Un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per determinare la temperatura ambientale preferita delle larve di Drosophila utilizzando un gradiente termico continuo.

Abstract

Molti animali, tra cui la Mosca della frutta, Drosophila melanogaster, sono in grado di discriminare minuscole differenze nella temperatura ambientale, che permette loro di cercare il loro paesaggio termale preferito. Per definire le preferenze di temperatura delle larve in un definito intervallo lineare, abbiamo sviluppato un'analisi usando un gradiente di temperatura. Per stabilire un gradiente di singolo-direzionale, due blocchi di alluminio sono collegati ai bagni di acqua indipendenti, ognuno dei quali controlla la temperatura dei singoli blocchi. I due blocchi impostare i limiti superiori e inferiori della sfumatura. Il gradiente di temperatura viene stabilito dall'immissione una piastra di alluminio rivestite su agarosio sopra i due blocchi d'acqua controllato in modo che la piastra si estende la distanza tra di loro. Le estremità della piastra in alluminio che è situato in cima ai blocchi d'acqua definisce le temperature minime e massime, e le regioni-tra i due blocchi formano una sfumatura lineare di temperatura. Il dosaggio di sfumato può essere applicato alle larve di diversa età e può essere utilizzato per identificare i mutanti che presentano fenotipi, come quelli con mutazioni a carico di geni che codificano per canali TRP e opsine, che sono necessari per la discriminazione di temperatura.

Introduzione

Termotassi sono impiegato dagli animali mobili per selezionare un ambiente con condizioni più favorevoli^1,2,3. Se il clima è troppo caldo o troppo freddo, questo comportamento è vitale per la sopravvivenza. Inoltre, molti animali sono sensibili alle differenze molto piccole di temperatura nella gamma confortevole e cercano un ambiente con una temperatura ideale. Questo è di particolare importanza per gli organismi pecilotermi come mosche della frutta, che equilibrare la loro temperatura corporea con l'ambiente. Saggi per monitorare termotassi larvali sono stati strumentali nell'individuare e chiarire i ruoli di sensori molecolari come Drosophila transitoria potenziale del ricevitore (TRP) canali^4,5,6, Rhodopsins^7,8e ionotropici recettore recettori (IRs)⁹, che dotare questi animali con le sensibilità di temperatura negli intervalli di temperatura diversi.

Un test a scelta a due vie fornisce un approccio per lo studio termiche preferenze in larve^6,7. L'analisi comporta che istituisce due zone di temperatura distinte e permette agli animali di selezionare un lato rispetto a altro. I risultati dalle prove di scelta bidirezionale possono essere robusti, soprattutto se le differenze di temperatura tra le due opzioni sono grandi. Inoltre, poiché ogni dosaggio comporta tabulando solo due gruppi, i dati possono essere espresso come un indice semplice preferenza. La facilità e la semplicità di analisi scelta bidirezionale sono anche suscettibili di schermi genetici. Tuttavia, una limitazione importante è che molti esperimenti sono necessari per stabilire la temperatura preferita degli animali wild-type o mutanti.

Un'analisi di gradiente offre la possibilità di stabilire la temperatura preferita in una sola analisi⁸. Inoltre, a differenza del test a scelta a due vie, permette la valutazione della distribuzione di un gruppo di animali, quando si confronta con una serie continua di temperature. Un gradiente test utilizza una capsula di Petri e singoli animali ed è adatto per caratterizzare il comportamento dettagliato dei singoli animali¹⁰. Tuttavia, poiché le capsule di Petri sono rotondi, le dimensioni delle zone di temperatura variano e sono progressivamente più piccole a seconda della distanza dal centro. Pertanto, questa configurazione non è ideale per monitorare le selezioni di temperatura delle popolazioni di animali.

Un apparato di gradiente termico continuo che ben si adatta per valutare le preferenze di temperatura dei gruppi delle larve impiega un'arena rettangolare ed è descritto qui. L'apparato è semplice da costruire e assemblare. Inoltre, la sfumatura è lineare ed è flessibile in quanto può essere utilizzato per valutare la termotassi sopra ampi range di temperatura da 10 ° C a 42 ° C. Il dosaggio è rapido e semplice da eseguire e produce dati riproducibili. Oltre a segnalare la temperatura favorita delle larve, rivela le preferenze della popolazione degli animali nel corso di un'intera gamma lineare in un singolo esperimento. A causa di questi vantaggi, è una scelta eccellente per l'identificazione dei geni richiesti per la termotassi.

