Coplin per 10 min. Non usare barattoli di plastica Coplin, come xilene si scioglie la plastica. Sterilizzare i barattoli di Coplin in autoclave prima dell'uso.
2. Preparare quattro barattoli di Coplin di vetro sterili con il seguente: etanolo al 100%, 80% etanolo, etanolo al 70% e 60% di etanolo. Diluire l'etanolo con acqua RNAsi-libera.
   1. Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo al....

Risultati

Dopo aver completato questo protocollo, si otterrà l'identificazione di cellule e tessuti che stanno esprimendo la sonda RNA di interesse. I risultati rappresentativi per questo protocollo sono per AP-1, FosB e TNFR41. Questi risultati, precedentemente pubblicati da Traylor-Knowles et al. ¹¹, Visualizza espressione spaziale di RNA sonde sui coralli adulti che sono stati esposti allo stress da calore. Due esempi di diversi tipi di colorazione sono presentat.......

Discussione

Il metodo descritto in questo protocollo è stato modificato dal lavoro precedente in ricerca inerente allo sviluppo evolutivo medico^8,9,10,12,17. Questo protocollo si concentra sulle sfumature di un'ibridazione in situ con una sonda di scavare-contrassegnate RNA anti-senso sui coralli adulti, che sono stati conservati e inclusi in paraffina. Questo me.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di Denhardt	Affymetrix	70468 50 ML
Bioworld Tampone fosfatasi alcalina	Fisher	50-198-724
Buste per vetrini	Fisher	12-587-17B
Bioworld Tampone fosfatasi alcalina	Fisher	50-198-724
Provette Falcon da 50 mL	Fisher	14-959-49A
Soluzione di DNA di sperma di salmone ultrapuro	Invitrogen	15632-011
PBS - Soluzione salina tamponata con fosfato (10X) pH 7,4	Invitrogen	AM9625
Acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
Acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
Soluzione di DNA spermatico di salmone ultrapuro	Invitrogen	15632-011
Vetrino bianco apice adesivo superiore	Leica Biosystems	3800080
soluzione PBS, pH 7.4	Life Technologies	10010072
proteinasi K, grado molecolare, 2 mL	New England Biolabs	P8107S
Super Pap Pen bloccante liquido	Promega	22309
DIG Anti-digossigenina-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BM Purple, 100 mL	Roche	11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set	Roche	11585762001
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Formaldeide soluzione, formato 500 mL	Sigma-Aldrich	252549-500ML
SSC Buffer 20X	Sigma-Aldrich	S6639-1L
Anidride acetica	Sigma-Aldrich	320102-100ML
Formamide	Sigma-Aldrich	47670-250ML-F
Trietanolammina	Sigma-Aldrich	90279-100ML
Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Xileni, AR (ACS), per uso	istologicoVWR	MK866806
Etanolo	VWR	EM-EX0276-4S
TE tampone VWR
forno di ibridazione	VWR	97005-252, 97005-254
Agitatore orbitale	VWR	89032-088

concentrazione PAV6232