ROS intracellulari è stato indicato per svolgere un ruolo importante nell'induzione della senescenza cellulare. Qui, descriviamo un test sensibile per quantificare i livelli di ROS durante la senescenza cellulare. Forniamo anche i protocolli per la valutazione del fenotipo secretivo senescenza-collegata, che secondo come riferito contribuisce a varie disfunzioni relative all'età.
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Articolo metodologico
Una misura quantitativa di specie reattive dell'ossigeno e senescenza-collegata di fenotipo secretivo in fibroblasti umani normali durante la senescenza indotta da Oncogene
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La senescenza cellulare è stata considerata uno stato di arresto di crescita irreversibile salvo esaurimento della capacità proliferativa o l'esposizione a varie sollecitazioni. Studi recenti hanno esteso il ruolo della senescenza cellulare ai vari processi fisiologici, tra cui lo sviluppo, la guarigione della ferita, sorveglianza immune e disfunzione del tessuto senile. Anche se l'arresto del ciclo cellulare è una caratteristica fondamentale della senescenza cellulare, una produzione di ossigeno reattivo intracellulare aumentato specie (ROS) è stata dimostrata anche a giocare un ruolo importante nell'induzione della senescenza cellulare. Inoltre, studi recenti hanno rivelato che le cellule senescenti esibiscono le attività paracrina potente sulle vicine cellule e tessuti attraverso un fenotipo secretivo senescenza-collegata (SASP). Il forte aumento di interesse per quanto riguarda le strategie terapeutiche contro la senescenza cellulare dà risalto all'esigenza di una precisa comprensione dei meccanismi di senescenza, compreso ROS intracellulari e la SASP. Qui, descriviamo protocolli per valutare quantitativamente i livelli intracellulari di ROS durante la senescenza cellulare indotta da H-Ras usando la tintura fluorescente ROS sensibile e citometria a flusso. Inoltre, vi presentiamo le tecniche sensibili per l'analisi dell'induzione dell'espressione del mRNA e la secrezione di fattori SASP. Questi protocolli possono essere applicati a vari modelli di senescenza cellulare.
Introduzione
Più di 50 anni fa, Hayflick e Moorhead ha rivelato che le cellule normali immettere arresto di crescita irreversibile salvo l'esaurimento della loro potenziale proliferativo dopo un certo numero di divisioni cellulari1. Questo fenomeno è ora conosciuto come senescenza replicativa e si crede per correlare fortemente con invecchiamento organismal2. Anche se la progressiva erosione dei telomeri è considerata delle principali cause di senescenza replicativa, vari sforzi cellulari, come il danno del DNA, l'attivazione oncogenica e stress ossidativo, sono stati segnalati per indurre un altro tipo di senescenza cellulare chiama....
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Protocollo
1. induzione della senescenza indotta da Oncogene
-
Preparare un H-RasV12 retrovirus
- Cappotto piastra di coltura di 100 mm con l'aggiunta di 2 mL di 0,001% poly-L-lisina/fosfato tampone salino (PBS) per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di poli-L-lisina usando una pipetta di vetro collegata ad un vuoto e lavare la piastra di coltura con l'aggiunta di 2 mL di 1X PBS.
- Piastra 3 x 106 ecotropic BOSC-23 imballaggio cellule sulla cultura rivestito piatto con di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina e li della co....
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Risultati
Nella Figura 1è riportato un esempio di H-Ras-indotta senescenza. Un'infezione di fibroblasti umani normali WI-38 con il retrovirus di H-RasV12 indotto da drammatici cambiamenti morfologici (Figura 1B). Inoltre, come illustrato nella Figura 1, attività di colorazione β-gallone SA è stata aumentata notevolmente sull'espressione di H-RasV12. Oltre il 70% delle cellule ha mostrato SA β-gallone macchiatu.......
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Discussione
Qui, abbiamo presentato metodi per il monitoraggio dei livelli intracellulari di ROS durante H-Ras-indotta senescenza in fibroblasti umani normali WI-38. I livelli intracellulari di ROS in cellule vive, che possono essere misurati quantitativamente utilizzando il reagente cellula-permeabile DCF-DA e citometria a flusso. Al momento l'assorbimento cellulare, DCF-DA è viene desacetilato agli acidi dalle esterasi intracellulari e, successivamente, ossidato dai ROS per formare altamente fluorescente 2', 7'-diclorofluorescina .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione ricerca nazionale di Corea (2015R1D1A1A01060839) (a Young Yeon Kim) e da una sovvenzione del National Research Foundation di Corea (NRF) finanziata dal governo di Corea (MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, no. 2016R1A5A2007009) (a Jeanho Yun).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTI | |||
| poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillina/streptomicina | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polibrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/mL |
| puromicina | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/mL |
| formaldeide | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil β D-galattopiranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| ferrocianuro di potassio | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| ferricianuro di potassio | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| tripsina-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Trascrittasi inversa | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2x mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Acqua distillata ultrapura | Invitrogen | 10977015 | |
| Saggio ELISA IL-6 umano | PeproTech | #900-TM16 | |
| Saggio ELISA IL-8 umano | PeproTech | #900_TM18< | |
| strong>EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μ m filtro per siringhe | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | Microscopio PM-996 | |
| Citometro a flusso NIKON | TS100 | ||
| BD Bioscience | LSR Fortessa | ||
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| spettrofotometro NanoDrop | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Sistema PCR in tempo reale | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Lettore | Molecular Devices | Lettore |
Riferimenti
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Braig, M., et al.<....
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Ristampe e permessi
