La diagnosi MDS è difficile in assenza di criteri morfologici o citogenetica non informativo. MFC potrebbe contribuire ad affinare il processo diagnostico MDS. Per diventare utile per la pratica clinica, l'analisi MFC deve basarsi su parametri con sufficiente sensibilità e specificità, e i dati devono essere riproducibili tra operatori diversi.
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Articolo metodologico
Citometria di flusso di database-Guida per la valutazione della maturazione delle cellule mieloidi del midollo osseo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un gruppo di lavoro avviato entro l'associazione di Cytometry francese (AFC) è stato sviluppato al fine di armonizzare l'applicazione della citometria a flusso multiparametrica (MFC) per la diagnosi di malattia mieloide in Francia. Il protocollo presentato qui è stato concordato e applicata tra settembre 2013 e novembre 2015 in sei laboratori diagnostici francesi (ospedali dell'Università di Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nizza e Lille e Institut Paoli-Calmettes in Marsiglia) e ha permesso la standardizzazione dell'acquisizione di dati e preparazione del campione del midollo osseo. Tre database di maturazione sono stati sviluppati per neutrofilo, monocytic e stirpi degli eritrociti con midollo osseo da individui "sani" donatore (individui senza alcuna prova di una malattia ematopoietica). Un metodo affidabile di analisi per ogni linea mieloide dovrebbe essere applicabile per uso diagnostico sistematico. Nuovi casi possono essere analizzati nello stesso modo e confrontati con i database di solito. Così, le anomalie fenotipiche quantitative e qualitative possono essere identificate e quelli sopra 2SD rispetto ai dati dei campioni di midollo osseo normale dovrebbe essere considerate indicative di patologia. La maggiore limitazione è la maggiore variabilità tra i dati ottenuti utilizzando gli anticorpi monoclonali ottenuti con i metodi basati su tecnologie di ibridoma e attualmente utilizzati nella diagnosi clinica. L'impostazione di criteri per la validazione tecnica dei dati acquisiti possono contribuire a migliorare l'utilità di MFC per la diagnostica MDS. La definizione di questi criteri richiede analisi in un database. La riduzione della soggettività investigatore nell'analisi dei dati è un importante vantaggio di questo metodo.
Introduzione
In assenza di marcatori fenotipici specifici per i cambiamenti dysplastic che si verificano nelle cellule mieloidi durante MDS iniziazione e progressione, un nuovo approccio è stato proposto negli ultimi anni sulla base della valutazione delle vie di maturazione (alterata espressione di gli antigeni mieloidi durante la produzione di cellule mieloidi mature) o della distribuzione anomala di tipi differenti delle cellule all'interno del midollo osseo (BM) delle cellule scomparti1,2.
Questo articolo presenta un metodo nuovo per applicazione standardizzata di MFC al fine di rilevare i c....
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Protocollo
Il protocollo elencato di seguito è stato approvato dal "Comité de Protection des Personnes" (comitato etico indipendente) 1 Sud-Est da Università ospedale di Saint-Etienne, Francia.
1. citometro impostazioni
Nota: Le impostazioni del citometro sono state eseguite conformemente alle raccomandazioni di flusso di Francia, secondo la procedura di EuroFlow "EuroFlow Standard operativo protocollo (SOP) per la messa in funzione e compensazione (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
- Mensile setup dello strumento
- Accendere il citometro. Assicurarsi che tutti i livelli del fl....
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Risultati
I 54 campioni di BM raccolti in K-EDTA anticoagulante sono stati inclusi nello studio. In assenza di tutte le informazioni sui pazienti sono stati analizzati i dati MFC. Studio retrospettivo hanno dimostrato che i campioni di BM erano 7 donatori sani (5 maschi e 2 femmine con un'età mediana di 47,4 [35-48], 11 individui senza prova di una malattia ematopoietica (8 maschi e 3 femmine con un'età mediana di 57,9 [35-72]) e 36 casi con varie condizioni patologiche: 1 caso con l'anemia e il l.......
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Discussione
La qualità dell'aspirato BM poteva avere un impatto sui risultati finali. L'emodiluizione dell'aspirato BM potrebbe distorcere la distribuzione delle cellule in diversi stadi di maturazione a causa dell'assenza dei progenitori o precursori cellule. Probabilmente che impiegano un metodo di lisi di massa può aiutare nella normalizzazione del BM aspira per hemodilution in analisi cytometric di flusso. Inoltre, i passaggi critici per la valutazione di displasia mieloide BM di citometria a flusso sono l'esempio di elaborazion.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari. Il dipartimento di citometria a flusso, il laboratorio di Ematologia presso l'ospedale universitario di Saint-Etienne è un membro del Consorzio EuroFlow.
Ringraziamenti
Gli anticorpi utilizzati in questo studio sono stati forniti da BD Biosciences. Gli autori vorrei ringraziare loro collega, Dr. Pascale Flandrin-Gresta, dal dipartimento di biologia molecolare, laboratorio di ematologia, Università ospedale di Saint-Etienne, Francia, che hanno fornito le competenze per l'interpretazione di dati NGS per la seconda Caso MDS. Gli autori sono grati per gli ematologi clinico per il loro interesse e la partecipazione a questo studio e per i pazienti e donatori sani per il loro accordo partecipare a questo studio. Gli autori inoltre ringraziare la Fondazione di "Les Amis de Rémi" per il sostegno finanziario per la pubblicazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BD FACSCantometro a flusso II | BD Biosciences, CA, USA | SN: | V33896301336 3 laser, configurazione 4-2-2, Filtri e specchi dettagli: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuga | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Modello n.: 320002001 | centrifughe a bassa velocità; capacità 60 provette FACS |
| Pipette da 10µ L e 200µ | |||
| Pasteur pipette | |||
| 15 mL Provette Falcon provette | |||
| in polipropilene per FACS | |||
| Topo Anti-Umano HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Topo BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Topo anti-umano CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Topo BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Topo Anti-Umano CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Topo BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Topo Anti-Umano CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Topo BALB/c IgG1 Fluorocromo PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Topo Anti-Umano CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Topo BALB/c IgG2a, κ D12, fluorocromo APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Topo Anti-Umano CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Topo BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Topo anti-umano CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 IgG1 di topo, κ Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Topo anti-umano CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Topo BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Clone di topo anti-umano CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | UP-H2 Topo BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Topo anti-umano CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Topo BALB/c IgG2b, κ Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Topo anti-umano CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 IgG1 di topo, κ fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Topo anti-umano CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Topo BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Topo Anti-Umano CD33 | 345800 | clone P67.6 Topo BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) | |
| Topo anti-umano CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Topo BALB/c IgG2a, κ Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Soluzione di lisi 10x concentrato (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS& Perline T IVD | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| PARTICELLE DI CALIBRAZIONE ARCOBALENO, 8 PICCHI | Cytognos, Salamanca, Spagna | SPH-RCP-30-5A | lotti EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Particelle di compensazione Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | rif. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Versioni software Diva 6.1.2 e 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Compresse saline tamponate con fosfato | R& D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Albumina sierica bovina ( BSA) | Sigma-Aldrich, Francia | A9647 | |
| Sodio azide 99% | Sigma-Aldrich, Francia | 199931 | |
| Infinicyt versione software 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spagna |
Riferimenti
- Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
- Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow....
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Ristampe e permessi
