Citometria di flusso di database-Guida per la valutazione della maturazione delle cellule mieloidi del midollo osseo

Summary

La diagnosi MDS è difficile in assenza di criteri morfologici o citogenetica non informativo. MFC potrebbe contribuire ad affinare il processo diagnostico MDS. Per diventare utile per la pratica clinica, l'analisi MFC deve basarsi su parametri con sufficiente sensibilità e specificità, e i dati devono essere riproducibili tra operatori diversi.

Abstract

Un gruppo di lavoro avviato entro l'associazione di Cytometry francese (AFC) è stato sviluppato al fine di armonizzare l'applicazione della citometria a flusso multiparametrica (MFC) per la diagnosi di malattia mieloide in Francia. Il protocollo presentato qui è stato concordato e applicata tra settembre 2013 e novembre 2015 in sei laboratori diagnostici francesi (ospedali dell'Università di Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nizza e Lille e Institut Paoli-Calmettes in Marsiglia) e ha permesso la standardizzazione dell'acquisizione di dati e preparazione del campione del midollo osseo. Tre database di maturazione sono stati sviluppati per neutrofilo, monocytic e stirpi degli eritrociti con midollo osseo da individui "sani" donatore (individui senza alcuna prova di una malattia ematopoietica). Un metodo affidabile di analisi per ogni linea mieloide dovrebbe essere applicabile per uso diagnostico sistematico. Nuovi casi possono essere analizzati nello stesso modo e confrontati con i database di solito. Così, le anomalie fenotipiche quantitative e qualitative possono essere identificate e quelli sopra 2SD rispetto ai dati dei campioni di midollo osseo normale dovrebbe essere considerate indicative di patologia. La maggiore limitazione è la maggiore variabilità tra i dati ottenuti utilizzando gli anticorpi monoclonali ottenuti con i metodi basati su tecnologie di ibridoma e attualmente utilizzati nella diagnosi clinica. L'impostazione di criteri per la validazione tecnica dei dati acquisiti possono contribuire a migliorare l'utilità di MFC per la diagnostica MDS. La definizione di questi criteri richiede analisi in un database. La riduzione della soggettività investigatore nell'analisi dei dati è un importante vantaggio di questo metodo.

Introduction

In assenza di marcatori fenotipici specifici per i cambiamenti dysplastic che si verificano nelle cellule mieloidi durante MDS iniziazione e progressione, un nuovo approccio è stato proposto negli ultimi anni sulla base della valutazione delle vie di maturazione (alterata espressione di gli antigeni mieloidi durante la produzione di cellule mieloidi mature) o della distribuzione anomala di tipi differenti delle cellule all'interno del midollo osseo (BM) delle cellule scomparti^1,2.

Questo articolo presenta un metodo nuovo per applicazione standardizzata di MFC al fine di rilevare i cambiamenti dysplastic in compartimenti delle cellule mieloidi BM correlati a sindromi mielodisplastiche (MDS) o altre malattie ematologiche mieloidi. Questo studio inoltre mostra l'utilità dell'utilizzo di database di maturazione per l'analisi dei dati MFC.

Standardizzazione della procedura di preparazione del campione, acquisizione dati e analisi utilizzando i database consentirebbe l'identificazione delle anomalie fenotipiche più rilevanti legate a cambiamenti dysplastic in cellule mieloidi BM. Pertanto, sono necessari per lo sviluppo di una strategia di analisi che può essere utilizzata in successive analisi statisticamente selezionati sottogruppi basati su formati ben identificati e incontestati (dot grafici, istogrammi e diagrammi separatore automatico di popolazione (APS)) Arrotonda. La scoperta di anomalie fenotipiche robuste in MDS faciliterebbe la diagnosi nei casi con o senza displasia morfologica minima e senza aberrancies citogenetica. Identificazione dei parametri discriminanti consentendo la riduzione di immunophenotypic pannelli può semplificare l'attuale punteggi², permettendo loro applicabilità nei laboratori di patologia clinica.

Questo metodo limita le interpretazioni soggettive dei dati cytometry, come è stato segnalato in MDS diagnosi³. Questo passaggio è un prerequisito per lo sviluppo di strumenti automatizzati per l'elaborazione e l'analisi di flusso dati⁴.

