Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per produrre gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) Sferoplasti e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplasti di visualizzare chiaramente e rapidamente caratterizzare interazioni del peptide-batteri. Questo fornisce un metodo sistematico per definire membrana localizzazione e dispostamento peptidi.

Abstract

L'uso della microscopia confocale come un metodo per valutare i modelli di localizzazione del peptide all'interno batteri comunemente è inibita dai limiti della risoluzione dei microscopi ottici convenzionali. Come la risoluzione di un microscopio dato non può essere facilmente migliorata, vi presentiamo protocolli per trasformare la piccola a forma di bastoncello gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) in forme sferiche più grandi, facilmente imaged chiamarono Sferoplasti o protoplasti. Questa trasformazione permette agli osservatori di rapidamente e chiaramente determinare se peptidi presentare se stessi nella membrana batterica (cioè, localizzazione di membrana) o attraversano la membrana per entrare nella cellula (cioè, dispostamento). Con questo approccio, inoltre presentiamo un metodo sistematico per caratterizzare i peptidi come membrana localizzazione o dispostamento. Mentre questo metodo può essere utilizzato per una varietà di peptidi attivi di membrana e ceppi batterici, dimostriamo l'utilità del presente protocollo osservando l'interazione di Buforin II P11A (BF2 P11A), un peptide antimicrobico (AMP), con e. coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti.

Introduzione

Peptidi antimicrobici (amp) hanno guadagnato l'attenzione a causa del loro potenziale utilizzo in alternativa agli antibiotici convenzionali^1,2,3,4,5. Amplificatori per uccidono i batteri sia dispostamento attraverso la membrana cellulare e interagendo con componenti intracellulari quali gli acidi nucleici o di permeabilizing la membrana provocando perdite di cella contenuto⁶. Oltre al loro uso come antibiotici, dispostamento amplificatori può essere adat....

Protocollo

1. soluzione preparazione

Nota: Preparare soluzioni descritte nei passaggi 1.1-1.9 e 1.8 – 1.11 per produrre sferoplasti di e. coli e b. megaterium protoplasti, rispettivamente.

1. Preparare 1 M Tris-Cl, pH 7,8 sciogliendo 10,34 g Tris HCl e 4,17 g di Tris OH in 50 mL di dH₂O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
2. Preparare soluzione A (20 mM MgCl₂, 0,7 M saccarosio, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) sciogliendo 0,10 g MgCl₂ (95,2 g/mol) e 11,9....

Risultati

Ingrandendo i batteri e rendendoli sferica, possiamo distinguere facilmente se peptidi si localizzano la membrana batterica o traslocano facilmente attraverso la membrana batterica. I limiti di risoluzione dei microscopi ottici convenzionali rendono difficile distinguere se peptide segnali derivano dalla membrana o spazio intracellulare in batteri normali perché segnali localizzati alla membrana apparirà a sovrapporsi con la spazio intracellulare (Figura 3A)........

Discussione

I protocolli qui presentati rendono fattibile per i ricercatori per ottenere più rapidamente più grandi dimensioni del campione di immagini batteriche perché i batteri allargati, sferici sono molto più facili da individuare, orientare e dell'immagine. Questa maggiore capacità di raccogliere dati è utile sotto diversi aspetti. In primo luogo, consente un'analisi quantitativa più sistematica dei modelli di localizzazione del peptide. Mentre le tendenze qualitative possono essere dimostrate da più piccoli insiemi di immagin.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Idrocloruro di Trizma (Tris HCl)	Sigma	T3253
Base di Trizma (Tris OH)	Sigma	T1503
Cloruro di magnesio	Sigma	M8266
Saccarosio	Sigma	S7903
Lisozima		Sigma L6876
Desossiribonucleasi I	Sigma	D4527
Acido etilendiamminotetraacetico	Sigma	106361	Utilizzato Sigma 106361 nello sviluppo del protocollo originale; 106361 interrotto con ED2SS in sostituzione
Cephalexin idrato	Sigma	C4895
Ampicillina	Fisher Scientific	BP1760
BBL Tripticasi brodo di soia	Fisher Scientific	B11768
BF2 P11A FITC	NeoScientific	Ordinato
di-8-ANEPPS	Biotium	61012
DMSO	Sigma	34869	Utilizzato Sigma D8779 nello sviluppo del protocollo originale; D8779 fuori produzione con 34869 come sostituzione
Acido maleico	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm Filtro siringa con 0,2 μ m HT Tuffryn Membrane	Pall Corporation	4192
Microscopio confocale a scansione laser	Leica Microsystems	TCS SP5 II	Per l'acquisizione di immagini
Leica Application Suite, Fluorescenza avanzata	Leica Microsystems		Per l'elaborazione di immagini

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