Reversione chimica delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile con una migliore differenziazione di Multilineage potenza

Sommario

Vi presentiamo un protocollo per la reversione chimica efficiente, alla rinfusa e rapida delle cellule staminali pluripotenti umane lignaggio-innescato convenzionale (hPSC) in uno stato di preimpianto epiblasto-come pluripotenti ingenuo epigenomically-stable. Questo metodo provoca l'espressione genica in diminuzione di lignaggio-innescato e miglioramento notevole nella differenziazione multilineare diretto attraverso un vasto repertorio di hPSC convenzionali linee.

Abstract

Cellule staminali pluripotenti umane di ingenuo (N-hPSC) con funzionalità migliorate possono avere un ampio impatto nella medicina rigenerativa. L'obiettivo del presente protocollo è per ripristinare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane lignaggio-innescato, convenzionale (hPSC) mantenute su condizioni sia privo di alimentatore o Alimentatore-dipendente da un ingenuo-come pluripotenza con funzionalità migliorate. Questo metodo di reversione ingenuo chimica impiega il fattore inibitorio di leucemia classica (LIF), GSK3β e MEK/ERK inibizione cocktail (LIF-2i), completati con solo un inibitore di tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i Ripristina hPSC convenzionale a uno stato stabile pluripotenti adottando biochimici, trascrizionale e caratteristiche epigenetiche dell'epiblasto umana pre-impianto. Questo metodo di LIF-3i richiede manipolazione di cultura di cellule minimal ed è altamente riproducibile in un vasto repertorio di cellule staminali embrionali umane (hESC) e linee di cellule staminali (hiPSC) di transgeni umane pluripotenti indotte. Il metodo di LIF-3i non richiede un passaggio ri-adescamento prima la differenziazione; N-hPSC possono essere differenziati direttamente con rendimenti estremamente elevati e mantenere karyotypic e stabilità di epigenomic (tra cui impresso loci). Per aumentare l'universalità del metodo, hPSC convenzionali sono coltivate in primo luogo nel cocktail LIF-3i completati con due altre piccole molecole che potenziare la chinasi di proteina A (forskolin) e segnalazione di sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i). Questo breve passaggio di adattamento LIF-5i significativamente migliora l'iniziale espansione clonale di hPSC convenzionale e permette loro di essere successivamente ingenuo-è ritornato con LIF-3i solo allo stato sfuso, così prevenendo l'esigenza di picking/subcloning rara N-hPSC colonie più tardi. LIF-5i-stabilizzato hPSCs sono mantenute in seguito a LIF-3i da solo senza la necessità di molecole anti-apoptotico. La cosa più importante, LIF-3i reversione contrassegnato migliora la pluripotenza funzionale di un vasto repertorio convenzionale hPSC diminuendo la loro espressione genica innescata lignaggio e cancellando la variabilità di interlinea di differenziazione diretto comunemente osservato tra linee hPSC indipendente. Rappresentante caratterizzazioni di LIF-3i-reverted N-hPSC sono strategie fornite e sperimentale per comparazioni funzionale di hPSC isogeniche nel lignaggio-innescato vs. Stati di tipo ingenuo sono delineati.

Introduzione

Il sistema di coltura 2i (inibitore MEK/ERK e GSK3β) è stato originariamente sviluppato per perfezionare culture di cellule staminali embrionali (mESC) eterogenei basati su siero del mouse ad uno stato di terreno uniforme di pluripotenza simile al mouse epiblast preimpianto¹. Tuttavia, 2i non supporta il mantenimento stabile della pluripotenti umane della cellula formativa (hPSC) linee². I vari complessa piccola molecola, fattore di crescita-completati e approcci transgenici recentemente sono stati segnalati per catturare putativamente simili pluripotenti umane ingenuo-come molecolare afferma². Tuttavia, molti degli Stati "ingenuo-like" creati con questi metodi anche esibito karyotypic instabilità, epigenomic difetti (ad es., perdita globale di parental imprinting genomico), o alterata differenziazione potenziale.