MDS comprende un gruppo eterogeneo di disordini clonali di cellule staminali ematopoietiche (HSC) in cui le mutazioni spliceosoma cooperano con modificatori epigenetici specifici per produrre il fenotipo MDS. È ormai noto che, insieme con le mutazioni di HSC, altri meccanismi sono coinvolti nella fisiopatologia MDS, come aberrante infiammazione immune-mediata e interazioni tra HSCs maligno ed il microambiente stromale del BM. Tuttavia, questi meccanismi rimangono poco compresi. L'eterogeneità larga clinico e biologico di MDS rende la diagnosi e la selezione della terapia ottima di una sfida. Nell'ultimo decennio, gli studi multipli hanno indicato che MFC è spesso più sensibile nel rilevare displasia² rispetto alla morfologia, ma i vincoli tecnici ed economici rendono questa tecnica difficile da standardizzare, con risultati spesso dipende il Esperienza di interprete³. Inoltre, non è chiaro come MFC può pendere la bilancia verso MDS in casi con o senza displasia morfologica minima e in assenza di anomalie citogenetiche o in casi limite come hypocellular MDS, con un conteggio basso blast, da altri non-clonale BM disturbi come guasto del midollo osseo (cioè., anemia aplastica). Inoltre rimane difficile da differenziare i casi limite di MDS con un eccesso di scoppi dalla leucemia mieloide acuta (AML). Per tutti questi motivi, le linee guida cliniche non integrano MFC test nella diagnosi finale di MDS. Nel 2011, US nazionale completa Cancer Network (NCCN) consigliato MFC per la stima della percentuale di cellule CD34 +, rilevamento dei cloni di emoglobinuria parossistica notturna e la presenza di cloni di cellula T citotossici in hypocellular MDS⁵. Queste due situazioni di quest'ultime comportano anche un obiettivo terapeutico poiché dati clinici hanno dimostrato una buona risposta di questi pazienti alla terapia immunosopressiva⁶. Linee guida NCCN 2017, citando le raccomandazioni dell'International Working Group (IWG), elencati aberrante immunophenotyping rilevamento da MFC tra i co-criteri per la diagnosi MDS, ma senza fare alcun specifiche⁶. Inoltre, la classificazione del WHO pubblicata di recente stipula che MFC risultati da soli non sono sufficienti per stabilire una diagnosi primaria di MDS in assenza di dati morfologici e/o citogenetica conclusivi⁷. Tuttavia, MFC può essere utilizzato come un ulteriore test mostrano la disregolazione della cellula mieloide maturazione modelli e quantificare la "distanza dal normale" per un paziente in un momento specifico nel corso della malattia.

Questo metodo è applicabile a laboratori clinici interessati nella valutazione della displasia nelle cellule mieloidi BM usando MFC immunophenotyping, al fine di perfezionare la diagnosi in MDS o altri disordini mieloidi con anomalie dysplastic.

Protocol

Il protocollo elencato di seguito è stato approvato dal "Comité de Protection des Personnes" (comitato etico indipendente) 1 Sud-Est da Università ospedale di Saint-Etienne, Francia.

1. citometro impostazioni

Nota: Le impostazioni del citometro sono state eseguite conformemente alle raccomandazioni di flusso di Francia, secondo la procedura di EuroFlow "EuroFlow Standard operativo protocollo (SOP) per la messa in funzione e compensazione (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