Protocollo

1. le attrezzature fabbricazione e montaggio apparecchi per analisi di gradienti

1. Fabbricare le piastre di dosaggio di alluminio per il dosaggio di gradiente unidirezionale.
   1. Tagliare e frantumare ogni piatto di dosaggio di alluminio (Figura 1A) da un unico pezzo di alluminio utilizzando una sega a nastro e taglienti mulino verticale con le seguenti dimensioni: la dimensione esterna è 140 x 100 x 9 mm e la dimensione interna è 130 x 90 x 8 mm (Figura 1B). Anodizzano all'interno di ciascuna piastra di dosaggio con vernice nera per renderlo più facile per visualizzare le larve e prevenire la ruggine.
      Nota: Fabbricazione delle piastre di dosaggio di alluminio per la sfumatura di unidirezionale è fatto da un negozio di macchina. L'anodizzazione è eseguita da un fornitore commerciale.
   2. Contrassegnare i bordi superiori e inferiori di ciascuna piastra di dosaggio con 13 delimitazioni, separate da 10 mm usando un pennarello indelebile. Posizionare il prime e l'ultima delimitazioni 5 mm dal bordo interno delle piastre di dosaggio (Figura 1A, B).
2. Per realizzare la piastra di dosaggio di alluminio per la sfumatura di bidirezionale, tagliare una lastra di alluminio con le seguenti dimensioni usando le cesoie lamiera: 250 x 220 x 2 mm. Anodizzi le piastre di dosaggio con vernice nera.
   Nota: Fabbricazione delle piastre di dosaggio di alluminio per le pendenze bidirezionale viene eseguita da un negozio di macchina. L'anodizzazione è fatto da un fornitore commerciale.
3. Fabbricare i blocchi di alluminio.
   Nota: Due blocchi sono necessari per la sfumatura di unidirezionale e tre blocchi sono necessari per la sfumatura di bidirezionale.
   1. Tagliare i blocchi di alluminio (Figura 1) da un unico pezzo di alluminio utilizzando una sega a nastro (dimensioni 50 x 255 x 14 mm) (Figura 1, D).
   2. Trapano il canale di acqua all'interno del blocco (7 mm di diametro) utilizzando un mulino verticale e scanalature di thread nelle estremità aperte su un lato (Figura 1). Chiudere i fori scanalati con bulloni e nastro sigillante per filettature di formare un canale di acqua a forma di U (Figura 1, D).
      Nota: La realizzazione dei blocchi di dosaggio di alluminio viene eseguita da un negozio di macchina.
   3. Fissare il connettore del blocco di alluminio (Figura 1) con viti filettate e nastro ad una estremità della guarnizione del filo. Inserire l'altra estremità con barbe multiple (ID 1/4" x 3/8" diametro x 1/16" parete) di tubo in silicone.
4. Ottenere due bagni circolanti refrigerata/riscaldata.
5. Assemblare i blocchi a temperatura controllata per il sistema di dosaggio gradiente.
   1. Per il gradiente unidirezionale collegare ciascuno dei due blocchi di alluminio a bagno d'acqua separata affinché la temperatura di ogni blocco è controllata da un indipendente acqua circolante sistema (Figura 2A). Utilizzare tubi in silicone (ID 1/4" x 3/8" diametro x parete 1/16") per collegare l'uscita del bagno d'acqua con il connettore sul lato interno del blocco in alluminio (Figura 2A). Inoltre, è possibile utilizzare tubi per collegare il connettore lato esterno sul blocco di alluminio all'ingresso del bagno d'acqua.
   2. Per la sfumatura di bidirezionale, posto due dei tre blocchi in basso a sinistra e a destra del piatto e collegarli a bagno d'acqua stessa con il tubo (Figura 2B). Collegare il terzo blocco di alluminio per un secondo bagno di acqua e posto sotto il centro della piastra (Figura 2B).
      Nota: Questo apparato e test sono necessari solo se le larve si accumulano nella zona a uno bordo o l'altro della sfumatura unidirezionale. Se è così, è importante valutare se o non c'è un effetto di bordo. Per verificare questa possibilità, stabilire un gradiente di bidirezionale in cui la temperatura della zona bordo preferita dalle larve usando il gradiente unidirezionale (es. 18 ° C) è la temperatura al centro del piatto della sfumatura bidirezionale (Figura 3E , F).