In contrasto, il cocktail di tripla inibizione chimica di GSK3β, ERK e tankyrase della segnalazione e fattore inibitorio di leucemia (LIF-3i) era sufficiente per la reversione ingenuo-come stabile di un vasto repertorio di hPSC convenzionali linee³. LIF-3i-reverted ingenuo hPSC (N-hPSC) mantenuto i karyotypes normali e aumentato le loro espressioni di geni specifici ingenuo umano preimpianto epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i hPSC di reversione conferito anche con una serie di caratteristiche molecolari e biochimiche uniche alla pluripotenza mESC-come ingenuo che comprendeva aumentata fosforilato STAT3 signaling, ha fatto diminuire la fosforilazione di ERK, global 5-metilcitosina CpG ipometilazione, demetilazione CpG genoma alle cellule staminali embrionali (ESC)-promotori di geni specifici e uso di enhancer OCT4 distale dominante. Inoltre, in confronto ad altri ingenui metodi di reversione che ha provocato aberrante ipometilato impresso loci genomici, LIF-3i-reverted N-hPSC erano privi di perdita sistematica di impresso CpG modelli o perdita di espressione di DNA metiltransferasi (per esempio, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)³.

Una coltura di LIF-3i diretta di una vasta gamma di convenzionale staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSC) coltivate su alimentatori o E8 privo di alimentatore condizioni raggiunto reversione alla rinfusa e rapida ad uno stato di epiblasto-come ingenuo. Tuttavia, diretto LIF-3i ingenuo reversione può essere inefficiente in alcune linee di hPSC convenzionale instabile dovuto l'inerente variabilità genomica e lignaggio-innescato derivanti dagli sfondi donatore geneticamente diverse.

Così, per ampliare l'utilità del metodo LIF-3i, un'ottimizzazione graduale è stata sviluppata ed è presentata qui, che permette di reversione ingenuo universale con quasi qualsiasi hESC convenzionale o linea di transgeni hiPSC coltivate su alimentatori. Questo metodo di reversione universalizzanti ingenuo impiega un passo di cultura iniziale transitoria in hPSC convenzionale che integrano il cocktail di LIF-3i con due altre piccole molecole (LIF-5i) che rafforzano la chinasi di proteina A (forskolin) e sonic hedgehog (sHH) ( segnalazione di purmorphamine). Un passaggio iniziale di hPSC convenzionale in LIF-5i li adatta a successive stabile LIF-3i reversione allo stato sfuso. Adattamento di LIF-5i iniziale aumenta significativamente la proliferazione clonale di singola cellula iniziale delle convenzionali hPSC coltivate su E8 o alimentatori (prima del loro successivo passaggio stabile, continuo a LIF-3i da solo). HPSC convenzionali linee adattate prima di un passaggio in LIF-5i tollerano successive alla rinfusa clonale passaggio delle cellule naive-reverted in condizioni di LIF-3i, che previene l'esigenza di picking e subcloning di rare colonie stabili, o l'uso di routine molecole anti-apoptotiche o inibitori della Rho-associati proteina chinasi (ROCK).

Il metodo di LIF-3i è stato impiegato con successo per stabile espandere e mantenere un vasto repertorio di > 30 hPSC convenzionale indipendente, geneticamente diverse linee per > 10 – 30 passaggi utilizzando sia metodi di dissociazione non enzimatica o enzimatica, e senza prova di induzione di cromosomiche o anomalie epigenomic, compreso le anomalie alle loci genici impresso. Inoltre, sequenziale LIF-5i/LIF-3i cultura è il metodo di reversione solo ingenuo che finora è stato segnalato che migliora la pluripotenza funzionale di un vasto repertorio di linee convenzionali hPSC diminuendo la loro espressione genica innescata lignaggio e migliorando notevolmente la loro potenza di differenziazione multipotenti. Il LIF-3i ingenuo reversione metodo cancella l'intrinseco interline variabilità di differenziazione delle linee hPSC lignaggio-innescato, convenzionale e avrà una grande utilità dell'applicazione nella medicina rigenerativa e terapie cellulari.

Protocollo

Tutte le procedure di animali sono state effettuate conformemente agli orientamenti di cura degli animali e protocolli approvati dalla Johns Hopkins School di medicina Istituto di cura degli animali e uso Committee (IACUC).