1. Mensile setup dello strumento
   1. Accendere il citometro. Assicurarsi che tutti i livelli del fluido siano appropriata e aperta Diva 6.1.3. Eseguire avvio fluidica: nella barra dei menu, selezionare ' citometro | Avvio della fluidica '. Fare clic su 'OK' quando richiesto. Consentire il citometro si riscaldi per almeno 30 min.
   2. Controllo delle prestazioni - perle di CST
      Nota: Per questo passaggio, preparare tubo 12 75 mm in polistirolo, CST perline e guaina fluido (Vedi Tabella materiali).
      1. Etichettare una provetta polistirolo da 12 x 75 mm² 'CST'. Mescolare la fiala di sfere fornito inversione leggera o tramite vortex molto delicato. Aggiungere nella provetta etichettata: 0,35 mL di fluido di guaina e 1 goccia di perline CST. Vortice del tubo delicatamente e procedere all'acquisizione. Conservare la provetta per fino a 8 ore a 2-25 ° C al buio se non acquisendo immediatamente.
      2. Eseguire il controllo delle prestazioni: nella barra dei menu, selezionare ' citometro | CST'.
      3. Nella scheda 'Setup' del modulo CST: confermare il Canto II come nella configurazione di default 4-2h-2V e anche verificare l'esistenza di una linea di base creato utilizzando il lotto attuale di perline CST per questa configurazione. Se non esiste una linea di base, consultare la CST perline IFU. Verificare che la linea di base non è scaduto: in ' installazione Control', selezionare ' verifica Performance' dal menu a discesa.
      4. Verifica 'Caricare manualmente il tubo' e fare clic su 'Esegui'. Confermare il numero di lotto visualizzato. Delicatamente vortice le perline diluite preparato in precedenza e quando richiesto, caricare le perline diluite e fare clic su 'OK'.
      5. Quando il controllo di prestazioni è completo, verificare che le prestazioni citometro passato. Fare clic su 'Visualizza Report'. Eseguire nuovamente il controllo di prestazioni se non hanno superato i risultati. Salvare il Report in formato PDF con la data del Report di monitoraggio prestazioni.
   3. Regolare 'Tensioni PMT fluorescente' con perle dell'arcobaleno (Tabella materiali).
      Nota: I valori di destinazione sono stipulati in Euroflow Procedure operative Standard (SOP) dal titolo "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". Questa SOP è disponibile sul sito Euroflow (www.euroflow.org; nell'area pubblica; Scheda protocolli).
      1. Creare un nuovo esperimento via ' mensile data di impostazione dello strumento | Campione '.
      2. ', scegliere i parametri ottici e fluorocromi corrispondente ai tubi interessati (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) e controllare i parametri di acquisizione desiderata (Log, A, H e / o W). Applicare le impostazioni correnti di CST (fare clic destro su ' impostazioni citometro ' dell'esperimento). Imposta la soglia per parametro FSC a 10.000.
      3. Il citometro, disattivare la compensazione durante l'impostazione di fluorescenza tensioni PMT per impostazione destinazione MFI; per questo scopo, andare in «Ispettore», passare alla scheda «Compensazione» disattiva compensazione da deselezionando ' abilitare la compensazione ' opzione.
      4. Creare un foglio di ' destinazione MFI' con tutte le necessarie dot trame (n = 2; FSC vs SSC, FITC versus PE), istogrammi (n = 8; un istogramma per ogni rivelatore a fluorescenza) e statistiche che indicano il riferimento i valori di picco (MFI e CV) per ogni canale di fluorescenza.
      5. Diluire 1 goccia di particelle di calibrazione di 8-picco arcobaleno perle in 1 mL di acqua distillata e vortex prima dell'uso. Acquisire senza registrare la soluzione di perle arcobaleno 8-picco alla portata di 'LOW' . Conservare la provetta per fino a 8 ore a 2-25 ˚ c nel buio se non acquisendo immediatamente.
      6. Canottiera porta perline ' popolazione P1' in FSC contro bivariata dot plot SSC e il picco 8 ° o 7 ° in FITC contro trama bivariata dot PE (il picco più brillante o quello successivo verso il basso, come è previsto nel documento Euroflow intitolato "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") e il nome di questo cancello popolazione P2.
      7. Continuare l'acquisizione della sospensione 8-cime Rainbow perlina e regolare tensioni PMT in tutti i canali di fluorescenza per raggiungere valori di MFI di destinazione secondo il documento Euroflow "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
      8. Una volta raggiunto il valore di destinazione MFI per il 7 ° o 8 ° picco, registrare l'IFM di Target raggiunto e i corrispondenti valori finali di PMT. 5.000 eventi di acquisire e registrare i dati.
         Nota: Che PMT valori deve essere utilizzato sotto al punto 1.2.3 (Performance Check - conferma di PMT valori con perle dell'arcobaleno).
      9. Registrare questi valori facendo una stampa dello schermo con le impostazioni di ' destinazione MFI' e strumento di foglio di lavoro e salvare come immagine. jpg.
         Nota: Quando viene creato un "Nuovo" tubo, a volte i valori PMT variano in modo imprevisto. Per questo, un duplice controllo di PMT è essenziale. Confrontare ogni volta i valori PMT alle tue note, doppio controllo che ' destinazione MFI' valori e valori di PMT sono corretti!
