Articolo metodologico

Contrasto-Matching detergente in esperimenti di Scattering di neutroni Small-Angle per Ab Initio modellazione e analisi strutturale di proteine di membrana

DOI:

10.3791/57901

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21 ottobre 2018

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1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo viene illustrato come ottenere un modello a bassa risoluzione ab-initio e dettagli strutturali di una proteina di membrana detergente-solubilizzato in soluzione mediante scattering di neutroni piccolo angolo con contrasto-corrispondenza del detergente.

Abstract

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Lo strumento di dispersione biologica ad angolo piccolo neutrone al High-Flux isotopo reattore di Oak Ridge National Laboratory è dedicato allo studio di materiali biologici, biocarburanti lavorazione e materiali bio-ispirato che coprono nanometro a scale di lunghezza di micrometro. I metodi presentati qui per indagare le proprietà fisiche (cioè, dimensioni e forma) delle proteine di membrana (qui, MmIAP, del intramembrane aspartil proteasi da Methanoculleus marisnigri) in soluzioni di formazione di micelle sono detergenti particolarmente adatto per questo strumento di scattering ad angolo piccolo neutrone, tra gli altri. Altre tecniche di caratterizzazione biofisica sono ostacolati dalla loro incapacità di affrontare i contributi detersivi in una struttura di complesso proteina-detergente. Accesso al laboratorio di Bio-Deuteration fornisce inoltre funzionalità uniche per la preparazione di coltivazioni su larga scala e che esprimono le proteine deuterio-etichettati per una maggiore dispersione del segnale dalla proteina. Mentre questa tecnica non fornisce dettagli strutturali in alta risoluzione, il divario di conoscenza strutturale per le proteine di membrana contiene molte zone indirizzabile di ricerca senza risoluzione vicino-atomica. Ad esempio, queste aree includono la determinazione degli Stati oligomerici, formazione complessa, cambiamenti conformazionali durante perturbazione ed eventi di chiusura/apertura. Queste indagini possono essere facilmente realizzate attraverso applicazioni di questo metodo.

Introduzione

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Proteine di membrana sono codificati di circa il 30% di tutti i geni1 e rappresentano una forte maggioranza di bersagli per farmaci medicinali moderni. 2 queste proteine svolgono una vasta gamma di funzioni cellulari vitali,3 ma nonostante la loro abbondanza e importanza — rappresentano solo circa l'1% del totale strutture depositato nel Research Collaboratory per bioinformatica strutturale (RCSB) proteina Banca dati. 4 a causa della loro natura parzialmente idrofobo, determinazione strutturale delle proteine di membrana-limita è stato estremamente impegnativo. 5 , 6 , 7

Come molte tecniche biofisiche richiedono particelle monodisperse in soluzione per la misurazione, isolando le proteine di membrana dalle membrane native e queste proteine in un mimic solubile delle membrane native di stabilizzazione è stato un'area attiva di ricerca negli ultimi decenni. 8 , 9 , 10 queste indagini hanno portato allo sviluppo di molti romanzo anfifilici assembly per solubilizzare le proteine di membrana, come nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 e amphipols. 16 , 17 tuttavia, l'uso di detergenti micelle rimane uno degli approcci più comuni e semplici per soddisfare le esigenze di solubilità di una data proteina. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 purtroppo, nessun singolo detersivo o la magica miscela di detergenti attualmente esiste che soddisfa tutte le proteine di membrana; così, queste condizioni devono essere schermate empiricamente per le esigenze specifiche di ogni proteina. 26 , 27

Detergenti, auto-assemblarsi in soluzione sopra loro concentrazione micellare critica per formare le strutture aggregati chiamate micelle. Micelle sono composte di molti monomeri detergente (in genere che vanno da 20-200) con catene idrofobiche alchiliche formando un nucleo di micelle e gruppi testa idrofiliche disposti in uno strato di guscio micella affrontando il solvente acquoso. Il comportamento di detergenti e formazione di micelle è stato classicamente descritto da Charles Tanford in The effetto idrofobico,28 e dimensioni e forme delle micelle dai detergenti comunemente utilizzati negli studi di proteine di membrana sono stati caratterizzata mediante scattering ad angolo piccolo. 29 , 30 organizzazione detersivo sulle proteine di membrana è stato anche studiato, e la formazione di complessi proteina-detergente (PDC) è previsto con detergente molecole circostanti la proteina in un arrangiamento che ricorda il detergente pulito micelle. 31

Uno ha aggiunto vantaggio nell'utilizzo di detergenti è che le proprietà di micella risultante possono essere manipolate incorporando altri detergenti. Molti detergenti per mostre di miscelazione ideale, e selezionare proprietà delle micelle miste possono anche essere prevedute dal componenti e rapporto di miscelazione. 22 tuttavia, la presenza di detersivo può ancora presentare sfide per caratterizzazioni biofisiche contribuendo al segnale complessivo. Ad esempio, con tecniche di dispersione della luce e raggi x, segnale da detersivo in PDC è praticamente indistinguibile dalla proteina. 32 le indagini con singola particella cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM) in genere si basano su particelle intrappolate (congelate); dettagli strutturali della proteina sono ancora oscurati da taluni detersivi o un'alta concentrazione di detersivo che aggiunge allo sfondo. 33 approcci alternativi verso interpretando la completa struttura PDC (compreso il detersivo) sono state fatte attraverso metodi computazionali che cercano di ricostruire il detersivo intorno una proteina di membrana determinato. 34