1. preparazione di fibroblasti embrionali del Mouse (MEF) per alimentatore-dipendente convenzionale (hESC medio/MEF) o ingenuo-ripristinato hPSC (LIF-3i medio/MEF) cultura

1. Acquistare o preparare in casa bassa-passaggio forniture degli alimentatori MEF da CF1 o CF1 x DR4 embrioni di topo E13.5 ibrido seguendo protocolli pubblicati⁴.
   1. Crioconservare culture del MEF di passaggio basso (p1-p2) pre-(per conservazione a lungo termine) o dopo (per fino a 6 mesi) irradiazione e conservare in azoto liquido come precedentemente descritto⁴.
   2. Irradiare (5.000 rad) espanso MEF sotto p5 utilizzando un γ - o X-ray-irradiatore di massa e preparare aliquote a 1,5 x 10⁶ cellule per flaconcino per lo stoccaggio a breve termine (meno di 6 mesi) a-80 ° C in un congelatore di ultra-bassa temperatura.
   3. Piastra tra 1.2 x 10⁶ (appena irradiati non crioconservati) e 1,5 x 10⁶ (irradiati crioconservati) MEF per una piastra gelatinizzata 6 pozzetti per la preparazione di colture di alimentatore, come descritto di seguito.
2. Preparare rivestite con gelatina sterile 6 pozzetti piastre di coltura del tessuto-trattati con l'aggiunta di 1,5 mL di soluzione di gelatina sterile 0,1% ad ogni pozzetto in una cappa di sicurezza biologica.
3. Incubare le piastre rivestite con gelatina a 37 ° C per almeno 1 h o durante la notte in un incubatore da laboratorio CO₂ .
4. Il giorno successivo, scongelare passaggio basso (ad es., P2 a P4) crioconservati DMSO e irradiata (5.000 rad) MEF seguendo i passaggi indicati di seguito.
   Nota: Non irradiati MEF dovrebbe anche essere scongelati, espansa e irradiati immediatamente prima dell'uso.
5. Trasferire un'aliquota MEF crioconservata in bagnomaria a 37 ° C. Dopo lo scongelamento, sterilizzare il tubo con etanolo e diluire immediatamente il crioprotettore DMSO almeno 10 volte con il mezzo di MEF (tabella 1) all'interno di una cappa di biosicurezza (ad es. trasferimento 1 mL di DMSO-MEF aliquota in 9 mL di terreno di MEF in una sterile 15 mL conica).
6. Centrifugare le cellule MEF diluite a 200 x g per 5 min in provette coniche da 15 mL sterile.
7. In una cappa di biosicurezza, aspirare e scartare il supernatante senza cellula e risospendere il pellet cellulare in 1 – 2 mL di terreno fresco di MEF.
8. Delicatamente scartare la soluzione di gelatina e aggiungere 2 mL di MEF ri-sospese nel mezzo MEF in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti gelatinizzata, come indicato sopra. Le celle del MEF di conteggio e piastra 1.2 x 10⁶ (appena irradiati non crioconservati) o 1.5 x 10⁶ (irradiati crioconservati) MEF per una piastra gelatinizzata 6 pozzetti.
   Nota: Tutte le piastre per colture cellulari che vengono trasferite dall'incubatrice di CO₂ per la biosicurezza possono essere pulite delicatamente con carta etanolo-spruzzato ma non dovrebbero essere spruzzate direttamente su con soluzione di etanolo 70% per evitare la diffusione di etanolo nei pozzetti.
9. Incubare MEF piastre a 37 ° C durante la notte in un incubatore da laboratorio CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida) per consentire l'attaccamento, prima dell'uso.

2. stabilizzazione delle culture hPSC convenzionale per successive ingenuo reversione con un passo di adattamento breve LIF-5i di massa