      10. Salvare l' 'Applicazione Impostazioni'. Nel Browser, fare clic destro su ' citometro impostazioni '. Dal menu a discesa, selezionare ' Impostazioni applicazione 'e salvare. Fare clic su 'OK'. Se richiesto, fare clic su Sì per mantenere i valori di soglia.
          Nota: Salvare le impostazioni dell'applicazione utilizzando il nome predefinito. Non rinominare le impostazioni.
   4. Regolare il 'FCS' e 'SSC tensioni' con sangue lisato lavato (LWB).
      Nota: Per questo passaggio, sono necessari 50 µ l di un campione di sangue periferico (PB) da un sano volontariato soluzione lisante (Tabella materiali) e il tampone di lavaggio.
      1. Pipette di 50 µ l di PB in un tubo. Aggiungere 2 mL di soluzione lisante appena diluita. Mescolare delicatamente e incubare per 10 minuti a TA.
      2. Centrifugare per 5 min a 540 x g.
      3. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare, lasciando circa 50 µ l di volume residuo nel tubo. Mescolare delicatamente e aggiungere 2 mL di soluzione di lavaggio filtrata.
      4. Centrifugare per 5 min a 540 x g.
      5. Ripetere ancora una volta i passi 1.1.4.3–1.1.4.4.
      6. Aggiungere 250 µ l di tampone di lavaggio filtrato e mescolare delicatamente.
      7. Nell'esperimento creato per acquisizione di perle dell'arcobaleno, creare un nuovo ' esemplare | Nuovo foglio di lavoro ': disegnare un grafico bi-parametrico di SSC-A / FSC-A.
      8. Acquisire le cellule, i linfociti in un FSC contro bivariata dot plot SSC del cancello e regolare tensioni FSC e SSC per raggiungere i seguenti valori di destinazione di media per la popolazione dei linfociti gated: FSC: 55.000 (gamma 50.000 – 60.000) e SSC: 13.000 (gamma 11.000 –15,000).
      9. Acquisire e registrare i dati con circa 10.000 eventi. Verificare i valori medi di destinazione FSC e SSC per linfociti gated. Se necessario, regolare nuovamente tensione FSC e SSC.
      10. Stampa schermo e la stampa dei valori di canale di destinazione che si ottengono.
   5. Impostazioni di compensazione di fluorescenza.
      Nota: I controlli di singolo-macchiato compensazione devono essere impostati dopo le impostazioni di destinazione MFI e impostazioni di FSC/SSC sono state stabilite. Per questo passaggio, un PB da un volontario sano, particelle di compensazione (Tabella materiali), soluzione lisante e tampone di lavaggio sono necessari. L'elenco dei reagenti fluorocromo-coniugate dell'anticorpo utilizzato per configurare le matrici di compensazione di fluorescenza e le loro popolazioni di riferimento sono elencati in tabella 1.
      1. Etichettare una provetta per reagente da utilizzare nella creazione di compensazione di fluorescenza (PerCPCy5.5, FITC, PE, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 e APC-H7 - CD71) e un tubo "vuoto/senza macchia".
      2. Pipettare 50 µ l di PB in ciascuna provetta o 1 goccia di "negativo" compensazione particelle + 1 goccia di "positivo" compensazione particelle nei tubi controllo compensazione sopra indicate in tabella 1.
      3. Aggiungere una quantità appropriata di reagente anticorpo al tubo. Aggiungere tampone di lavaggio filtrata per raggiungere un volume finale di 100 µ l per provetta e mescolare delicatamente. Incubare per 15 min a RT, al riparo dalla luce.
      4. Aggiungere 2 mL di soluzione lisante fresco diluito solo nei tubi con le cellule e mescolare delicatamente. Incubare per 10 min a RT, al riparo dalla luce.
      5. Centrifugare per 5 min a 540 x g.
      6. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare lasciando circa 50 µ l di volume residuo in ogni provetta. Mescolare delicatamente. Aggiungere 2 mL di tampone di lavaggio filtrata.
      7. Centrifugare 5 min a 540 x g.
      8. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare lasciando circa 50 µ l di volume residuo in ogni provetta. Aggiungere tampone di lavaggio filtrata per raggiungere un volume finale di 250 µ l per provetta e mescolare delicatamente.
      9. Creare controlli di compensazione.
         1. Dalla barra dei menu, selezionare esperimento creato per acquisizione di perle dell'arcobaleno. Creare un nuovo ' esemplare | Installazione di compensazione | Creare compensazione controlli.
         2. Nella finestra di dialogo risultante, selezionare la casella di controllo ' Includi separata non macchiate controllo tubo/ben ' . Creare controlli generici (non specifico per etichetta) compensazione per FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Creare controlli etichetta specifica compensazione per PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 e APC-H7 - CD71. Fare clic su 'OK'.
         3. In un nuovo foglio di lavoro, creare un grafico di SSC-A / FSC-A bi-parametrico e disegnare un cancello su linfociti (P1) e l'istogramma corrispondente al fluorocromo che verrà rilevato in ciascun tubo e disegnare un cancello P2 per il picco positivo. Visualizzare la gerarchia (clic destro su un grafico e selezionare "Visualizza gerarchia di popolazione") per visualizzare il numero di eventi in P2, fatta eccezione per il tubo di controllo non colorati.