Per il caso di scattering di neutroni, la disposizione di nucleo-guscio di detersivo nella micella produce un fattore di forma che contribuisce alla dispersione osservata. Fortunatamente, i componenti della soluzione possono essere alterati tale che non contribuiscono alla dispersione osservata netta. Questo processo di "contrasto di corrispondenza" si ottiene sostituendo deuterio per l'idrogeno ottenere una densità di lunghezza di dispersione che corrisponde a quello dello sfondo (buffer). Deve essere considerate una scelta giudiziosa di detergente (con controparti deuterati disponibile) e il loro rapporto di miscelazione. Per detergente micelle, questa sostituzione può essere eseguita usando un detersivo con lo stesso gruppo di testa ma avendo una catena alchilica deuterato (d-coda invece di h-coda). Dato che i detergenti sono ben miscelati,35 loro aggregati avrà una densità di lunghezza di dispersione è la frazione molare ponderata medio dei due componenti (h-code e d-code). Quando questo contrasto medio è coerenza con quella del gruppo di testa, le strutture di aggregazione uniforme possono essere abbinate completamente per rimuovere tutti i contributi alla dispersione osservata.

Presentiamo qui un protocollo per manipolare il contrasto di neutroni di micelle detergente incorporando molecole chimicamente identici detersivi con catene alchiliche deuterio-etichettati. 19 , 36 , 37 ciò consente il completo contrasto simultaneo di corrispondenza della micella core e shell, che è una capacità unica di scattering di neutroni. 35 , 38 con questo significativamente raffinato livello di dettaglio, contrasto di corrispondenza può attivare studi altrimenti irrealizzabile di strutture di proteine di membrana. Inoltre, questo approccio di contrasto di corrispondenza potrebbe essere esteso ad altri sistemi che coinvolgono detergente, come polimero cambio reazioni39 e olio-acqua disperdenti,40 o anche altri agenti solubilizzanti, quali bicelles,41 nanodiscs,42 o blocco di copolimeri. 43 A approccio simile come delineato in questo manoscritto, ma impiegando una singola specie di detersivo con sostituzioni di deuterio parziale sul gruppo alchilico catena e/o di testa, è stato recentemente pubblicato. 37 mentre questo può essere previsto per migliorare la distribuzione casuale di idrogeno e deuterio in tutto il detersivo rispetto all'approccio qui presentato, il numero limitato di posti disponibili sul detersivo per sostituzione e in due fasi detergente sintesi necessari pone ulteriori sfide per l'esame.

I passaggi 1 e 2 del protocollo descritto di seguito spesso si sovrappongono poiché esperimento iniziale pianificazione deve essere fatto per presentare una proposta di qualità. Tuttavia, la presentazione delle proposte è considerato qui come il primo passo per sottolineare che questo processo deve essere iniziato in anticipo un esperimento di neutroni. Si noti inoltre che un passaggio dei prerequisiti, che dovrebbe essere dimostrato dalla proposta, è di avere la caratterizzazione biochimica e fisica (tra cui purezza e stabilità) del campione sostiene la necessità per gli studi di neutroni. Una discussione generale di small-angle neutron scattering (SANS) è oltre la portata di questo articolo. Un'introduzione breve ma completa è disponibile nella Caratterizzazione di materiali da Kaufmann,44 e una soluzione completa di libro concentrata sul biologica small-angle scattering è stata recentemente pubblicata l'opera di riferimento. 45 ulteriori letture consigliate sono riportate nella sezione discussione. Scattering di piccolo angolo utilizza il così chiamato vettore di dispersione Q come la quantità centrale che descrive il processo di dispersione. In questo articolo utilizza la definizione ampiamente accettata Q = 4 π sin (θ) / λ, dove θ è la metà dell'angolo tra fascio in ingresso e sparso e λ è la lunghezza d'onda della radiazione neutronica in Angstrom. Esistono altre definizioni che uso diverso simboli come di ' per il vettore di dispersione e che possono variare di un fattore 2 π o utilizzando nanometri al posto di Angstrom (Vedi anche la discussione di Figura 10).

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Protocollo

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1. preparare e presentare una proposta di strumento e tempo fascio di neutroni Facility

  1. Consultare le risorse online per l'identificazione di strutture di scattering di neutroni che forniscono l'accesso di utente generale neutroni fascio tempo, come ad esempio Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mappa di neutroni strutture e informazioni sulla ricerca di neutroni in tutto il mondo è disponibile online. 46 essere consapevoli del fatto che queste strutture sono in genere regolari inviti a presentare proposte; Questo determina quando sarà disponibile la prossima volta di larghezza. Neutroni sono utilizzati per una varietà di applicazioni; ricerca di strumenti per lo scattering (SANS) small-angle neutroni, particolarmente quelli con capacità per campioni biologici.
  2. Utilizzare risorse fornite dalle strutture neutroni per navigare il processo di invio proposta di neutroni fascio tempo. Consultare con un Neutron Scattering scienziato (NSS) che è associato con lo strumento per il quale si applica. Scrivi una recensione su informazioni aggiornate della struttura neutroni per quanto riguarda la proposta chiamate, scadenze e consigli per la presentazione; Oak Ridge è disponibile online. 47 inviare la proposta di tempo trave seguendo tutte le linee guida per una presentazione di successo.
  3. Se deuterata proteina è richiesto (Vedi 2.2), strutture di scattering di neutroni sono spesso supportati da laboratori e competenze dedicate alla produzione di materiali deuterati. Per richiedere l'accesso per il laboratorio di Bio-Deuteration (BDL) a ORNL, selezionare il BDL come il secondo strumento nel sistema proposta. Mentre la proposta di SANS è esaminata per fattibilità e da un comitato di revisione scientifica, BDL richieste vengono proiettate solo per fattibilità. Per aiutare con la recensione di fattibilità BDL, presentare una di modulo di richiesta di informazioni completate48 che descrive il protocollo di espressione della proteina e la resa calcolata (disponibile online).
  4. Dopo successo inter pares della proposta di tempo della trave, confermare la data premiata del tempo di fascio in anticipo l'esperimento. Assicurarsi che tutti i dettagli del campione e buffer e le formule sono elencate correttamente nella proposta di revisione corretta. Eventuali modifiche per il piano sperimentale proposto, compreso i cambiamenti nella composizione del campione e buffer, richiedono la notifica dell'impianto.
    Nota: Modifiche dovrebbero essere discusso più presto con il NSS assegnato.