1. Convalidare tutte le linee di hPSC convenzionale per il possesso di un karyotype normale dalla G-fascia, prima del ritorno di inizio LIF-5i/LIF-3i.
   Nota: LIF-3i reversione delle linee convenzionali hPSC high-passaggio (ad es., P > 40 – 50) dovrebbe essere evitato, poiché queste culture possono già harbor aberrazioni che possono influire negativamente sulla reversione di LIF-3i stabile, efficiente e alla rinfusa di innescato, convetional hPSC linee.
2. Mantenere ed espandere la culture hPSC convenzionale con i karyotypes normali convalidati in un sistema basato su MEF cultura (come indicato nella sezione 1) o un sistema di coltura privo di alimentatore (secondo la preferenza del ricercatore).
   Nota: Entrambi cocultures hPSC/MEF Alimentatore-dipendente (ad es., hESC medium (tabella 1) completate con 4 – 10 ng/mL bFGF) o senza alimentatore (ad es., E8 ⁵ o mTSER ⁶ media (secondo le istruzioni del produttore su metodi di piastre rivestite con vitronectina) sono compatibili con reversione ingenuo di massa utilizzando il sistema di LIF-5i/LIF-3i/MEF (Figura 1). Metodi non-enzimatici sono preferiti per il passaggio di hPSC convenzionale prima di prepararli per la reversione. LIF-5i e LIF-3i formulazioni di media non contengono antibiotici o antimicotici. Regole di funzionamento standard per la biosicurezza armadietto sterilità e la manutenzione sono tenute a rispettare rigorosamente per evitare qualsiasi contaminazione batterica o fungina.
3. Per il MEF-basato sistema di cultura, preparare gli alimentatori MEF nella piastra di 6 pozzetti gelatinizzato come descritto nella sezione 1 almeno un giorno prima di passaggio di culture LIF-5i-adattato hPSC convenzionali.
4. Dopo convenzionale hPSC culture hanno raggiunto confluency di ~ 50% (cioè, 3 – 5 giorni dopo il placcaggio iniziale), è possibile sostituire il terreno di coltura standard hESC con LIF-5i medio (2 mL / pozzo; Tabella 1).
   Nota: Eseguire questi passaggi in una cappa di biosicurezza.
5. Cultura e mantenere convenzionale hPSC/MEF per fino a 2 giorni in LIF-5i nell'incubatore CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida). Cambiare il mezzo di LIF-5i giornalmente per adattarle per il loro successivo passaggio e stabile reversione in LIF-3i.
6. In alternativa, per le culture senza alimentatore convenzionale (ad esempio, in E8), coltura hPSC in LIF-5i solo pernottamento prima di passaggio la mattina successiva.
   Nota: LIF-5i e LIF-3i culture possono entrambi essere mantenute con atmosferico (21% O₂) o fisiologico (5% O₂) ossigeno livelli nell'incubatore CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida).
7. Prima del passaggio, posizionare le piastre di coltura in un armadio di sicurezza biologica, lavare hPSC convenzionale LIF-5i-adattato una volta con PBS e aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione delle cellule in ciascun pozzetto. Incubare per 5 min a 37 ° C in un incubatore a CO₂ e triturare delicatamente con una pipetta in sospensione singola cella torna nella cappa di biosicurezza.
   Nota: Buffer di dissociazione Non enzimatica in alternativa possono essere utilizzati per preparare le celle singole per passaggio.
8. Raccogliere la sospensione cellulare in hESC medie (almeno 2 volte diluizione) un provette coniche da 15 mL sterile e triturare delicatamente le cellule pipettando per ottenere una sospensione di singola cellula.
9. Centrifugare a 300 x g per 5 min, aspirato/scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 – 2 mL di terreno LIF-5i nella cappa di biosicurezza. Contare le celle utilizzando un contatore automatico delle cellule o un emocitometro.
10. Lavare la piastra pre-placcata del MEF due volte con PBS (2 mL per pozzetto in piastre da 6 pozzetti) e distribuire 1 – 2 x 10⁶ cellule (nel mezzo di 2 mL LIF-5i) sul 1 bene della piastra PBS-lavato MEF.
11. Regolare e ottimizzare la densità di placcatura iniziale per ogni riga di hPSC individuali essere ripristinato come ingenuo, come ricromatura efficienze può essere altamente variabile. Posizionare la piastra in un incubatore a CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida).
    Nota: L'uso sistematico dei reagenti anti-apoptotiche non è consigliato per la maggior parte delle linee hPSC con questo metodo. Il sistema di LIF-5i migliora già significativamente efficienze ri-placcatura clonale di massa iniziale delle linee convenzionali hPSC. Tuttavia, un uso una tantum di inibitore di roccia (5-10 μM Y-27632) possono più ulteriormente migliorare l'iniziale efficienza LIF-5i ri-placcatura clonale delle culture hPSC convenzionale nel primo passaggio per alcune linee di hPSC lignaggio-innescato instabile con la propensione per spontanea differenziazione.
12. Se a partire da alimentatore-free culture (ad es., E8), direttamente trasferire un pozzetto della dissociata hPSC convenzionale adattato in LIF-5i in uno irradiato MEF-placcato bene (cioè, passaggio 1:1).
13. Il giorno successivo, agitare delicatamente la piastra di sollevare tutte le celle non iscritti, aspirare il mezzo (lavaggio con PBS è facoltativo) e sostituire con 2 mL di terreno di LIF-5i. Eseguire questo passaggio in una cappa di biosicurezza al giorno per 3 – 5 giorni o fino a quando le cellule sono 60 – 70% confluenti (Figura 1). Posizionare la piastra in un incubatore a CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida).