2. larvale sincronizzazione

1. Nutrire mosche da utilizzarsi per la deposizione delle uova.
   1. Granuli di lievito mix e acqua distillata con un pestello per fare il lievito pasta. Accuratamente macinare e mescolare fino a quando la consistenza della pasta è simile al burro di arachidi. Evitare pasta eccessivamente secca, che potrebbe sfaldarsi durante il trasferimento di mosche al freschi fiale, o bagnato pasta, che potrebbe intercettare le mosche.
   2. Con un pestello, aggiungere la pasta di lievito vicino alle pareti interne dei flaconi di Drosophila , appena sopra la superficie del cibo.
   3. Le femmine totali 12-35 e fino a metà come molti maschi (ma non più di 10) su un tappetino di CO₂ e aggiungere le femmine e i maschi per ogni flaconcino contenente pasta di lievito.
   4. Per mantenere al volo il cibo con la pasta di lievito in umido, mentre le mosche si nutrono, combinare queste fiale in un vassoio che contiene fino a 100 fiale con 20 fiale aperte contenente solo acqua distillata. Riporlo in un sacchetto di plastica trasparente e guarnizione.
   5. Incubare la piastra in un incubatore a 25 ° C per 48 h in modo che le femmine sono nutrite adeguatamente, consentendo loro di disporre di un numero elevato di uova.
2. Impostare fiale per la deposizione delle uova.
   1. Trasferire le mosche nutrite in nuovo cibo fiale per la raccolta di uova toccando loro sopra. Non utilizzare CO_2, che può causare le mosche a deporre le uova meno la seguente finestra di breve periodo di tempo.
      Nota: Fiale cibo Standard Drosophila sono utilizzati senza lievito pasta per la raccolta delle uova.
   2. Consentire le mosche a deporre le uova per 3 h a 25 ° C affinché tutte le uova sono raccolti nel corso di un intervallo di tempo relativamente stretta.
      Nota: Ciò consentirà alle larve di essere sincronizzati nella stessa fase inerente allo sviluppo.
   3. Posizionare le fiale che contengono le uova nel vassoio contenente le fiale di acqua e stringere la borsa. Incubare a 25 ° C sotto luce: 12 h 12 h cicli scuri.
   4. Età le larve per un determinato numero di ore dopo la deposizione delle uova (AEL) a seconda dello stadio larvale desiderato.
      Nota: Nella tabella 1 è una stima del rapporto tra le ore AEL e lo stadio larvale, che varia a seconda il brodo volo, alimento usato, allevamento temperatura ecc il rapporto preciso fra AEL e Stadio di sviluppo deve essere verificato da ciascun investigatore utilizzando criteri fisici, quali la morfologia della bocca ganci e spiracoli¹¹.