         4. Nel Browser, espandere l'esemplare di controlli di compensazione.
         5. Vortice le cellule non macchiate, preparato in precedenza, per 3 – 5 s. installare le cellule non colorate disposti sul citometro. Regolare la portata a 'Medium' e fare clic su ' acquisire dati '. Nella trama FSC-A vs SSC-A puntino, regolare il gate di P1 per comprendere pienamente la popolazione linfocitaria. Pulsante destro del mouse sul cancello di P1. Selezionare 'Applica a tutti i controllo di compensazione'.
         6. Dal cruscotto «Acquisizione» , fare clic su 'Record dati ' di acquisire 5.000 eventi. Per tutte le celle di singolo-colore tinto controllo, verificare che il cancello di intervallo P2 comprende la popolazione positiva.
         7. Per il PE-Cy7 e tubi APCH7, aggiungere un cancello di intervallo P3 l'istogramma e assicurarsi che essa comprende la popolazione negativa, e che la P2 comprende la popolazione positiva.
         8. Calcolare la compensazione. Dalla barra dei menu, selezionare ' esperimento | Installazione di compensazione | Calcolare la compensazione '. La matrice di compensazione il nome: "Data di compensazioni". Selezionare 'Link e salvare'.
         9. Salvare la matrice di compensazione nelle impostazioni dell'applicazione catalogo: clicca su 'citometro impostazioni | Le impostazioni dell'applicazione | Salva ', un nome di matrice di incremento retributivo 'Data di compensazione' e fare clic su 'OK'.
         10. Nel Browser, fare clic su ' impostazioni citometro '. Nella finestra di ispezione, passare alla scheda «Compensazione» fare clic su stampa nell'angolo inferiore destro.
             Nota: Queste informazioni possono essere recuperate anche dal catalogo.
         11. Controllo della matrice compensazione.
             1. Mescolare in una provetta di tutto il singolo tubo macchiato (APCH7 di scelta).
             2. Creare un nuovo esperimento denominato 'Data di verifica di compensazione', aggiungere nuovo campione, fare clic destro su ' impostazioni citometro ' di questo esperimento e scegliete ' Link | Scollegare | Impostazione dell'applicazione ' salvato al passaggio 1.1.3.10. Acquisire 50.000 eventi da questo tubo con le nuove impostazioni.
             3. Applicare un nuovo foglio di lavoro globale. Creare 1 dot plot FSC-A/SSC-A e disegnare un cancello per visualizzare i linfociti e n x (n-1) / 2 altri appezzamenti incentrata sul cancello di linfociti per visualizzare i parametri di due a due.
2. Configurazione dello strumento quotidiano
   1. Accendere il citometro. Assicurarsi che tutti i livelli del fluido siano appropriata e aperta Diva 6.1.3. Eseguire avvio fluidica: nella barra dei menu, selezionare ' citometro | Avvio della fluidica '. Fare clic su 'OK' quando richiesto. Consentire il citometro si riscaldi per almeno 30 min.
   2. Prestazioni Check - CST perline: ripetere la procedura 1.1.2.1–1.1.2.5.
   3. Controllo delle prestazioni - conferma dei valori PMT con perle dell'arcobaleno.
      1. Etichettare una provetta polistirolo come ' arcobaleno perle ' e controllare che il numero di lotto è quella in uso. Agitare bene il flacone di Rainbow Bead. Preparare le perle arcobaleno, aggiungere 1 goccia di perle dell'arcobaleno a 1 mL di acqua distillata o deionizzata. Proteggere dalla luce.
         Nota: Procedere all'acquisizione o conservare la provetta a 2-8 ° c fino alla acquisizione.
      2. Creare un nuovo esperimento: ' Rainbow perline data '.
      3. Collegare le compensazioni: fare clic con il pulsante destro su ' citometro impostazioni ', selezionare ' Link Setup', selezionare la matrice di adeguato compenso creata nel passaggio 1.1.5.9.9 e selezionare 'Sovrascrivi'.
      4. Scollegare la compensazione: fare clic con il pulsante destro su ' citometro impostazioni ', selezionare 'Scollega dal setup precedentemente collegato' e scegliere 'OK'.
      5. Applicare ' applicazione Impostazioni ': fare clic con il pulsante destro su ' citometro impostazioni ', selezionare ' Impostazioni applicazione ', applicare l'impostazione creata nel passaggio 1.1.3.10 durante l'installazione del mensile e selezionare 'mantenere il valore di compensazione '.
      6. Deselezionate l'opzione 'Attiva compensazione'.
      7. Creare un nuovo campione nell'esperimento con modello di foglio di lavoro per perle dell'arcobaleno. Acquisire il tubo nell'acquisizione di 'LOW' .
      8. Durante l'acquisizione di perline, regolare il cancello di P1 per includere solo la popolazione del branello di singoletto. Regolare il cancello P2 sulla trama del FITC-A / PE-A puntino per includere solo la popolazione del branello di singoletto. Registrare eventi di 10.000.
      9. Controllare che l'IFM e i valori di CV ottenuti per P2 popolazione siano gli obiettivi pre-definiti del protocollo. In caso contrario, lavare il citometro e avviare nuovamente l'operazione. Salvare il report in formato PDF.