3. a lungo termine manutenzione e ampliamento delle N-hPSC nel mezzo di LIF-3i

1. A seguito di iniziale adattamento LIF-5i, passaggio stabile LIF-3i successive culture ogni 3 – 4 giorni in una cappa di biosicurezza, o quando culture diventano 60 – 70% confluenti (Figura 1).
   Nota: LIF-3i culture richiedono manutenzione rigorosa e consentire alle culture di N-hPSC raggiungere densità alta confluenza/cellulare da coltura prolungata (ad es., > 4 giorni) riduce l'efficienza di ri-placcatura clonale successivo e promuove la spontanea differenziazione.
2. In una cappa di biosicurezza, scartare il terreno di coltura e lavare ogni bene di LIF-5i/LIF-3i culture delicatamente aggiungere 2 mL di PBS. Scartare la PBS e aggiungere 1 mL di soluzione di distacco delle cellule. Incubare per 5 min a 37 ° C in un incubatore a CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida).
3. Raccogliere la sospensione cellulare, aggiungere hESC medio (senza inibitori o fattori di crescita (tabella 1); almeno 2 volte diluizione) per recuperare tutte le hPSC e triturare delicatamente le cellule pipettando per ottenere una sospensione di singola cellula. Trasferire la sospensione in una provetta conica sterile 15 mL.
4. Centrifugare a 300 g per 5 min e aspirato/scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in mezzo LIF-3i. Contare le celle utilizzando un contatore automatico delle cellule o un emocitometro.
5. Piastra ~ 2 x 10⁵ cellule per pozzetto al MEF irradiati nella piastra di 6 pozzetti gelatinizzata per passaggio sistematico delle culture LIF-3i. Per le culture di LIF-5i-adattato iniziale, piastra un'inizialmente alta densità (4 x 10⁵ cellule/pozzetto) prima del primo passaggio in LIF-3i/MEF.
6. Ri-piastra e distribuire hPSC LIF-5i-adattato sul fresco lavate in PBS MEF alimentatore piastre irradiate (preparato il giorno precedente come sopra) nel medium LIF-3i. Sostituire il mezzo di LIF-3i ogni giorno.
7. Passaggio N-hPSC per meno massa continuo 4 – 7 passaggi nel LIF-3i medio prima dell'uso di N-hPSC negli studi funzionali o crioconservazione. Registrare il numero di passaggi di N-hPSC in entrambi convenzionali o supporti LIF-3i.
   Nota: LIF-3i reversione dell'alta-passaggio (ad es. > p40) linee hPSC lignaggio-innescato, convenzionale non è raccomandato. Uno sforzo dovrebbe essere fatto per ripristinare le linee convenzionali hPSC al passaggio più basso possibile che siano disponibili. Inoltre, l'uso di hPSC LIF-3i-reverted che hanno subito maggiore di 10 passaggi di LIF-3i non è raccomandato per studi funzionali, poiché tali culture N-hPSC possono harbor cloni karyotypically anormali a causa della selezione cultura prolungata delle cellule clonali. Fresco LIF-5i/LIF-3i ritorni delle linee di basso-passaggio hPSC convenzionale devono essere condotta per studi funzionali, se gli stock di N-hPSC con < 10 passaggi in LIF-3i non sono disponibili.

