Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

Summary

micro-RNA (Mirna) è brevi e altamente omologhi sequenze di RNA, che serve come regolatori trascrizionali di RNA messaggeri (mRNA). Attuali metodi di rilevazione di miRNA variano nella sensibilità e specificità. Descriviamo un protocollo che unisce l'ibridazione in situ e immunostaining per il rilevamento simultaneo di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo.

Abstract

micro-RNA (Mirna) è trascritti di RNA singolo filamento che associare a RNA messaggeri (mRNA) e inibiscono la loro traduzione o promuovono la loro degradazione. Ad oggi, i miRNA sono stati implicati in un gran numero di processi biologici e malattia, che ha significato la necessità per i metodi di rilevamento affidabile delle trascrizioni di miRNA. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione basata su probe miRNA (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) digoxigenin-etichettati, combinati con proteine immunostaining su sezioni di cuore di topo. In primo luogo, abbiamo effettuato una tecnica in situ di ibridazione con la sonda per identificare espressione di miRNA-182 in sezioni di cuore da controllo e ipertrofia cardiaca nei topi. Successivamente, abbiamo effettuato immunostaining per la proteina cardiaca troponina T (cTnT), sulle stesse sezioni, a co-localizzano miRNA-182 con le cellule del cardiomyocyte. Usando questo protocollo, siamo stati in grado di rilevare miRNA-182 attraverso una fosfatasi alcalina basato su analisi colorimetrica e cTnT attraverso colorazione fluorescente. Questo protocollo può essere usato per rilevare l'espressione di qualsiasi miRNA di interesse attraverso sonde Scavare-contrassegnate LNA e l'espressione della proteina rilevanti su sezioni di tessuto di cuore di topo.

Introduction

micro-RNA (Mirna) è brevi (18 – 25 nucleotidi), singolo filamento, non codificanti RNA che fungono da regolatori negativi della espressione genica a livello post-trascrizionale inibendo la traduzione di RNA messaggero (mRNA) e/o promuovere la degradazione di mRNA ¹. i miRNA sono trascritti da introni o essoni di codifica o di geni non codificanti e sono spaccati nel nucleo di DROSHA, al precursore Mirna (pre-miRNA), che sono strutture di breve gambo-ciclo di 70 nucleotidi². Seguendo citoplasmico esportare, pre-miRNA vengono ulteriormente elaborati con DICER in Mirna maturi che si estendono su 18 – 25 nucleotidi

Protocol

Campioni di tessuto di cuore di mouse per questo studio sono stati ottenuti in conformità con le leggi e le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal comitato di uso e di Yale University istituzionale Animal Care.

1. soluzione preparazione

1. Preparare la RNasi free ddH₂O, trattando 5L di ddH₂O con 5 mL di 0,1% dietilpirocarbonato (DEPC) durante la notte (O/N), a temperatura ambiente (TA). Sterilizzare in autoclave (121 ° C) per disattivare il DEPC. Uso trattata DEPC ddH₂O quello per la preparazione di soluzioni a valle come indicato.
   Attenzione: DEPC è un noto cancerogeno, gestire solo ....

Results

ibridazione in situ di miRNA è stata ottimizzata su sezioni di cuore di topo utilizzando un scramble miRNA e U6-snRNA, che servivano come controlli positivi e negativi, rispettivamente. La macchiatura positiva è indicata in blu, mentre la macchiatura negativa è indicata dalla mancanza di sviluppo del colore (Figura 1A-1B). Cardiomyocyte espressione specifica dei miRNA-182 è stata valutata in sezioni di cuore da topi sovraesprimenti P.......

Discussion

rilevazione di miRNA trascrizione può essere raggiunto attraverso tecniche diverse che variano nella sensibilità, specificità e potere quantitativa. Qui, dimostriamo l'accoppiamento di miRNA ibridazione in situ con immunostaining e descrivere un protocollo che consente la valutazione simultanea dei livelli di espressione di miRNA e proteina molecole, le stesse sezioni di cuore. Abbiamo in primo luogo mostrano come eseguire ibridazione in situ di scavare-contrassegnato LNA miRNA sonde su sezioni di cuore.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dietilpirocarbonato	Sigma Aldrich	D5758	DEPC
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma Aldrich	P4417	PBS
Tween-20	Tensioattivo non ionico	American Bioanalytical	AB02038
Histoclear	National Diagnostics	HS-200
Proteinasi K, ricombinante, grado PCR Sigma	Aldrich	3115879001
ProK Paraformaldeide	Sigma Aldrich	P6148	PFA
Cloruro di sodio	ThermoFisher	S271	NaCl
Cloruro di magnesio esaidrato	ThermoFisher	M33	MgCl2
Tris	Sigma Aldrich	T6066
Soluzione di acido cloridrico, 1 N	ThermoFisher	SA48	HCl
Soluzione di acido cloridrico, 12 N	ThermoFisher	S25358	HCl
1-metilimidazolo	Sigma Aldrich	336092
N-(3-Dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato	Sigma Aldrich	39391	EDC
Soluzione di perossido di idrogeno H2O2	Sigma Aldrich	216763	H2O2
Trisodium citrato diidrato	Sigma Aldrich	S1804	Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)	Qiagen	339450	scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 sonda di rilevamento	QIagen	YD00615701	5'-DIG e 3'-DIG marcata
Levamisol cloridrato	Sigma Aldrich	31742
Albumina di siero bovino	Sigma Aldrich	A9647	BSA
NBT/BCIP Compresse	Sigma Aldrich	11697471001	NBT-BCIP
Cloruro di potassio	ThermoFisher	P217	KCl
DAPI soluzione (1mg/ml)	ThermoFisher	62248	DAPI
Vetrino coprioggetti	ThermoFisher	12-545E	Vetrino coprioggetti
plastica Grace	Bio-Labs	HS40 22mmX40mmX0.25mm	Vetrino coprioggetti in plastica senza RNA-asi
Anti-Digoxigenina-AP, frammenti Fab Sigma	Aldrich		11093274910 Anticorpo DIG
Penna barriera idrofobica	Vector Laboratories	H-4000	Pap pen
Anticorpo Troponina T anti-cardiaco	Abcam	ab92546	anticorpo cTnT
Anticorpo secondario ad assorbimento incrociato IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-11011	anticorpo anti-coniglio-568
Mezzo di montaggio a fluorescenza Dako		S3023
Siero di pecora	Sigma Aldrich	S3772
Siero di capra	Sigma Aldrich	G9023
Formamide deionizzata	americana Forno di	AB00600
	ThermoFisher	UVP HB-1000 Hybridizer