2. determinare il neutrone contrasto Match Point e il contrasto necessario per la misurazione della proteina

  1. Raccogliere informazioni (da informazioni di prodotto del fornitore, database online, valori pubblicati, ecc.) relative alle composizioni atomici e volumi per i componenti di sistema detergente da abbinare a contrasto. Queste informazioni vengono utilizzate per determinare la densità di lunghezza lo scattering di neutroni (SLD) e così contrasto match point (CMPs) in soluzione, che è importante per ottenere qualità SANS informazioni dati e strutturali per la proteina di membrana di interesse nel contesto di un PDC. Una tabella che riassume i punti di corrispondenza proprietà e contrasto fisici per detergenti comunemente utilizzati negli studi di biofisici delle proteine di membrana è incluso (tabella 1).
  2. Determinare il neutrone domini utilizzando l'applicazione web pacciame: moduli di analisi di contrasto variazione dati49 (disponibile online50 free-of-charge). Un link al manuale dell'utente si trova nella home page. Accedere al sito Web e leggere la documentazione di accompagnamento. Figura 1 e Figura 2 forniscono una panoramica di contrasto modulo input e output per due esempi correlati.
    Nota: Altri siti Web per il calcolo di domini sono disponibili, come quello effettuato dal National Institute of Standards and Technology (NIST) Center per la ricerca di neutroni. 51
    1. Aprire il modulo di contrasto cliccando 'Contrasto' si trova nel riquadro di navigazione a sinistra. Fornire il testo per un titolo del progetto e inserire i dati qui sotto per due componenti (ad es., detergente gruppo testa e coda) come ' subunità 1' e ' subunità 2'.
    2. Immettere la formula molecolare per ogni componente nella casella di testo 'Formula'.
      Nota: il pulsante di opzione sto ' deve essere selezionata sotto 'Sostanza tipo' per immettere una formula molecolare. Inoltre, è possibile utilizzare la lettera 'X' nella formula per indicare gli atomi di idrogeno facilmente intercambiabili. Sequenze di DNA, RNA o proteine possono essere inseriti se la corrispondente 'P', 'R', o aveva ' pulsanti di opzione sono selezionati. In presenza di più copie di un componente nella subunità, il valore per 'Nmolecules' può essere modificato di conseguenza. Qui un esempio pratico riguarda lipido-come detersivi contenenti due code identiche, consentendo la formula per una coda essere inseriti con Nmolecules uguale a 2.
    3. Immettere il volume in cubi Angstrom per ogni componente nella casella sotto 'Volume (Å3)'. Utilizzare la formula di Tanford28 per catene alchiliche di lunghezza n, Vcoda = 27,4 + n * 26,9, per calcolare il volume approssimativo della coda, o ottenere volumi molecolari da informazioni sul prodotto fornito o pubblicati i valori in la letteratura.
    4. Immettere dettagli per componenti di buffer. Cambiare il 'numero dissolto specie nel solvente' utilizzando il menu a discesa per aggiungere o rimuovere righe per ogni componente del buffer. Nel caso di formazione di micelle detergenti, includere i monomeri di detersivo gratuiti come componenti del buffer separato a concentrazione di detergente micellare critica (CMC).
    5. Fare clic su 'Submit' per eseguire i calcoli di contrasto del neutrone e generare una pagina di risultati che fornisce una tabella di dispersione lunghezza densità e contrasto match point, nonché formule per determinare questi parametri in qualsiasi percentuale determinata di D2O in il buffer. Rivedere i parametri di scattering con particolare attenzione per la componente CMPs. Se i punti di incontro sono simili (nel raggio di 10% D2O) e la concentrazione libera micella è bassa, quindi la media CMP può essere utilizzato per la corrispondenza di contrasto i contributi di detersivo. Nella maggior parte dei casi, la CMP del detergente gruppo testa e della coda sarà diverso da più di 10-15%, producendo un fattore di forma di core-shell nei dati SANS che offusca la raccolta diretta del segnale dispersione dalla proteina da solo.
  3. Valutare il contrasto tra detergente gruppo testa e coda. Quando il detergente testa gruppo alchilico catena coda e CMPs non sono ben assortiti, la disponibilità e l'incorporazione di un detergente deuterio-sostituiti può consentire di scattering la densità di lunghezza di selezionare i componenti per essere manipolato. Nella maggior parte dei casi, ciò richiederà formando una micella mista attraverso l'incorporazione di un detergente identico con le catene alchiliche deuterio-sostituiti. L'aggiunta di deuterio genera la densità di lunghezza di dispersione del nucleo formato dalle code di catena alchilica. L'endpoint desiderato, in questo caso, è tale che la testa del gruppo shell CMP e alchil catena core CMP hanno valori approssimativamente uguali.
    1. Sollevare il CMP del core micellare detergente per essere approssimativamente uguali ai CMP del guscio testa gruppo determinando il rapporto di miscelazione tra h-code e d-code che raggiunge completo contrasto di corrispondenza con i gruppi di testa appropriato. Un prerequisito per questa determinazione è conoscenza della CMP per una coda di catena alchilica deuterio-sostituiti. Una controparte reperibile a n-dodecil β-D-maltoside (DDM) è disponibile con tutti i idrogeno di catena alchilica sostituito dal deuterio (d25-DDM). Ripetere i calcoli di contrasto indicati nel passaggio 2.1 per una coda aveva ' al posto di 'h-coda'.
    2. Calcolare il rapporto di mole di h-coda a d-coda necessaria per l'abbinamento a contrasto con il gruppo di testa CMP. La seguente formula può aiutare con questa determinazione:
      CMPtesta = CMPh-coda * χh-tail + CMPd-coda * χd-coda
      dove CMP è la densità di lunghezza di dispersione e χ è la frazione di volume per il componente di testina detergente, h-coda, o d-coda. Per le soluzioni tampone di DDM, incorporazione del 44% in peso (43% da talpa) del totale detergente come d25-DDM con catene alchiliche deuterio-sostituiti produce un singolo CMP a 48,5% D2O per i componenti sia di testa e di coda.
  4. Considerare il grado di sostituzione deuterio per la proteina di membrana. Per misurare il segnale sufficiente scattering dalla proteina, la CMP per la proteina deve essere almeno 15% D2O in soluzione lontano il detersivo CMP e condizioni di misura. Il segnale aumenta con il quadrato di questa differenza di %. Dal momento che il CMP di una proteina senza etichetta, in genere, si verifica con ~ 42% D2O in soluzione (un CMP simile a molti gruppi testa detergente), deuterio etichettatura della proteina è quasi sempre una necessità. 52