4. crioconservazione e scongelamento di LIF-3i-reverted N-hPSC

1. Espandere ripristinato N-hPSC per almeno 5-7 passaggi in LIF-3i, come indicato in precedenza, prima dell'uso in studi funzionali o crioconservazione a lungo termine. Registrare il numero di passaggi in condizioni convenzionali e in condizioni di LIF-3i su ogni flaconcino crioconservato.
   Nota: Eccesso LIF-3i-reverted N-hPSC non utilizzato in saggi funzionali possa essere crioconservati ad ogni passaggio, ma gelida di passaggi più bassi di post-reversione (ad es.., < p3) può causare poveri, o efficienze altamente variabile post-disgelo recupero.
2. In una cappa di biosicurezza, aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule in PBS (2 mL per pozzetto), aspirare PBS e dissociare hPSC colonie in singole celle utilizzando la soluzione di distacco delle cellule (1 mL per pozzetto). Posizionare la piastra per 5 min a 37 ° C in un incubatore a CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida). Diluire la soluzione di distacco delle cellule con il mezzo di LIF-3i (2 volte), raccogliere hPSC in una sterile conica da 15 mL, centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare in mezzo LIF-3i (1 – 2 mL / pozzetto-equivalente). Contare il numero di celle utilizzando un contatore automatico delle cellule o un emocitometro.
3. Centrifuga N-hPSC nel medium LIF-3i (200 x g per 5 min) e risospendere le cellule in un armadio di sicurezza biologica nella soluzione di congelamento (tabella 2), con una densità di almeno 1 x 10⁶ cellule/mL.
4. Trasferire le cellule nelle provette criogeniche deposito a lungo termine e collocare in un contenitore di congelamento lento. Consentire ai campioni di congelare durante la notte in un congelatore a-80 ° C.
5. Il giorno successivo, trasferire il cryovials in un congelatore di azoto liquido per stoccaggio a lungo termine.
6. Per lo scongelamento, collocare il flaconcino di congelati in bagnomaria a 37 ° C per ~ 2 min. sterilizzare il flaconcino (cioè, spruzzo di etanolo), trasferire hPSC in una sterile conica da 15 mL e diluire lentamente le cellule 10 volte in hESC supplementato (tabella 1) con 5 μM di Inibitore di chinasi (ROCK) Rho-collegata della proteina Y-27632 all'interno di una cappa di sicurezza biologica sterile mobile.
7. Centrifuga a 200 x g per 5 min. In una cappa di biosicurezza, gettare senza cellula supernatante e risospendere il pellet cellulare in LIF-3i medium (1 – 2 mL) completate con inibitore di 5 μM ROCK Y-27632.
   Nota: L'esclusione di Y-27632 si tradurrà in scarsa efficienza di recupero post-scongelamento (Figura 2).
8. Trasferire le cellule scongelate risospese in LIF-3i/ROCK inibitore sulla PBS-lavato MEF-placcato pozzetti. Crioconservare LIF-3i culture ad una densità di 1 x 10⁶ cellule per flaconcino. Ciascuna di queste fiale su alimentatori in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti gelatinizzato scongelare.
9. Il giorno successivo, avviare regolari LIF-3i media espansione senza inibitore della Rho-chinasi.