2. preparazione del campione BM

Nota: Eseguire la cella protocollo appena prima la procedura di colorazione di lavaggio.

1. Pipettare 600 µ l di campione primario in una provetta da centrifuga da 15 mL.
2. Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio (PBS + 0,5% BSA [> BSA puro 98%] + 0,09% NaN₃ filtrata soluzione a pH 7,4). Mescolare la sospensione cellulare bene usando una pipetta.
3. Centrifugare per 5 min 540 x g (lavaggio 1). Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare.
4. Ripetere i passaggi 2.2 – 2.3 (programma 2).
5. Sospendere il pellet cellulare in 400 µ l di tampone di lavaggio.
6. Colorazione dei marcatori di spina dorsale. Trasferire l'intero volume degli anticorpi spina dorsale ad un tubo in polipropilene per analisi FACS, identificato con i dati del paziente e la "spina dorsale". Aggiungere 350 µ l di campione lavato (il volume di campione lavato necessario per riempire tutti i tubi sul pannello). Mescolare bene usando una pipetta.
   Nota: Calcola il volume totale degli anticorpi di spina dorsale per la superficie della membrana di colorazione (come mostrato nella tabella 2).
7. Pipettare uguali quantità del mix di campione-backbone in 3 tubi in polipropilene per analisi FACS, identificato con i dati del paziente e "tubo numero 1" a "tubo numero 3". Se necessario, è possibile utilizzare tampone di lavaggio per raggiungere un volume finale di 200 µ l per provetta.
   Attenzione: Fare attenzione a non lasciare alcuna traccia del campione sulle pareti dei tubi; in caso contrario, queste cellule non saranno colorate. Se necessario, vortice le cellule e centrifugare la provetta.
8. In ogni provetta, aggiungere il volume appropriato di anticorpi diretti contro marcatori di superficie cellulare (tranne che per i marcatori di spina dorsale), come specificato nella tabella 2. Mescolare bene usando una pipetta. Incubare per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
9. Aggiungere 2 mL di soluzione lisante. Mescolare bene usando una pipetta. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
10. Centrifugare per 5 min a 540 x g. Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare, lasciando circa 50 µ l di volume residuo in ogni provetta. Mescolare bene usando una pipetta.
11. Aggiungere 2 mL di buffer per il pellet cellulare di lavaggio. Mescolare bene usando una pipetta.
12. Ripetere i passaggi 2.10 – 2.11 (programma 2).
13. Centrifugare per 5 min a 540 x g. Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di PBS. Mescolare bene usando una pipetta.
14. Acquisire le cellule, preferibilmente, immediatamente dopo la colorazione o conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce, per non più di 1 ora fino a quando misurato nel citometro a flusso.

3. acquisizione dati

1. Aprire un nuovo esperimento nel software Diva e rinominarlo secondo il nome, il tipo di campione e data.
2. Creare un nuovo campione contenente 3 tubi. Specificare il layout di esperimento gli anticorpi utilizzati in ciascun tubo.
3. Fare clic destro su ' impostazioni citometro ', scegliere ' Impostazioni applicazione ' e applicare i valori ottenuti nel Setup mensile (punto 1.1.3.10).
4. Aprire un nuovo foglio di lavoro globale e creare le trame di puntino: SSC-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy 5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. Nella trama SSC-A/FSC-A puntino, creare un cancello per selezionare celle di singoletto. Nella trama SSC-A/CD45-BV500-A puntino, creare cancelli per selezionare 4 popolazioni: granulociti, monociti, esplosioni e linfociti. Progetto queste popolazioni nelle trame dot create in precedenza.
5. Creare un nuovo foglio di lavoro globale per il controllo di compensazione come descritto nel passaggio 1.1.5.9.11.3.
6. Acquisire il tubo in 'MEDIUM' acquisizione e record 500.000 eventi/tubo. Dopo la validazione tecnica (valutazione della compensazione e la macchiatura corretta), è possibile esportare i dati come file di FCS3.0.

4. analisi dei dati

Nota: Per costruire i database BM normali erano come segue il file utilizzati da donatori sani e da individui senza alcuna prova per una malattia ematopoietica 11 da 18 file per il Neutrophils_NM database, 10 da 18 file per Monocytes_NM database e 14 da 18 file di database NRC_NM. I file eliminati ha mostrato vari problemi tecnici, come presentato nella sezione risultati rappresentante. I file sono stati analizzati singolarmente utilizzando il software Infinicyt (Tabella materiali), conforme alle varie strategie raffigurate in Figura 1A(1-3) per lignaggio del neutrofilo (profilo Neutrophils_Maturation.inp), Figura 2 A per lignaggio del monocito (profilo Monocytes_Maturation.inp) e Figura 3A(1-2) per stirpe delle cellule degli eritrociti (profilo NRC_Maturation.inp).