3. esprimere e purificare la proteina di membrana di interesse

  1. Preparare il supporto di LB (brodo di Lisogenesi) e crescere Escherichia coli (e. coli) le cellule che harboring un vettore di espressione inducibile di sequenza della proteina bersaglio.
    1. Preparare il supporto minimo. In H2O o D2O fare sciogliere così 7,0 g/L (NH4)24, 5,25 g/L Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, 0,50 g/L diammonio idrogeno citrato, glicerolo 5,0 g/L, 1,0 mL/L del 20% w/v MgSO 4·7H2O e 1,0 mL/L di Holme oligometalli (0,50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 g/L CoCl2, 0,102 g/L CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 Co.GE MnSO4· H2O e 22,3 g/L Na2EDTA·2H2O 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Preparare soluzioni di riserva antibiotici appropriati utilizzando H2O o D2O.
    3. Preparare una soluzione stock di isopropile-β-D-1-thiogalactopyranoside con H2O o D2O.
    4. Sterile-filtro tutte le soluzioni in secca, contenitori sterili, utilizzando la parte superiore della bottiglia vuoto e siringa filtri con un diametro dei pori 0,22 micron.
  2. Adattare le cellule di e. coli su deuterio-etichettato medio prima di scalabilità per la sovraespressione di una proteina deuterata.
    1. Inoculare 3 mL di terreno LB con una colonia isolata da una piastra di agar Lisogenesi brodo (LB) o cellule da uno stock di glicerolo congelati. Crescere le cellule a 37 ° C in un incubatore d'agitazione a 250 giri/min o ridurre la temperatura a 30 ° C o inferiore per evitare la crescita eccessiva della cultura quando incubando durante la notte.
      Nota: La procedura di adattamento può essere variata. 55 , 56 , 57
    2. Una volta che la cultura LB è cresciuta fino a densità ottica a 600 nm (OD600) di ~ 1, diluirlo 01:20 in 3 mL di terreno minimo di H2O e crescere per un OD600 ~ 1. Ripetere il 01:20 diluizioni mediante medium minimo contenente 50, 75 e 100% D2O (o fino alla percentuale desiderata di2O D).
      Nota: come la D2O contenuto è aumentato, tassi di crescita diminuirà. Il rapporto tra la percentuale di2O D nella sostituzione crescita media e deuterio nella proteina è stato segnalato nella letteratura. 58 , 59 , 60
    3. Continuare a crescere la cultura in un bioreattore per aumentare il rendimento della massa cellulare deuterato (Figura 3).
      Nota: Procedure dettagliate per il funzionamento di bioreattori sono state esaminate altrove. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Raccolto e lisare cellule di Escherichia coli per la purificazione di estrazione e proteine di membrana
    1. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a ~ 6.000 x g per ~ 30-45 min a 4 ° C.
    2. Ammorbidire il pellet cellulare immergendo nel buffer sul ghiaccio per ~ 30 min. Poi, delicatamente e risospendere il pellet cellulare nel buffer pipettando delicatamente con una pipetta sierologica, o dolce dondolo su un agitatore meccanico 2D, a una concentrazione finale di g ~ 1 cella umida massa/10 mL di tampone.
      Nota: un buffer di esempio è di 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido), pH 7.5, 200 mM NaCl completati con una tavoletta di inibitore della proteasi.
    3. Lisare cellule sedimento con tre passa attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione a 10.000 psi mentre il raffreddamento il deflusso.
      Nota: A seconda della scala necessaria, altri metodi di Lisi possono essere usato (per esempio, dalla stampa francese o sonicazione).
    4. Detriti cellulari pellet mediante centrifugazione a ~ 4.000-5.000 x g per 15 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio fino a quando il surnatante è chiarito.
    5. Ultracentrifuga (~ 150.000 x g per 30-45 min) il surnatante dal passaggio precedente, che contiene la sostanza solubile e frazioni della membrana. Il pellet dopo ultracentrifugazione contiene la frazione di membrana.
    6. Risospendere il pellet di membrana in un omogeneizzatore lisata grande e isolare la frazione di membrana nuovamente dall'ultracentrifugazione (passo 3.3.5). Ripetere questa operazione almeno una volta per rimuovere proteine vagamente associati.