5. alimentatore rimozione per la raccolta di campioni di N-hPSC

1. Per preparare le colture di campioni da LIF-3i/MEF (o hESC/MEF convenzionale) (cioè, per l'espressione genica (ad es., RT-PCR quantitativa, microarrays) o analisi di proteine (ad es., Western blot), impoveriscono LIF-3i culture da alimentatori MEF utilizzando Magnetico attivato Cell Sorting (MACS) con l'anticorpo anti-TRA-1-81 rivestito microsfere secondo il protocollo del produttore.
2. In alternativa, utilizzare il seguente metodo semplice pre-placcatura per esaurire culture di alimentatori, come descritto di seguito.
3. In una cappa di sicurezza biologica sterile armadietto, scartare il supernatante senza cellula, lavare la pallina con 2 mL di PBS sterile per pozzetto. Staccare aderente culture LIF-3i/MEF utilizzando soluzione di distacco delle cellule (1 mL/pozzetto). Incubare per 5 min in un incubatore a CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida). Raccogli hPSC in una sterile conica da 15 mL. Lavare 2 volte hESC in mezzo, cellule di trasferimento nella sterile 15 mL conica e centrifugare a 200 x g per 5 min.
4. In una cappa di biosicurezza, Risospendere ciascun pozzetto delle cellule LIF-3i/MEF dissociato in 2 mL di terreno LIF-3i e trasferire direttamente su un nuovo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti che è stato appena rivestito con 0,1% di gelatina.
5. Incubare le cellule di hPSC LIF-3i/MEF per 1h a 37 ° C in un incubatore a CO₂ (5% CO₂, atmosfera umida). Raccogliere le cellule non-aderenti con una pipetta in un nuovo tubo conico. Delicatamente aggiungere 2 mL di terreno hESC in ciascun pozzetto e agitarlo per raccogliere le cellule rimanenti non aderente.
   Nota: La maggior parte del MEF irradiati attribuirà alla piastra gelatinizzata in 1h, lasciando la maggior parte della hPSC in sospensione.
6. Combinare e centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min lavaggio in PBS. Il pellet cellulare di snap-congelamento in azoto liquido dopo la centrifugazione, o in alternativa risospendere il pellet in un buffer di lisante che è compatibile con l'analisi di proteine o acidi nucleici a valle (Figura 2B).
7. Eseguire caratterizzazioni di LIF-3i hPSC linee con un corrispondente controllo convenzionale hPSC isogeniche innescata.
   Nota: A causa della intrinseca variabilità tra e all'interno di culture innescate, i controlli pertinenti vengono preparati ad un determinato timepoint corrispondente nella cultura o prima della reversione ingenuo. Protocolli dettagliati e materiali per bioimmagini immunofluorescente a valle, flusso cytometry, Western blotting, espressione genica (analisi di RT-PCR e microarrays), studi di metilazione (dot blot, microarray di metilazione di CpG), OCT4 prossimale e distale enhancer predominanza reporter saggi e segnalazione inibitore saggi sono disponibili altrove³.

6. post ingenuo reversione: convalida dell'integrità genomica e ritenzione di impronte parentale di LIF-3i-reverted N-hPSC prima dell'uso in saggi funzionali

1. Schermo le culture partenza hPSC innescata e convenzionale per il possesso di un cariotipo normale (ad esempio, con analisi della colorazione Giemsa-fascia usando metodi pubblicati ⁷) prima dell'inizio della reversione LIF-5i/LIF-3i.
   Nota: Si tratta di eliminare popolazioni hPSC convenzionale che possono harbor anormali alterazioni genomiche che possono guidare il vantaggio di sopravvivenza selettiva artefactual in condizioni di LIF-3i clonale.
2. Per risultati ottimali, appena ripristinare convenzionale hPSC culture a uno stato ingenuo-simile con LIF-3i diverse settimane prima di loro uso negli studi funzionali o diretto di differenziazione.
   Nota: La Routine prolungato cultura 'manutenzione' in condizioni di LIF-3i per più di 10 passaggi seguenti ingenuo reversione non è raccomandato. Espansione di routine e la manutenzione di linee hESC e hiPSC deve essere eseguite utilizzando sistemi di coltura convenzionale (ad esempio, in E8, o MEF/hESC medie con bFGF).
3. Valutare post-ripristinato N-hPSC linee per il mantenimento del normale karyotypes 5 – 7 passaggi dopo reversione LIF-3i (ad es., con analisi colorazione di Giemsa-banda⁷o qualsiasi altro metodo di scelta).
4. Valutare tutte le linee N-hPSC ripristinate per ritenzione di impronte genomiche parentale normale di un'analisi di metilazione del DNA di scelta (ad es., protocolli per analisi di CpG DNA microarray di impronte parentale in LIF-3i-reverted N-hPSC sono forniti altrove³ ) dopo 5 – 10 passaggi di reversione LIF-3i.

7. post ingenuo reversione: Disegno sperimentale linee guida per le analisi quantitativa differenziazione diretto usando N-hPSC LIF-3i-reverted

