Questo articolo descrive un protocollo dettagliato ed altamente efficace per le registrazioni di single sensillum dalla basiconica di sensilli sul palpi dell'apparato boccale degli insetti.
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Articolo metodologico
Sensillum singole registrazioni per Locust Palp sensilli Basiconica
In questo articolo
Sommario
Abstract
I palpi dell'apparato boccale locusta sono considerati organi gustativi convenzionali che svolgono un ruolo importante nella selezione di cibo di una locusta, soprattutto per il rilevamento dei segnali chimici non volatile attraverso sensilli chaetica (precedentemente denominato terminal sensilli o crestati sensilli). C'è ora aumentando la prova che questi palpi hanno anche una funzione olfattiva. Un recettore odorizzante (LmigOR2) e un odorant-binding protein (LmigOBP1) sono state localizzate nei neuroni e nelle cellule accessorio, rispettivamente, la basiconica di sensilli dei palpi. Single sensillum (SSR) di registrazione utilizzato per registrare le risposte dei neuroni odorant, che è un metodo efficace per lo screening di ligandi attivi sui recettori specifici odoranti. SSR è utilizzata negli studi funzionali dei recettori odorant in sensilli palpo. La struttura del basiconica di sensilli situato sulla cupola dei palpi differisce da piuttosto dalla struttura di quelli sulla antenne. Di conseguenza, quando si esegue un SSR suscitato da odoranti, qualche consiglio specifico può essere utile per ottenere risultati ottimali. In questa carta, è stato introdotto un protocollo dettagliato e altamente efficace per un relè SSR da insetto palpo sensilli basiconica.
Introduzione
Gli animali si sono evoluti una gamma di chemosensory organi che percepiscono segnali chimici esogeni. In insetti, organi chemosensory più importanti sono le antenne e i palpi. Su questi organi, diversi tipi di peli chemosensory, chiamati sensilli chemosensory, sono innervati dai neuroni chemosensory (CSNs) entro i peli. CSNs in sensilli chemosensory riconoscere specifici segnali chimici attraverso la trasduzione del segnale da stimoli chimici a potenziali elettrici che vengono successivamente trasferiti fino al sistema nervoso centrale1,2,3 .
CSNs esprimere vari ricevitori chemosensory [ad es., odorant recettori (ORs)], recettori ionotropici recettori (IRs) e recettori gustativi (GRs) sulle loro membrane, che codificano spunti chimici esogeni associati alle varie forme di chemosensation 4,5,6. La caratterizzazione di CSNs è la chiave per la delucidazione dei meccanismi cellulari e molecolari dell'insetto chemorecezione. Ora sensillum singola registrazione (SSR) è una tecnica ampiamente utilizzata per la caratterizzazione di insetto CSNs in sensilli antennali di molti insetti, tra cui mosche7, falene8, coleotteri9, afidi10, locuste11, e le formiche12. Tuttavia, pochi studi hanno applicato un SSR a insetto palpi13,14,15,16,17, perché le particolari strutture di loro sensilli fanno un registrazione elettrofisiologica difficile18.
Sciami di locuste (Orthoptera) è spesso causano di danni alle colture gravi e perdita economica19. I palpi sono creduti per svolgere un ruolo importante nella selezione cibo delle locuste20,21,22,23,24. Due tipi di sensilli chemosensory sono studiati da un microscopio elettronico a scansione (SEM). Di solito, 350 sensilli chaetica e 7-8 sensilli basiconica sono osservati su ogni cupola della locusta palpi18. Chaetica di sensilli sono sensilli gustativi che percepiscono segnali chimici non volatile, mentre sensilli basiconica avere una funzione olfattiva, rilevamento segnali chimici volatili.
Il palpi locusta, i diametri dei socket capelli i sensilli basiconica (ca. 12 µm), sono molto maggiori di quelli di sensilli chaetica (ca. 8 µm)18,25. La parete cuticolare del basiconica di sensilli sui palpi è molto più spessa di quella di sensilli antennali18. Inoltre, la cupola del palpo ha contenuto fluido all'interno di una cuticola altamente flessibile. Queste caratteristiche fanno sì che una penetrazione con un microelettrodo e un'acquisizione di segnali elettrofisiologici buoni è più difficile per sensilli antennali. In questa carta, un protocollo SSR dettagliato ed altamente efficace per locusta palpo sensilli basiconica è presentato con un video.
