Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Summary

Ex vivo dell'isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.

Abstract

Gli esperimenti usando isolotti pancreatici isolati sono importanti per la ricerca sul diabete, ma gli isolotti sono costosi e di abbondanza limitata. Isolotti contengono una popolazione di cellule miste in un'architettura strutturata che gli impatti funzione e isolotti umani sono ampiamente variabile nella composizione di tipo cellulare. Attuali metodi utilizzati di frequente per studiare isolotti coltivati includono studi molecolari su isolotti interi, tipi di cellule dell'isolotto disparati lumping insieme, o microscopia o studi molecolari su cellule disperse dell'isolotto, interrompendo l'architettura dell'isolotto. Per in vivo gli studi dell'isolotto, paraffina pancreas sezionamento è una potente tecnica per valutare i risultati di cellula-specifico nell'ambiente del pancreas nativo. Studiando la post-cultura isolotti dalla divisione di paraffina sarebbe offrono diversi vantaggi: rilevamento di risultati multipli sulla stessi isolotti (potenzialmente anche lo stessa esatta isolotti, utilizzando sezioni di serie), le misure di cellula-tipo-specifico e mantenimento nativo isolotto-cellula e cellula-substrato interazioni sia durante l'esposizione sperimentale che per l'analisi. Tuttavia, le tecniche esistenti per l'incorporamento isolato isolotti post-cultura sono inefficienti, che richiede tempo, soggetta a perdita di materiale e generalmente producono sezioni con numeri di isolotto inadeguata per essere utili per quantificare i risultati. Impianti di preparazione delle cella blocco del laboratorio di patologia clinica sono inaccessibili e poco pratico per i laboratori di ricerca di base. Abbiamo sviluppato un metodo di banco migliorato, semplificato che genera sezioni con resa robusta e distribuzione degli isolotti. Fissi isolotti sono risospese in gel di agarosio istologico caldo e pipettati in un disco piatto su un vetrino standard, tale che gli isolotti sono distribuiti in un aereo. Dopo disidratazione standard e incorporamento, più (10 +) 4-5 µm sezioni possono essere tagliati dallo stesso blocco dell'isolotto. Utilizzando questo metodo, analisi istologiche ed immunofluorescenti possono essere eseguite sul topo, ratto e isolotti umani. Si tratta di un approccio efficace, poco costoso, risparmio di tempo per valutare i risultati specifici del tipo di cellula, architettura intatta da isolotti coltivati.

Introduction

Isole di Langerhans, la sola fonte di insulina, di circolazione sono un tessuto critico per gli investigatori studiando il diabete mellito. Da qualsiasi dato organismo, isolotti hanno dimensione variabile, frequenza di tipo cellulare e architettura^1,2,3. La strategia convenzionale di studiare in vivo struttura e composizione endocrina delle cellule degli isolotti pancreatici è sezionando pancreas tessuto^4,5. Poiché gli isolotti comprendono solo una piccola frazione del totale contenuto cellulare pancreatica, ....

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal comitato di uso e UMass Medical School istituzionale Animal Care. Gli studi umani dell'isolotto sono stati determinati mediante la UMass Institutional Review Board a non qualificarsi per revisione IRB o esenzione perché non implicano l'uso di soggetti umani.

1. isolotto isolamento e coltura

1. Isolotti di isolare e separare dalla contaminazione del tessuto esocrino e duttale utilizzando il metodo di vostra scelta.
   Nota: Questo metodo è stato ottimizzato utilizzando isolotti isolati di insufflazione ductal collagenosi e Ficoll separazione¹²

Results

Un disegno schematico illustrato i passaggi per preparare il disco gel è illustrato nella Figura 1. Questo risultati del metodo di disco gel nelle sezioni della paraffina che contengono un numero sufficiente di isolotti distribuiti in un unico piano per consentire significativa quantificazione dei risultati. La figura 2 Mostra il basso ingrandimento immagini delle sezioni risultante per illustrare il numero di isolotti catturato .......

Discussion

Questo metodo di incorporamento gel a base di disco modificato fornisce un semplice, poco costoso e un modo efficace per generare un rendimento elevato degli isolotti per ogni sezione. Costruire il disco gel su una superficie di vetro piano facilita spalmare isolotti in una distribuzione uniforme su un'area ben definita. Diffondere gli isolotti in un disco piatto offre il vantaggio di immissione molti isolotti nel piano della sezione, ottimizzando il rendimento e permettendo minori isolotti essere utilizzato. Lo spessore.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta Eppendorf da 1,5 mL	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Punta a rilegatura bassa (1000 &; L)	Genesee Scientific	24-430
Punta a basso legame (200 μ L)	Genesee Scientific	24-412
Punta a basso legame (20 μ L)	Genesee Scientific	24-404
Punta a basso legame (10 μ L)	Genesee Scientific	24-401
Soluzione di formalina al 10%	Sigma	HT501128
Paraformaldeide	Microscopia elettronica	Sciences 15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Perle blu di agarosio - Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Tecnologie PBS	Life di	14190-144
Cassetta per il trattamento dei tessuti	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Processatore di tessuti Citadel 2000	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xilene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffina	McCormick Scientific	39503002
Microtomo	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Anticorpo	insulina DAKO	A0564
Anticorpo glucagone	Sigma	G2654
Fluoroshield con DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 anticorpi secondari	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 anticorpi secondari	Life technologies	A11001