1. Utilizzare direttamente LIF-3i N-hPSC nei protocolli di differenziazione diretto stabilito senza manipolazioni di cultura di cellule supplementari.
   Nota: Re-innesco (cioè, riconversione N-hPSC condizioni convenzionali innescate prima del loro uso nelle analisi di differenziazione diretto) non è necessario con il metodo di LIF-3i e non è raccomandato.
2. Per controllare per gli impatti del dosaggio e interline variabilità nel collaudo funzionale di linee individuali hPSC, Croce-convalidare le potenze di stirpe-specific differenziazione impiegando protocolli di differenziazione indipendente con almeno tre hPSC linee derivate da ambiti di provenienza genetici indipendenti (cioè, più hiPSC donatore-derivati e hESC).
3. Per i confronti funzionali, impostare LIF-3i-reverted hPSC culture e culture di pari livello, al numero di equivalenti di passaggio e della stessa linea di hPSC (isogeniche) in parallelo con il convenzionale lignaggio-innescato. Mantenere le culture di hPSC isogeniche innescato/ingenuo di pari livello nei loro rispettivi media (ad es., E8 vs. LIF-3i) e contemporaneamente differenziare utilizzando protocolli di differenziazione identici e materiali, per eliminare ogni pregiudizio sperimentale (Figura 4).
4. Per isogeniche innescato vs ingenuo hPSC comparazioni, regolare e ottimizzare la densità di placcatura iniziale per ogni analisi di differenziazione individuale.
   Nota: Protocolli dettagliati per progenitrici neurali, endoderma definitivo e differenziazione hemato-endoteliale diretto di LIF-3i-reverted N-hPSC sono forniti altrove ³. LIF-3i-reverted N-hPSC hanno più robusta capacità proliferativa e differenziazione nelle analisi di differenziazione diretto di hPSC convenzionali. N-hPSC richiede in genere una minore concentrazione di placcatura iniziale rispetto la hPSC convenzionali, e a differenza loro convenzionale hPSC innescato controparti, non richiedono l'uso di reagenti anti-apoptotici per migliorare la loro sopravvivenza clonale seguendo enzimatica digestione in saggi di differenziazione.

Risultati

Questo protocollo consente di ottimizzare efficiente reversione ingenuo-come con LIF-3i in entrambe le culture hPSC convenzionale lignaggio-innescato alimentatore-dipendenti e indipendenti dell'alimentatore (Figura 1). Il protocollo dettagliato, ivi descritto contorni adattamento sequenziale per LIF-3i a partire da entrambi condizioni hPSC Alimentatore-dipendente o senza alimentatore convenzionale (es. E8 medio).

Discussione

Il sistema di LIF-3i si applica una versione modificata del classico 2i murino ingenuo reversione cocktail¹ a cellule staminali pluripotenti umane. L'auto-rinnovamento di hPSC (che non può espandersi in 2i da solo) è stabilizzato in LIF-2i completando questo cocktail con l'inibitore di tankyrase XAV939. LIF-3i cultura permette alla rinfusa e reversione efficiente della hPSC convenzionale ad uno stato pluripotenti che assomiglia l' epiblasto preimpianto umano

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated	BD Biosciences	561716	use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody	Sigma Aldrich	HPA029708	use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody	Abcam	ab6276	use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated	BD Biosciences	550315	use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated	eBioscience	17-0319-42	use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit	Miltenyi Biotec	130-091-935
anti-NANOG antibody	Abcam	ab109250	use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody	Sigma Aldrich	HPA005455	use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody	Cell Signaling	4695	use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody	Cell Signaling	4370	use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody	Cell Signaling	9145	use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated	Agilent	E0432	use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated	R&D System	FAB1435A	use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated	R&D System	NLLC1435G	use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody	Cell Signaling	9139	use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody	Millipore	MAB4388	use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated	R&D System	NLLC4770R	use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated	Stemgent	09-0068	use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated	Stemgent	09-0069	use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated	BD Biosciences	560193	use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated	BD Biosciences	560161	use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li	StemCell Technologies	5271
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3311
CellAdhere dilution buffer	StemCell Technologies	7183	dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse	Charles river	023
CHIR99021	R&D System	L5283	reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system	Zeiss	LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line	Thermo Fisher Scientific	A18945	also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates	Corning	3506
Countess  cell counting chamber slide	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific	11995-065
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	D2650
DR4 mouse	The Jackson Laboratory	3208
Essential 8 (E8) medium	StemCell Technologies	5940
Fetal bovin serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30071.03
Forskolin	Stemgent	04-0025	reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine)	Sigma Aldrich	G1890-100G	resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828-028
L-Glutamine (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
mTeSR1 medium	StemCell Technologies	85850
Nalgene cryogenic vials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System	Fisher Scientific	154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
PD0325901	Sigma Aldrich	PZ0162	reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
Purmorphamine	Stemgent	04-0009	reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A	Peprotech	AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4	Peprotech	120-05ET	resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF)	Peprotech	1