    7. Solubilizzare le membrane di dondolio per ~ 30 min a 4 ° C in un tampone contenente detergente adatto per purificazione. Solubilizzazione è evidente quando la sospensione si trasforma da nuvoloso a trasparente. Rimuovere il materiale insolubile di ultracentrifugazione (~ 150.000 x g per 30-45 min).
      Nota: Un buffer di esempio è 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazolo di 20 mM e 4% (p/v) DDM per purificazione di cromatografia di affinità di Ni2 + .
  4. Purificare la proteina seguendo un protocollo precedentemente sviluppato per forme protonata.
    Nota: Vedi Naing et per un protocollo di purificazione di esempio per un hexahistidine etichetta M. marisnigri JR1 intramembrana aspartil proteasi (d-MmIAP). 65 la resa finale era ~ 1 mg di deuterated dalla crescita della coltura cellulare 5L deuterated, ognuno dei quali è stato utilizzato nell'esperimento SANS (Figura 4).
  5. Scambiare la proteina purificata nel "Buffer di scambio finale" per la corrispondenza di contrasto.
    1. Preparare 200 mL di "Buffer di scambio finale" contenente la miscela corretta per contrasto corrispondenti, ad esempio,20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl e lo 0,05% totale DDM (0,028% DDM e 0,022% d25-DDM) in 49% D2O.
    2. Equilibrare una colonna di esclusione di dimensione con > 2 volumi di colonna (CV) di "Buffer di scambio finale" in 3.5.1 utilizzando un sistema veloce proteina liquida cromatografia (FPLC).
    3. Dopo l'iniezione del campione, è necessario eseguire la colonna e isolare frazioni corrispondenti alla proteina di interesse.
    4. Concentrare la proteina fino alla concentrazione finale desiderata (2-5 mg/mL).
      Nota: Un volume di ~ 300 μL è necessaria per riempire una cuvette in quarzo cilindrica 1 mm utilizzata per SANS.
    5. Riservare un'aliquota di tampone abbinati per SANS sottrazione di sfondo.
      Nota: L'aliquota può essere assunto direttamente dal buffer preparati, o idealmente da una frazione di eluizione pulito alla fine della corsa FPLC.

4. fare preparativi finali per il fascio tempo e raccolgono SANS dati

  1. Dopo la proposta è stata accettata e accesso al sito è stato approvato, completare tutte le necessarie formazione in anticipo fascio assegnato. Questo include prearrival, formazione e laboratorio radiologico, in loco e la formazione di specifici dello strumento basato sul web.
    Nota: Requisiti di formazione possono dettare arrivo anticipato per i nuovi utenti. Ulteriori informazioni sono disponibili online. 66
  2. Caricare i campioni e buffer per la raccolta dati.
    Nota: Una panoramica della dispersione biologica ad angolo piccolo neutrone (Bio-SANS) area ambiente di strumento campione è illustrato nella Figura 5.
    1. Caricare i campioni e i buffer in celle in quarzo. Celle in quarzo sono disponibili dal scienziato strumento o struttura. Utilizzare gel-caricamento suggerimenti per accedere la stretta apertura della maggior parte delle cellule del campione.
    2. Assicurarsi che il pulsante di scatto del fascio è chiuso, quindi avvicinarsi alla zona di ambiente campione e posizionare le celle di quarzo nell'autocampionatore. Registrare la posizione del selettore di campione per ogni cella del campione.
    3. Controllare l'area e verificare che il percorso del fascio sia privo di ostacoli, quindi lasciare l'area di ambiente campione e aprire l'otturatore di fascio.
      Nota: Attentamente seguire tutte le norme e regolamenti, obbedire a tutte le registrazioni e ascoltare i consigli dello scienziato dello strumento. Campioni non possono essere rimosso dal fascio e manipolati dopo l'esposizione al fascio senza precauzioni speciali seguenti. Consultare con un tecnico di controllo radiologico (RCT) prima di queste procedure.
  3. Eseguire la scansione di tabella per la raccolta automatizzata dei dati
    1. Usare lo strumento attraverso il controllo personalizzato software basato su LabVIEW, spettrometro strumento controllo ambiente (SpICE). Seguire le istruzioni per il funzionamento di uno strumento fornito dallo scienziato di Scattering di neutroni. Una panoramica di tabella scansione operazione windows è fornita nella Figura 6.
    2. Dopo aver inserito le informazioni richieste nelle aree appropriate, eseguire la scansione della tabella e inizierà un processo di raccolta dati automatizzata. Monitorare i progressi attraverso la scheda 'Table Scan Status'.