3. installazione gradiente di temperatura

1. Preparare la sfumatura unidirezionale
   1. Per creare un ambiente ambiente umido durante le analisi, posizionare i due blocchi di alluminio collegati a due bagni su tovaglioli di carta bagnati, separate da 10 cm (Figura 2A).
   2. Accendere i due bagni ~ 2 h prima di iniziare il dosaggio per consentire tempo sufficiente per la temperatura di blocchi di alluminio per equilibrare.
      Nota: Si consiglia di eseguire un esperimento di simulazione per determinare la temperatura di ogni bagno di acqua che è necessario per raggiungere la desiderata sfumatura lineare di temperatura. Alcune coppie di temperatura tipica per impostare l'acqua dei bagni sono elencate nella tabella 2. Si noti tuttavia che le temperature di superficie sono interessate dalla temperatura ambientale. La lunghezza dei tubi anche colpisce le temperature come c'è il raffreddamento nei tubi. La lunghezza della tubazione nel nostro setup è 1,5 m.
   3. Forno a microonde 100 mL di agarosio all'1% l'impostazione ad alta potenza in un 500 mL bottiglia bocca larga e versare 25 mL/piastra su un benchtop livello di analisi. Preparare due piastre di dosaggio, che possono essere posizionati sui blocchi di alluminio allo stesso tempo (Figura 2A).
   4. Dopo l'agarosio è solidificato (10-20 min), strofinare delicatamente ogni superficie di agarosio con una spugna da cucina standard o una spugna di melamina per rendere la superficie dell'agarosi leggermente grossolana, così che quando si spruzza acqua sul gel dell'agarosi, verrà creata una membrana liscia e sottile dell'acqua, e non le goccioline di acqua si formano.
   5. Immergere completamente le piastre in un contenitore con acqua distillata fino a quando il dosaggio è pronto per essere eseguita per impedire che le piastre ottenendo essiccata.
2. Preparare una sfumatura bidirezionale (opzionale)
   1. Per creare un ambiente ambiente umido durante le analisi, è possibile inserire tre blocchi di alluminio 8 cm di distanza (Figura 2B) su tovaglioli di carta bagnati.
   2. Accendere i due bagni ~ 2 h prima di iniziare il dosaggio per consentire tempo sufficiente per la temperatura di blocchi di alluminio per equilibrare.
      Nota: Si consiglia di eseguire un esperimento di simulazione per determinare la temperatura di ogni vasca di acqua per la sfumatura di bidirezionale. Alcune coppie di temperatura tipica per impostare l'acqua dei bagni sono riportate nella tabella 3. Si noti tuttavia che le temperature di superficie sono interessate dalla temperatura ambientale. La lunghezza dei tubi anche colpisce le temperature come c'è il raffreddamento nei tubi. La lunghezza della tubazione nel nostro setup è 1,5 m.
   3. Per impedire la fuoriuscita della piastra di agarosio, avvolgere i bordi della piastra in alluminio con etichettatura nastro per formare un muro di 10 mm di altezza (Figura 2B).
   4. Utilizzando l'impostazione ad alta potenza, forno a microonde 200 mL di agarosio all'1% in un 500ml bottiglia bocca larga rotonda e versare 120 mL su una piastra di dosaggio.
   5. Dopo l'agarosio è solidificato (~ 30 min), strofinare delicatamente ogni superficie di agarosio con una spugna da cucina standard o una spugna di melamina per rendere la superficie di agarosio leggermente grossolana, in modo che quando si spruzza acqua sul gel dell'agarosi, viene creata una membrana liscia sottile acqua e no forma di goccioline di acqua.
   6. Immergere completamente le piastre di dosaggio in un contenitore con acqua distillata fino a quando il dosaggio è pronto per essere eseguita per impedire loro di seccarsi.
3. Impostare la sfumatura unidirezionale
   1. Preparare i reagenti e gli elementi su una panchina accanto l'apparato di analisi gradiente (Vedi la Tabella materiali).
   2. Per promuovere il trasferimento di temperatura efficiente, riempire eventuali spazi vuoti tra i blocchi di alluminio e le piastre di dosaggio spruzzando acqua all'interfaccia tra i blocchi e la piastra.
   3. Utilizzando guanti, rimuovere le piastre di dosaggio dal contenitore dell'acqua. Se acqua invade tra il gel di agarosio e la piastra e provoca urti alla forma sulla superficie, rimuovere l'acqua con una micropipetta P1000.