1. Strategia di analisi per i neutrofili -Costruzione di database Neutrophils_NM 
   1. Identificare CD34 + neutrofilo-commesso blasti utilizzando un'intersezione di sette cancelli, consentendo la selezione di CD34 + CD117 + HLADR + basso CD10 - CD13 + CD11b-eventi (Figura 1a. 1). Assegnare questi eventi alla scheda 'Del neutrofilo' nella struttura della gerarchia di popolazione e da allora in poi deselezionare questa scheda al fine di rimuovere queste cellule (raffigurate in blu) dal display dei restanti eventi (grigio).
   2. Isolare il CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + Bassi precursori dei neutrofili utilizzando un'intersezione di sei porte, come illustrato nella Figura 1a (2) e assegnarli alla scheda 'Del neutrofilo' .
   3. Identificare più maturi neutrofili utilizzando un'intersezione di quattro cancelli, permettendo la distinzione del CD45dim SSCint-Ciao CD117-HLADR-cellule e loro assegnazione alla scheda 'Del neutrofilo' .
   4. Deselezionare gli eventi restanti, mantenendo solo i neutrofili visibili, quindi esportare questa popolazione facendo clic ' File | Esportare ' e verificare che tutti i parametri necessari vengono controllati e salvare i dati come file di FCS.
   5. In un file Unito composto da tutti i file esportati di FCS, eseguire un controllo di qualità da valutare l'intensità di espressione degli indicatori per ciascuna sottopopolazione. Utilizzando APS Piazzole con mediane per ogni file e curve di SD per ciascuna sottopopolazione mostrato, rimuovere i casi fuori le curve 2SD (Vedi dettagli nella sezione risultati rappresentante) (Figura 1B).
   6. Nel file risultante composto con "Neutrofili" visibili, disegnare il percorso di maturazione in un diagramma APS (Figura 1C a sinistra) e salvare come file .cyt.
      Nota: Un confronto diagramma di maturazione permette la visualizzazione di tutti i parametri da tutti i file inclusi nel database Neutrophils_NM rappresentati nel database normalizzato. Il diagramma presentato nella Figura 2C, lato destro, Mostra che tutti i file inclusi nel database Neutrophils_NM (n = 11) montare in 2 SD rispetto con mediana del gruppo.
2. Strategia di analisi per i monociti - costruzione di database Monocytes_NM
   1. Identificare le cellule di stirpe monocytic (CD117 + /-CD64 + HLADR + Ciao) utilizzando un'intersezione delle quattro porte (Figura 2A). Assegnare questi eventi alla scheda 'Monocytic' nella struttura della gerarchia di popolazione.
   2. Deselezionare gli eventi restanti, mantenendo solo le cellule monocytic visibili, quindi esportare questa popolazione facendo clic ' File | Esportare ' e verificare che tutti i parametri necessari vengono controllati e salvare i dati come file di FCS.
   3. In un file Unito composto da tutti i file esportati di FCS, eseguire un controllo di qualità da valutare l'intensità di espressione di marcatori per ogni sottopopolazione, quindi rimuovere i casi fuori le curve 2SD (dettagli nella sezione risultati rappresentante) (Figura 2 B).
   4. Nel file risultante con "Monocytic" celle visibili, disegnare il percorso di maturazione del diagramma di APS (Figura 2C a sinistra) e Salva come un file di .cyt.
      Nota: Un confronto diagramma di maturazione permette la visualizzazione di tutti i parametri da tutti i file inclusi nel database Monocytes_NM rappresentati nel database normalizzato. Il diagramma presentato nella Figura 2C, lato destro, Mostra che tutti i file inclusi nel database Monocytes_NM (n = 10) montare in 2 SD rispetto con la mediana del gruppo.
3. Strategia di analisi per globuli rossi nucleati (NRC) - costruzione di database NRC_NM
   1. Identificare degli eritrociti commit scoppi di CD34 + utilizzando un'intersezione di sette cancelli che permettono la selezione delle cellule CD34 + CD117 + HLADR + basso CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + eventi (Figura 3a (1)). Assegnare questi eventi alla scheda "NRC" nella struttura della gerarchia di popolazione e quindi deselezionare questa scheda al fine di rimuovere queste cellule (raffigurate in rosso) dal display dei restanti eventi (grigio).
   2. Identificare più maturo NRCs utilizzando un'intersezione delle quattro porte che permettono la discriminazione CD45-/ + dim SSClow CD36 + Ciao CD71 + Ciao CD105 + /-cellule. Assegnare questi eventi alla scheda "NRC" (Figura 3a (2)). Le piastrine (CD36 + Ciao SSClow cellule) deve essere rimosso dalla popolazione NRC (Figura 3a (2)).
   3. Deselezionare gli eventi restanti, mantenendo solo le celle di NRC visibili, quindi esportare questa popolazione facendo clic ' File | Esportare ' e verificare che tutti i parametri necessari vengono controllati e salvare i dati come file di FCS.
   4. In un file Unito composto da tutti i file esportati di FCS, eseguire un controllo di qualità da valutare l'intensità di espressione di marcatori per ogni sottopopolazione, seguita dalla rimozione dei casi di fuori della 2SD curve (Vedi dettagli nella sezione risultati rappresentante) ( Figura 3 B).
   5. Nel file risultante con cellule "NRC" visibile, disegnare il percorso di maturazione del diagramma di APS (Figura 3C, sinistra) e Salva come un file di .cyt.
      Nota: Un confronto diagramma di maturazione permette la visualizzazione di tutti i parametri da tutti i file inclusi nel database NRC_NM rappresentati nel database normalizzato. Il diagramma presentato nella Figura 3C, lato destro, Mostra che tutti i file inclusi nel database NRC_NM (n = 14) montare in 2 SD rispetto con mediana del gruppo.
4. Valutazione di maturazione nei compartimenti mieloide BM utilizzando i database di maturazione
   1. Aprire il file di .cyt corrispondente al lignaggio di interesse (cioè., Neutrophils_NM_GMFF.cyt per lignaggio del neutrofilo, Monocytes_NM_GMFF.cyt per stirpe monocytic e NRCs_NM_GMFF.cyt per la stirpe degli eritrociti).
   2. Pulsante destro del mouse nella scheda 'Maturazione' sotto la scheda corrispondente alla stirpe di interesse (' neutrofili | Monocytic | NRC') e salvare il Database di maturazione a maturazione.
   3. Aprire un nuovo file di FCS ed eseguire l'analisi come spiegato in precedenza (passaggio 4.1.1–4.1.3 per i neutrofili, passo 4.2.1 per cellule Monocytic, e passaggio 4.3.1–4.3.2 per NRC).
   4. Disegnare il percorso di maturazione per la popolazione di interesse.
   5. Aprire il database corrispondente nella scheda 'Strumenti' (analisi del Database) e confrontare la popolazione per essere analizzati con il corrispondente Database di maturazione. Controllare i dati per la compatibilità con il database disponibile: completa compatibilità (triangolo verde); compatibilità parziale, nella maggior parte delle discrepanze di casi nel nome i parametri (triangolo giallo); e incompatibilità (triangolo rosso).
   6. Se i dati sono compatibili o parziale compatibili, il software crea il diagramma ' normalizzato le differenze di maturazione ' . Per visualizzare le ' parametro Band maturazione differenze ', apre un nuovo diagramma in 'Schema' scheda, fare clic su 'Maturazione' e scegliere quanti parametri venga visualizzata, fare clic su 'OK' e nel diagramma vengono visualizzati. Con fate clic destro nel diagramma; possono essere apportate modifiche nella visualizzazione dei dati, la visualizzazione di Database e la visualizzazione diagramma di maturazione.
   7. Per visualizzare il significato delle differenze tra il nuovo file e dati inclusi nel database, configurare uno zoom (tasto destro del mouse su ' normalizzato le differenze di maturazione ' e applicare 'Zoom').