5. ridurre SANS dati da immagini 2D a trama 1D

  1. Identificare ogni file di dati di esempio e buffer dai numeri registrati scansione. Ogni misurazione verrà assegnato un numero di scansione unica. Questa informazione è utile durante la riduzione di dati per identificare ciascun campione corrispondente e la coppia di buffer.
  2. Utilizzare MantidPlot software e script Python per la riduzione
    1. Gli utenti di Scattering di neutroni sono forniti con dettagli dell'account per accedere ai propri dati su analisi Cluster remoto. 67 il login per il Cluster di analisi remoto ed eseguire "MantidPlot" dalla riga di comando. Figura 7 e Figura 8 vengono fornite come supporto alla seguente procedura.
    2. Ottenere uno Script di riduzione utente dallo scienziato di Scattering di neutroni (solitamente questo accadrà durante l'esperimento); Questo script è basato su Python e conterrà tutti i valori di calibrazione e regolazioni di scala per ridurre l'immagine di dispersione 2D in un terreno di 1D di intensità sparse in funzione dell'angolo di scattering, I(Q).
    3. Aprire lo Script di riduzione utente fornito in MantidPlot e inserire i corrispondenti numeri di scansione o identificazione per le coppie del campione e buffer nell'elenco appropriato.
    4. Eseguire lo script per generare dati ridotto come un file di testo di quattro colonne (ordine delle colonne è Q, I(Q), I(Q) errore, errore di Q) nel percorso specificato. L'area di lavoro appropriata in MantidPlot fare clic destro e selezionare "Grafico con errori..." per un primo esame dei profili di scattering.

6. analizzare i dati per i parametri strutturali della particella Scattering

  1. Trasferire il file di dati ridotto da analysis server in un computer locale utilizzando il trasferimento di file FTP sicuro. Questa operazione può essere eseguita con l'uso di software come FileZilla o CyberDuck. Ulteriori istruzioni e dettagli per il collegamento al file system del server di analisi sono disponibili sulla pagina di login analysis.sns.gov.
  2. Scarica il ATSAS software suite65,68 (tutta la suite ATSAS). 69 programmi individuali70 sono disponibili anche online per analizzare i dati SANS, vale a dire determinare parametri strutturali e modelli di ab-initio .
    Nota: Molte opzioni sono disponibili per SANS analisi dei dati di biomacromolecole. 45
  3. Utilizzare PRIMUS71 per la traccia dati, ridimensionamento e sottrazione e Guinier analisi di buffer.
    1. Lanciare il ATSAS 'Analisi dei dati SAS' applicazione e carico dati ridotto file corrispondente alla coppia campione e buffer.
      1. Per ridimensionare correttamente il buffer, selezionare un intervallo di dati in alto Q (Q > 0,5 Å-1) dove entrambi i profili sono simili e piatto e fare clic sul pulsante 'Scala' situato sotto le 'operazioni' tab. Un fattore di scala si applicherà al buffer tale che queste due regioni piane devono sovrapporsi. Usare cautela: ci dovrebbe essere un motivo plausibile fisico che giustifica l'intensità di buffer per abbinare il campione di scaling. Se la discrepanza è grande, è possibile consultare un instrument scientist per approcci validi per sottrazione di sfondo. 44 , 45 , 72
      2. Aumentare l'intervallo di dati per visualizzare tutti i punti. Fare clic su 'Subtract' per eseguire questa operazione. Il file di dati buffer-sottratto nella Legenda fare clic destro e salvare questo file per la successiva analisi. Figura 9 illustra l'utilizzo della scheda «Operazioni».
    2. Eseguire un'analisi Guinier i sottratto da buffer di dati di esempio utilizzando la scheda 'Analisi' dell'applicazione 'Analisi dei dati SAS'.
      1. Verificare che il file corretto sia selezionato nell'elenco e fare clic su 'Raggio di girazione'. Un tentativo di eseguire un Guinier in forma automatizzato sarà fornito da facendo clic sul pulsante 'Autorg'.
      2. Espandere l'intervallo di dati utilizzati per includere tutti i dati di low-Q e iniziare a restringere l'intervallo di dati togliendo punti ad alto Q fino il Qmax * Rg limite è inferiore a 1.3. Utilizzare la trama di residui per verificare che i dati siano lineari nell'intervallo fit. Guinier fit produce un approssimativo Rg e I0 per le particelle di scattering.
      3. Apportare piccole modifiche alla regione adatta e monitorare la sensibilità di questi valori per l'intervallo di dati utilizzati nel fit. Figura 10A viene illustrato l'utilizzo dello strumento 'Raggio di girazione'.
  4. Ottenere la funzione di distribuzione di probabilità (P(r)) in GNOM. 73 il file di output generato qui sarà utilizzato come input per l' ab-initio processo di modellazione.
    1. Avvia la procedura guidata distribuzione di distanza all'interno della scheda di 'Analisi' ottenimento di un buon adattamento ai dati è essenziale per ottenere un modello di qualità. Per ulteriori informazioni su come ottenere misure precise, si veda la recensione74 da Putnam, et al.
      Nota: The GNOM programma fornisce ulteriori informazioni sulla vestibilità oltre la creazione guidata di distribuzione di distanza. Figura 10B viene illustrato il corretto utilizzo dello strumento «Distanza distribuzione», e Figura 11 illustra alcuni degli errori comuni incontrati.
    2. Determinare Dmax, la distanza massima interatomico all'interno della molecola.
      1. Stimare un valore per Dmax deselezionando la casella per forzare Rmax = 0 e immettendo un valore elevato per Dmax (150 Å, ad esempio). Il primo x-intercettazione nella trama del p (r) produce questa stima.
      2. Apportare le modifiche incrementali a questo valore Dmax e l'intervallo di dati utilizzati o numero di punti utilizzati nel fit per ottimizzare la GNOM adattarsi ai dati e la curva risultante p (r).
    3. Continuare a perfezionare la vestibilità GNOM e salvare i file di output GNOM con buoni parametri fit per successivi ab-initio passaggi di modellazione.
  5. Simulare SANS profili da modelli PDB ad alta risoluzione utilizzando il programma di Paolo. 75
    1. Aprire il programma e selezionare l'opzione '0'. Selezionare il nome del file PDB nel browser dei file popup. Premere INVIO per accettare le impostazioni predefinite, tranne che specifica le frazioni di deuteration di catena e la frazione di D2O nel solvente per ottenere i parametri di contrasto adeguato.
    2. 'Y' e selezionando il file di dati nel browser dei file popup si adattano al modello per un set di dati sperimentale. Accettare i valori predefiniti rimanenti e i file di output verranno scritto nel percorso del file PDB. Il file '. Fit' contiene informazioni per il profilo di scattering predetto dal modello 3D ad alta risoluzione.

7. creare modelli Ab Initio dal SANS dati.

Nota: DAMMIF76 e77 all'interno della suite di software ATSAS di DAMMIN viene utilizzato per ricostruire i modelli dell'atomo fittizio (DAMs) utilizzando un processo di ricottura simulato da GNOM, che contiene i dati di p (r), o informazioni sulla probabilità di uscita o frequenza delle distanze interatomiche all'interno della particella di scattering. Questi programmi possono essere eseguiti in modalità batch o sul server web ATSAS-Online.

  1. Avviare la procedura guidata forma PRIMUS dal pulsante 'Dammif' nella scheda 'Analisi' di 'Analisi dei dati SAS' e utilizzare una selezione manuale dei parametri. L'input per la procedura guidata è illustrata nella Figura 12.
    1. Definire l'intervallo di Guinier dal fit (punto 6.3.2) e procedere al passaggio successivo, utilizzando i pulsanti di navigazione. Definire i valori di misura dalla trama p (r) (punto 6.4) e procedere al passaggio successivo.
    2. Fornire i parametri per l' ab-initio processo di modellazione. Immettere un prefisso per i nomi di uscita di modello (ad esempio, SANSEnvelope), scegliere o modellazione di modalità 'veloce' o 'lento', immettere un valore per il numero di modelli (17 consigliato per significatività statistica), selezionare le opzioni disponibili per la simmetria delle particelle, anisometry e scala angolare (se noto). Assicurarsi che le caselle vengono controllate per modelli medio con DAMAVER e perfezionare il modello finale con DAMMIN.
    3. Avviare il processo utilizzando il pulsante 'conferma'. Una volta completato il processo, visualizzare e salvare la cartella di lavoro.
      Nota: il processo di modellazione tipica per una camera singola, piccola proteina può richiedere fino a un paio d'ore con un tipico personal computer. I file vengono memorizzati nella directory temporanee fino a quando salvato.
  2. Sovrapposizione e sovrapporre la finale SANS busta con un modello ad alta risoluzione correlata utilizzando SUPCOMB all'interno ATSAS. Inserire una copia del modello ad alta risoluzione PDB per essere in forma per la busta SANS nella directory di lavoro. Eseguire SUPCOMB dalla riga di comando utilizzando i nomi dei file PDB come due argomenti con la struttura del modello elencato per primo: supcomb $ HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Nota: Il secondo nome del file elencato sarà riscritto come un nuovo file con una "r" aggiunta alla fine e avere nuove coordinate per la sovrapposizione sulla struttura del modello.
  3. Visualizzare i risultati del modello ab-initio utilizzando PyMOL (pymol.org), un programma di visualizzazione di grafica molecolare 3D. Figura 13 viene fornita una panoramica delle operazioni PyMOL.
    Nota: Ci sono linee guida di pubblicazione per la modellazione strutturale di dati di scattering ad angolo piccolo dalle biomolecole in soluzione. 78
    1. Avviare l'applicazione di PyMOL e aprire i file PDB corrispondente al 3D SANS busta e la struttura ad alta risoluzione SUPCOMB-allineato per essere visualizzato.
    2. Visualizzare la busta SANS rappresentando questo modello come una superficie. Fare clic su del ' pulsante accanto al modello e selezionare ' Visualizza: come: superficie '.
    3. Visualizzare la struttura della spina dorsale proteina ad alta risoluzione che rappresenta questo modello come un cartone animato. Selezionare gli ' accanto a questo modello e seleziona ' Visualizza: come: Cartoon'. Visualizzare la catena come un arcobaleno da N - al C-terminale selezionando il pulsante 'C' e ' di catena: 'Chainbows.
    4. Modificare la trasparenza della rappresentazione superficiale per chiarezza. Dalla barra dei menu 'Impostazioni', selezionare ' trasparenza» superficie» 40% '.
    5. Fare il bianco e il non-opaco. Dalla barra dei menu 'Visualizza', selezionare ' sfondo»' e selezionare 'Opaque' di deselezionare questa opzione e 'Bianco' per contrassegnare questo colore per lo sfondo.
      Nota: ulteriori operazioni e usi per PyMOL possono essere trovati alla PyMolWiki.org.