   4. Posizionare le piastre di dosaggio sui blocchi di alluminio affinché coincidano con le delimitazioni che sono 2 cm dal bordo esattamente i bordi dei blocchi di alluminio (Figura 2A, C).
   5. Spruzzare acqua sulla superficie della piastra (una membrana di acqua sottile che copre la superficie dell'agarosi è sufficiente) per impedire l'essiccazione del gel dell'agarosi. Assicurarsi che la membrana di acqua è continuo e gratuito di goccioline d'acqua, poiché le larve possono rimanere intrappolate nelle goccioline di acqua.
   6. Coprire il sistema di sfumatura con una scatola di cartone per ridurre l'evaporazione dell'acqua e contribuire a stabilizzare la temperatura della superficie del gel. Attendere 5-10 minuti consentire alla temperatura equilibrare.
   7. Controllare la temperatura superficiale a 12 punti sulla piastra (Figura 2). Prendere due misurazioni all'interno di ogni zona per stabilire o meno c'è variabilità all'interno di una zona. Assicurarsi che la temperatura in entrambi i punti è un'approssimazione di ± 0,2 ° C della temperatura desiderata.
      Nota: Variabilità all'interno di una zona si verifica in genere perché le distanze esatte dei due punti al bordo dei blocchi di alluminio non sono identiche. Regolare la posizione della piastra sui blocchi di alluminio per assicurarsi che le delimitazioni che sono 2 cm dal bordo esattamente corrispondano i bordi dei blocchi di alluminio.
   8. Se il gradiente di temperatura misurato si discosta dal gradiente desiderato, aumentare o diminuire le impostazioni di temperatura vasca acqua e ricontrollare la temperatura in superficie dopo la temperatura del bagno (s) acqua stabilize(s).
   9. Coprire il sistema di sfumatura con una scatola di cartone fino ad iniziare l'analisi.
4. Impostare sfumatura bidirezionale (opzionale)
   1. Preparare i reagenti e gli elementi su una panchina accanto l'apparato di analisi gradiente (Vedi la Tabella materiali).
   2. Spruzzi d'acqua sulle superfici dei tre blocchi di alluminio per promuovere il trasferimento di temperatura efficiente dai blocchi di alluminio per le piastre di dosaggio di riempire eventuali spazi vuoti tra le superfici.
   3. Rimuovere le piastre di dosaggio attentamente dal contenitore dell'acqua e sui blocchi di alluminio. Se l'acqua invade tra il gel di agarosio e la piastra, che potrebbe causare urti alla forma sulla superficie, rimuovere l'acqua con una micropipetta P1000.
   4. Posizionare la piastra di test sui blocchi di alluminio affinché le mediane delle zone prime e l'ultima da uno dei due bordi coincidano esattamente i bordi dei blocchi di alluminio due laterali (Figura 2B, D).
   5. Spruzzare acqua sulla superficie della piastra (una membrana di acqua sottile che copre la superficie dell'agarosi è sufficiente) per impedire l'essiccazione del gel dell'agarosi. Assicurarsi che la membrana di acqua sia continuo e privo di gocce d'acqua, poiché le larve possono rimanere intrappolate nelle goccioline di acqua.
   6. Coprire il sistema di sfumatura con una scatola di cartone per ridurre l'evaporazione dell'acqua e contribuire a stabilizzare la temperatura della superficie del gel. Attendere 5-10 minuti per consentire alla temperatura di equilibrare.
   7. Controllare la temperatura della superficie in due punti lungo la linea mediana di ognuna delle 10 zone (Figura 2D). Prendere due misurazioni all'interno di ogni zona per stabilire o meno c'è variabilità all'interno di una zona. Assicurarsi che la temperatura in entrambi i punti è un'approssimazione di ± 0,2 ° C della temperatura desiderata.
      Nota: Variabilità all'interno di una zona si verifica in genere perché le distanze esatte dei due punti al bordo dei blocchi di alluminio non sono identiche. Regolare la posizione della piastra sui blocchi di alluminio per assicurarsi che le mediane delle zone prime e l'ultima più vicina ogni bordo corrispondono esattamente i bordi dei blocchi di alluminio due laterali.
   8. Se il gradiente di temperatura misurato si discosta dal gradiente desiderato, regolare le impostazioni di temperatura vasca acqua e ricontrollare la temperatura in superficie dopo la temperatura del bagno (s) acqua stabilize(s).
   9. Coprire i blocchi con una scatola di cartone fino all'inizio del test.