Results

I 54 campioni di BM raccolti in K-EDTA anticoagulante sono stati inclusi nello studio. In assenza di tutte le informazioni sui pazienti sono stati analizzati i dati MFC. Studio retrospettivo hanno dimostrato che i campioni di BM erano 7 donatori sani (5 maschi e 2 femmine con un'età mediana di 47,4 [35-48], 11 individui senza prova di una malattia ematopoietica (8 maschi e 3 femmine con un'età mediana di 57,9 [35-72]) e 36 casi con varie condizioni patologiche: 1 caso con l'anemia e il l...

Discussion

La qualità dell'aspirato BM poteva avere un impatto sui risultati finali. L'emodiluizione dell'aspirato BM potrebbe distorcere la distribuzione delle cellule in diversi stadi di maturazione a causa dell'assenza dei progenitori o precursori cellule. Probabilmente che impiegano un metodo di lisi di massa può aiutare nella normalizzazione del BM aspira per hemodilution in analisi cytometric di flusso. Inoltre, i passaggi critici per la valutazione di displasia mieloide BM di citometria a flusso sono l'esempio di elaborazion...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCantometro a flusso II	BD Biosciences, CA, USA	SN:	V33896301336 3 laser, configurazione 4-2-2, Filtri e specchi dettagli: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuga	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Modello n.: 320002001	centrifughe a bassa velocità; capacità 60 provette FACS
Pipette da 10µ L e 200µ
Pasteur pipette
15 mL Provette Falcon provette
in polipropilene per FACS
Topo Anti-Umano HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Topo BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Topo anti-umano CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Topo BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Topo Anti-Umano CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Topo BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Topo Anti-Umano CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Topo BALB/c IgG1 Fluorocromo PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Topo Anti-Umano CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Topo BALB/c IgG2a, κ D12, fluorocromo APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Topo Anti-Umano CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Topo BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Topo anti-umano CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 IgG1 di topo, κ Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Topo anti-umano CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Topo BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Clone di topo anti-umano CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	UP-H2 Topo BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Topo anti-umano CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Topo BALB/c IgG2b, κ Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Topo anti-umano CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 IgG1 di topo, κ fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Topo anti-umano CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Topo BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Topo Anti-Umano CD33		345800	clone P67.6 Topo BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Topo anti-umano CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Topo BALB/c IgG2a, κ Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Soluzione di lisi 10x concentrato (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS& Perline T IVD	BD Biosciences, CA, USA	656046
PARTICELLE DI CALIBRAZIONE ARCOBALENO, 8 PICCHI	Cytognos, Salamanca, Spagna	SPH-RCP-30-5A	lotti EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Particelle di compensazione Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	rif. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Versioni software Diva 6.1.2 e 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Compresse saline tamponate con fosfato	R& D Systems, Minneapolis, USA	5564
Albumina sierica bovina ( BSA)	Sigma-Aldrich, Francia	A9647
Sodio azide 99%	Sigma-Aldrich, Francia	199931
Infinicyt versione software 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spagna