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Protocollo
1. preparazione degli strumenti e dell'insetto
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Preparazione delle soluzioni di elettrodi e stimoli tungsteno
- Difficoltà un nuovo filo di tungsteno (diametro di 0,125 mm, lunghezza 75 mm) in un micromanipolatore e affilarlo in una soluzione di nitrito (NaNO2) di sodio 10% (p/v) in una siringa a 10 V fornita da un alimentatore per circa 1 min sotto uno stereomicroscopio (ingrandimento 40x).
- Immergere il filo di tungsteno affilata ripetutamente nel NaNO2 soluzione al 10%, circa 4 mm a 5 V in < 1 min (Figura 1A).
- Esaminare il diametro della punta affilata tungsteno frequentemente sotto lo stereomicroscopio fino a quando è bene abbastanza penetrare la cuticola di un sensillum olfattivo del palpo locusta (Figura 1B).
- Preparare le soluzioni di stimolo. Diluire ciascuna della sostanza stimolo chimico in olio minerale. Diluire 1 isoottanolo e acido nonanoico alle diluizioni di 10%. Diluire E-2-esenale ed esanale alle 10-2, 10-3, 10-4e 10-5.
- Preparare Pasteur tubi che trasportano gli stimoli: strisce di carta da filtro (lunghezza di 2 cm, larghezza di 0,5 cm) inserire i tubi di Pasteur, aggiungere le soluzioni di stimolo diluito (ogni 10 µ l) per le strisce di carta da filtro e quindi collegare i tubi di Pasteur con puntali per pipette (1 ml).
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Preparare l'insetto
- Posteriore cavallette (Locusta migratoria) con piantine di grano fresco sotto condizioni di sovraffollamento presso un fotoperiodo di 18:6 h (luce: scuro), una temperatura di 28-30 ° C e un'umidità relativa del 60%. Scegli 1 di 3-giorno-vecchio 5th instar ninfe Locusta e rimuovere le antenne con forbice per evitare interferenze durante la registrazione.
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Preparando il titolare palpo mascellare locusta
- Utilizzare una lastra di vetro (25 x 75 mm) come la base di fissaggio del palpo mascellare (MPH). Attaccare un pezzo di plastica (1 mm di altezza, 10 mm di larghezza, 35 mm di lunghezza) in un angolo del vetrino con nastro bi adesivo e infine fissare un vetro di copertura (18 x 18 mm) sopra il pezzo di plastica con nastro bi adesivo. Posto un piccolo pezzo di nastro di gomma rossa sul vetro di copertura come strato antiscivolo. Il pezzo di plastica e il vetro di copertura costituiscono la piattaforma per il palpo locusta. L'altezza della piattaforma è di circa 1,5 mm.
- Installare un filo di tungsteno (diametro di 0,125 mm, lunghezza di 36 mm) ad una distanza di 1,5 mm parallelo all'interno bordo della piattaforma. Fissare le due estremità del filo sulla piattaforma con nastro bi adesivo.
2. preparazione dei palpi mascellari Locust
- Tagliare una provetta da centrifuga (1,5 ml) verticalmente a metà e tagliare il fondo. Inserire la locusta nella provetta di preparati. Lasciare la regione ventrale e la testa della locusta esposta. Difficoltà l'Assemblea sul vetrino con nastro adesivo biadesivo (Figura 2A).
- Tirare il palpo mascellare sulla piattaforma.
- Mettere il filo di tungsteno al quarto segmento il palpo. Mettere massa adesiva su ciascun lato del filo di tungsteno, a circa 2 mm dal palpo mascellare (Figura 2A e 2B).
3. single Sensillum registrazioni
- Luogo la preparazione di palpo mascellare locusta sotto un microscopio a basso ingrandimento (100x). Regolare la posizione della preparazione fino a quando il palpo è perpendicolare all'elettrodo di registrazione (Figura 3A).
- Inserire l'elettrodo di riferimento (elettrodo di tungsteno) nell'occhiello locusta utilizzando un micromanipolatore. Spostare l'elettrodo di registrazione (elettrodo di tungsteno) vicino il palpo mascellare con il micromanipolatore (Figura 3B e 3C).
- Regolare il dispositivo di rilascio di odore a circa 1 cm dal palpo mascellare (Figura 3B).
- Aprire il software di registrazione Auto Spike 32. Impostare i parametri di registrazione come segue: la scala di registrazione su 500 µV; l'alto cutoff del filtro su 300 Hz, la frequenza di taglio basso su 200 Hz; e il pretrigger su 10 s.