4. lavaggio e raccolta larvale

1. Isolare le larve pulite (opzione 1)
   1. Aggiungere soluzione di saccarosio 18% ~ 40 mL in una provetta 50 mL. Raccogliere tutte le larve dal cibo o i flaconcini con un scoopula e trasferimento alla soluzione di saccarosio al 18%.
   2. Mescolare accuratamente, ma delicatamente utilizzando un scoopula per separare le larve da residui di cibo. Attendere per 30-60 s galleggiante larve per lo strato superiore del tubo. Versare lo strato superiore contenente le larve (~ 10 mL) ad un altro tubo da 50 mL e riempire il tubo con soluzione di saccarosio fresca 18%. Attendere per 30-60 s galleggiante larve per lo strato superiore ancora una volta.
      Nota: Le particelle di cibo grande a volte trasferire insieme a larve e possono influenzare la termotassi larvale se non vengono rimossi. Se le particelle di cibo grande rimangono nello strato superiore, ripetere i passaggi 4.1.1-4.1.2, o rimuovere manualmente mediante un scoopula.
   3. Trasferire lo strato superiore delle larve (~ 10 mL) due altre provette da 50 mL e riempire i due tubi con acqua distillata per ridurre la concentrazione di saccarosio, in modo che le larve affondano rapidamente in acqua. Attendere per 30-60 s le larve affondano sul fondo. Eseguire questo e i seguenti passaggi più rapidamente possibile per evitare che le larve dall'annegamento.
   4. Gran parte dell'acqua come possibile smaltire inclinando delicatamente i tubi. Combinare le larve in una provetta versando le larve con l'acqua rimanente e riempire il tubo con acqua distillata.
   5. Attendere per 30-60 s tutte le larve lavandino giù e rimuovere quanta più acqua possibile inclinando delicatamente i tubi. Ripetere questo passaggio di lavaggio 2 - 4 volte a completamente rimuovere saccarosio e visibile tutto il cibo.
   6. Scartare come molta acqua come possibile e trasferire le larve a un vuoto 35 mm di Petri di decantazione. Spruzzare il tubo con acqua e utilizzare un pennello piccolo per contribuire a trasferire le larve.
   7. Togliere l'acqua in eccesso di Petri utilizzando una micropipetta P1000. Lasciare ~0.5 mL di acqua per prevenire la disidratazione delle larve.
   8. Posizionare il coperchio sul piatto per impedire le larve di fuggire. Ruotare il coperchio capovolto per ridurre la capacità delle larve di fuggire attraverso il piccolo spazio tra il coperchio e piatto. Permettere alle larve di recuperare per 10-20 min.
2. Isolare le larve pulite (opzione 2)
   Nota: Questo metodo alternativo per la pulizia di larve attenua la possibilità di soffocare le larve durante la procedura di lavaggio. Per utilizzare questo metodo, procedere con i passaggi seguenti dopo aver eseguito il 4.1.1-4.1.2 passi sopra.
   1. Posizionare un filtro cella (300 µm, conserva le larve 72h AEL o più vecchi) in cima a un tubo da 50 mL.
   2. Dopo la conferma che non c'è nessun adulti corpi o i residui di cibo che galleggiano sulla superficie della soluzione di saccarosio, versare lo strato superiore contenente le larve attraverso il colino per intercettare tutte le larve sullo schermo di maglia. Lavare le larve accuratamente con acqua distillata fino a riempita il tubo da 50 mL.
   3. Rimuovere il filtro cella con le larve e smaltire l'acqua usata dal tubo. Posizionare il filtro contenente le larve in cima il tubo vuoto e lavare le larve nuovamente con acqua distillata fino a riempita il tubo da 50 mL.
   4. Capovolgere sottosopra il colino un vuoto 35 mm di Petri e spruzzare acqua dalla parte superiore del filtro cella di trasferire le larve per la capsula di Petri. Trasferire le larve rimanenti utilizzando un pennello piccolo.
   5. Continua al passo 4.1.7 sopra prima di procedere al passaggio 5.

5. analisi e calcolo

1. Rimuovere la scatola di cartone e controllare la temperatura di superficie del gel immediatamente prima di trasferire le larve alla piastra. Ridurre al minimo il tempo che la scatola di cartone è aperta per evitare di perturbare l'equilibrio di temperatura. Se la superficie è asciutta, Spruzzare una piccola quantità di acqua sulla superficie.
2. Distribuire 150 ± 50 larve vicino al centro di ogni piatto (tra le zone 3 e 4 fuori delle 6 zone) per la sfumatura di unidirezionale (zona di rilascio; Figura 2).
   Nota: Per la sfumatura di bidirezionale, distribuire 200-400 larve lungo il centro della zona di ciascuna metà (Figura 2D).
3. Mettere un coperchio di micropiastre sopra ogni piatto di dosaggio per impedire che le larve strisciando fuori. Coprire il programma di installazione con una scatola di cartone per evitare l'esposizione alla luce, che può influire sulla scelta larvale su gel di agarosio.
   Nota: Per la sfumatura di bidirezionale, dovrebbe non essere necessaria per coprire la piastra con un coperchio, perché la piastra è più grande, e la temperatura preferita delle larve è nella zona centrale. Di conseguenza, alcune larve si accumulano ai bordi e abbiano l'opportunità di strisciare fuori.
4. Consentire l'analisi di procedere per 10-30 min per la sfumatura di singolo-direzionale e per 15-35 min per la sfumatura di bidirezionale, a seconda dell'età delle larve (tabella 4).
5. Rimuovere la scatola di cartone e il coperchio di micropiastre. Fotografare le piastre dall'alto con una fotocamera digitale. Prendere due fotografie di ciascuna piastra di dosaggio in modo che lo sperimentatore può scegliere quello con migliore contrasto e luminosità per l'analisi.
6. