Differenza di potenziale nasale per quantificare il trasporto Trans-epiteliale ionico in topi

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per misurare la differenza di potenziale nasale nei topi. Il test quantifica la funzione dei trasportatori transmembrana di ioni come il regolatore di conduttanza del transmembrane di fibrosi cistica e il canale epiteliale del sodio. È utile per valutare l'efficacia di nuove terapie per la fibrosi cistica.

Abstract

Il test di differenza potenziale nasale è stato utilizzato per quasi tre decenni per aiutare nella diagnosi di fibrosi cistica (CF). Ha dimostrato di essere utile nei casi di attenuato, forme oligo - o mono-sintomatici di CF solitamente diagnosticata tardi nella vita e dei disordini da CF come assenza congenita bilaterale dei vasi deferenti, pancreatite cronica idiopatica, allergica aspergillosi broncopolmonare e bronchiectasie. Nelle impostazioni sia cliniche e precliniche, il test è stato utilizzato come biomarcatore per quantificare le risposte di strategie terapeutiche mirate per adattamento cfr la prova di un mouse è impegnativo e può comportare una mortalità associata. Questo articolo descrive la profondità adeguata dell'anestesia necessaria per mantenere un catetere nasale in situ per la perfusione continua. Esso elenca le misure per evitare la Bronco-aspirazione di soluzioni irrorati nel naso. Descrive anche la cura degli animali alla fine del test, inclusa l'amministrazione di una combinazione di antidoti dei farmaci anestetici, che conduce rapidamente invertendo l'anestesia con il recupero completo degli animali. Dati rappresentativi ottenuti da un CF e uno spettacolo di selvaggio-tipo mouse che il test discrimina tra CF e non CF. Complessivamente, il protocollo qui descritto consente misurazioni affidabili della condizione funzionale di trasportatori trans-epiteliale di cloruro e sodio nei topi di respirare spontaneamente, nonché prove multiple nello stesso animale, riducendo relative ai test mortalità.

Introduction

Per quasi tre decenni, electrical potenziali misure di differenza (PD) sono state utilizzate per valutare lo stato funzionale dei trasportatori ionici transmembrana espressa a mucosa nasale, come rappresentante del vie aeree distali¹. Come una dinamica multistep prova^2,3, nasale PD consente una dissezione funzionale del regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) ed epiteliale del sodio (ENaC) canale attività, entrambi localizzati alle membrane apicali di le cellule epiteliali ed esercitare ruoli critici in idratazione superficiale della via aerea. Le principale a....

Protocol

Gli studi e le procedure sono state approvate dal comitato etico per la ricerca sugli animali dell'UCL (2017/UCL/MD/015) e in accordo con le normative della Comunità europea per l'uso di animali nella ricerca (CEE n ° 86/609). Gli investigatori sono qualificati per la sperimentazione animale seguendo la direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010 sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.

1. pre-test di valutazione e gestione

1. Preparare il catetere a doppio lume nasale.
   Nota: Un catetere nasale è fatto come un tubo capillare di doppio lume, un lume viene utilizzato per la....

Results

Al fine di illustrare le anomalie del trasporto di ioni caratteristici in CF, nasale PD sono state effettuate seguendo il protocollo descritto in precedenza in un mouse F508del-CF e in un controllo di tipo selvatico del background genetico FVB/129 dalla colonia di Bruxelles CFTR^tm1Eur topi³⁰. Questo modello clinicamente rilevante, che harboring il più comune e uno dei più gravi F508del-CFTR mutazione^23,

Discussion

Lo scopo di questa carta è di descrivere un protocollo adeguato per misurare nasale PD sotto perfusione continua di soluzioni nei topi di respirare spontaneamente per un periodo di tempo necessario per verificare l'integrità dei trasportatori di ioni, principalmente CFTR ed ENaC. Tutti i passaggi del protocollo sono stati attentamente ottimizzati per garantire il recupero pieno animale e buona qualità e dati riproducibili. In particolari, critici i passaggi sono valutazione di anestesia e gestione adeguata posizione anim.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo in polietilene Portex	Smiths Medical, Hythe, Kent, Inghilterra CT21 6JL	Portex 800/100/500; 2,0 mm ID, 3,0 mmOD	per preparare tubi capillari per sonda nasale
Crema per elettrodi	Parker, Fairfield, NJ, USA	Crema Redux	per costruire ponti elettrodici
Elettrodi Ag/AgCl	Biomedical, Clinton Township, MI, USA	JNS BNT131-1,0	elettrodi di misura e di riferimento
amiloride cloridrato	Sigma, St Louis, MI, USA	A7410	per preparare soluzioni
forskolin	Sigma, St Louis, MI, USA	F6886	per preparare soluzioni di perfusione
Knick Portamess voltmetro	Elektronisch Meβ gerä te, Berlino, Germania	Portavo 904 pH	per misurare la differenza di potenziale
Software Paraly SW 112	Elektronisch Meβ gerä te, Berlino, Germania	Software Paraly SW112	per acquisire dati sulla differenza di potenziale
midazolam	Mylan, Hoeilaart, Belgio	Dormicum 15mg/3ml	per servire come anestetico premedicazione
fentanyl	Janssen Cilag, Berchem, Belgio	Fentanyl-Janssen 0,05 mg/ml	per servire come farmaco anestetico
medetomidina	Orion Pharma, Espoo, Finlandia	Domitor 1 mg/ml	per servire come farmaco anestetico
droperidolo	Janssen  Cilag, Berchem, Belgio	Deidrobenzperidolo 2,5 mg / ml	per servire come farmaco anestetico
clonidina	Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germania	Catapressan 0,15 mg/ml,	per fungere da farmaco anestetico
di riferimento Catetere IV	Becton Dickinson, Sandy, UT, USA	24 GA x 0,75 IN, BD Insyte-W	per costruire ponti di elettrodi
pinze	Fine science Tools, Heidelberg, Germania	Dumont #5, Fine science Tools	per posizionare il catetere nasale
naloxone	Braun Medical, Bruxelles, Belgio	Narcan, 0,4 mg/ml	per fungere da antagonista anestetico
atipamezolo	Zoetis, Bloomberg, Belgio	Antisedan, 5 mg/ml	per fungere da antidoto specifico per medetomedina
Termofori	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm	per evitare l'ipotermia durante e dopo il test
Pompa peristaltica P1	GE Life Sciences, Uppsala, Svezia	18111091	per perfondere soluzioni nel naso di topo
colla cianoacrilica	Loctite, Henkel, Dü sseldorf, Germania	super colla 3	per incollare insieme due tubi capillari  per sonda nasale
NaCl	Sigma, St Louis, MI, USA	RES0926S-A7	Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O	Sigma, St Louis, MI, USA	M7304	Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O	Sigma, St Louis, MI, USA	1551128	Pharma-Grade, USP
K2HPO4	Sigma, St Louis, MI, USA	1551139	Grado farmaceutico, USP
Na gluconato	Sigma, St Louis, MI, USA	S2054	Grado farmaceutico, USP
Ca gluconato	Sigma, St Louis, MI, USA	C8231	Grado farmaceutico, USP
MgSO4.7H2O	Sigma, St Louis, MI, USA	RES0089M-A7	Grado farmaceutico, USP
BD ago	Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA	BD 26G (0,45x10 mm)	iniezione intraperitoneale