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Risultati

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Una proposta di tempo e strumento di fascio chiaramente dovrebbe trasmettere tutte le informazioni necessarie per il Comitato di revisione in modo che può essere fatta una valutazione valida dell'esperimento proposto. Comunicazione con un NSS è altamente consigliata per gli utenti inesperti. il NSS può valutare fattibilità iniziale e presentazione delle proposte Guida per enfatizzare la fattibilità, la sicurezza e il potenziale per la scienza ad alto impatto. Le informazioni fornite nella...

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Discussione

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I ricercatori di biologia strutturale sfruttano tecniche strutturali complementari come soluzione dispersione per ottenere dettagli biochimici e strutturali (ad esempio, forma e dimensioni complessive) da biomolecole in soluzione. SANS è una tecnica particolarmente attraente per la determinazione di strutture di bassa risoluzione delle proteine di membrana, un focus di nucleo della moderna biologia strutturale e biochimica. SANS richiede quantità di proteine purificate paragonabili a quelli degli studi cristallografici (...

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Dichiarazioni

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Gli autori Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss e Ryan C. Oliver sono contratte attraverso UT-Battelle con noi DOE per sostenere il programma utente di neutroni scienza e Bio-SANS strumento all'Oak Ridge National Laboratory, utilizzato in questo articolo.

Questo manoscritto è stato co-autore di UT-Battelle, LLC, sotto contratto DE-AC05-00OR22725 con l'US Department of Energy (DOE). Mantiene il governo degli Stati Uniti e l'editore, accettando l'articolo per la pubblicazione, riconosce che il governo degli Stati Uniti mantiene una licenza non esclusiva, liberata, irrevocabile, in tutto il mondo per pubblicare o riprodurre il modulo pubblicato di questo manoscritto o consentire gli altri a farlo, fini governo US. DOE fornirà accesso del pubblico a questi risultati di ricerca sponsorizzato dal governo federale conformemente al piano di accesso pubblico DOE. 82

Ringraziamenti

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L'ufficio di biologico e la ricerca ambientale sostenuto la ricerca di ORNL centro per biologia molecolare strutturale (CSMB) e Bio-SANS utilizzando strutture supportati dalla divisione scientifica di strutture utente, Office di base energia scienze, dipartimento di di energia. Opere strutturali su proteine di membrana nel laboratorio di Lieberman sono stata sostenuta da NIH (DK091357, GM095638) e NSF (0845445).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Concentratore Amicon Ultra MWCO 50KDaEMD MilliporeUFC905096da laboratorio
Acido citrato di ammonio bibasicoFisher ScientificA663componente medio
Solfato di ammonioEMD Millipore2150componente medio
Bioflo 310 Sistema di bioreattoriEppendorfM1287-2110
attrezzatura Cloruro di calcio diidratoAcros423525000componente medio
CarbenicillinaIBI ScientificIB02025antibiotico
CloramfenicoloEMD Millipore3130antibiotico
Cloruro di cobalto (II)AcrosAC21413-0050componente medio
Solfato di rame (II)AcrosAC19771-1000 componente medio
Ossido di deuterioSigma-Aldrich756822componente medio
Drierite Gas PurifierW.A. Hammond Drierite Co. Ltd.27068
EDTA, disdio, diidratoEMD Millipore4010componente medio
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3apparecchiature
Ä kta Purificatore UPC100GE Healthcare attrezzatura
GlycerolSigma-AldrichG5516componente medio
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR colonnaGE Healthcare 
ImidazoloVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Cloruro di ferro (III) esaidratoMP BiochemicalsICN19404590componente medio
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
Solfato di magnesio eptaidratoVWR97062-134componente medio
Solfato di manganese (II) monoidratoAcrosAC20590-5000componente medio
MaxQ 6000 Agitatore incubato/refrigeratoThermo ScientificSHKE6000-7 attrezzatura
n-Dodecil-d25-β-D-maltopiranosideAnatraceD310T
n-Dodecil-β-D-maltopiranosideAnatraceD310A
Fosfato di potassio monobasicoVWR97062-346componente medio
RC 6 Plus CentrifugaThermo Scientific Sorvall46910attrezzatura
SIGMAFAST inibitore della proteasi compresse cocktail, Senza EDTASigma-AldrichS8830
Cloruro di sodioSigma-AldrichS3014
Idrossido di sodioSigma-Aldrich795429
Fosfato di sodio bibasicoSigma-AldrichS7907componente medio
Filtro per siringa sterile da 25 mm con 0,2µ m Membrana PESVWR28145-501
Filtro sterile monouso per flacone con 0,2µ m membrana in PESThermo Scientific596-4520 Articoli da laboratorio
Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare 
Colonna Superose-12 10/300 GL GE Healthcare 
Densimetro cellulare Ultrospec 10GE Healthcare 80211630attrezzature
Solfato di zinco monoidratoAcrosAC38980-2500 componente medio
171167011751750117517301

Riferimenti

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