- Collegare l'elettrodo di registrazione per un 10 x universale AC/DC amplificatore.
- Passare il microscopio ad un ingrandimento elevato (500 X). Inserire l'elettrodo di registrazione nella base di un sensillum basiconic sul palpo mascellare e regolare delicatamente l'elettrodo di registrazione per ottenere buone spontanee picchi (Figura 3D).
- Aprire il controller di stimolo per fornire un flusso continuo di aria a 20 ml/s. impostare il tempo di stimolazione di 1 s. segnali di Record per 10 s, a partire di 10 s prima dell'inizio dell'impulso dello stimolo.
- Utilizzare un amplificatore di AC/DC universale di 10x per amplificare i segnali. Portare i segnali nei 4 IDAC. Analizzare i segnali con il software Auto Spike 32. Segnali AC sono filtrati passa-banda tra 200 a 300 Hz. uso Auto Spike 32 per distinguere le ampiezze picco-valle dai rumori. Calcolare le risposte dei neuroni come l'aumento della frequenza di potenziale di azione (punte al secondo) sopra le frequenze spontanee. Eseguire un'analisi statistica usando GraphPad Prism 7.
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Risultati
Due sottotipi di sensilli (pb1 e pb2) sul palpo mascellare locuste vengono identificati in base a dinamiche di risposta diversa per chimica odoranti (isoottanolo 1 10% e 10% acido nonanoico). I neuroni in pb1 producono picchi significativamente più di 1-isoottanolo rispetto ad acido nonanoico mentre i neuroni in pb2 sono significativamente che meno attivata da 1 isoottanolo rispetto ad acido nonanoico (Figura 4). Esanale ed E-2-esenale può evocare un palpo lo...
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Discussione
Gli insetti si basano su palpi per rilevare gli odori degli alimenti, e loro palpi sono creduti per svolgere un ruolo importante nella speciazione13,27. I palpi sono semplici organi olfattivi e stanno ricevendo crescente attenzione come un modello interessante per l'esplorazione della neuromolecular reti sottostanti chemosensation28.
Insetto labellar e palpo SSRs sono stati effettuati con successo su Drosoph...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da una sovvenzione dalla Fondazione Nazionale Scienze naturali della Cina (No.31472037). Qualsiasi menzione di marchi o prodotti commerciali in questo articolo è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica una raccomandazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Filo di tungsteno | ADVENT | W559504 | Utilizzato per realizzare l'elettrodo e fissare il palp |
| NaNO2 | Sigma-aldrich | 563218-25G | Utilizzato per affilare il filo di tungsteno |
| Alimentatore CA | Syntech | A2-70 | Fornire la tensione nell'affilatura del filo di tungsteno |
| Stereoscopio | Motic | SMZ-163 | Utilizzato per osservare il affilatura del filo di tungsteno |
| Microscopio | Olympus | W-51 | Utilizzato per osservare i sensilli sul palpo mascellare della locusta |
| Controller intelligente di acquisizione dati | Syntech | IDAC-4 | Visualizzazione su schermo in tempo reale di tutti i segnali prima e durante la registrazione |
| Controllore di stimolo | Syntech | CS-55 | Utilizzato per il controllo dell'applicazione di stimolo |
| Elettronico micromanipolatore | C.M.D.T | CFT-8301D | Utilizzato per il movimento minore dell'elettrodo di registrazione |
| Micromanipolatore | Narishige | MN-151 | Utilizzato per il movimento minore dell'elettrodo di riferimento |
| EDIFIER | dell'altoparlante R101T06 | Collegato con IDAC-4 e che fornisce il suono per il segnale | |
| Base magnetica | PDOK | PD-101 | Utilizzato per tenere l'elettrodo e il tubo di erogazione dello stimolo |
| Tavolo di isolamento dalle vibrazioni | TianHe | HAP-100-1208 | Utilizzato per isolare le vibrazioni dall'apparecchiatura |
| Vetrino | CITOGLAS | ZBP-407 | Utilizzato per realizzare la base per l'MPH |
| Blu-tack | Bostik | Blu-tack-45g | Fissaggio del filo di tungsteno |
| Tubo Pasteur | YARE | WITEG | Posizionamento della carta da filtro contenente stimoli soluzioni di stimolo |
Riferimenti
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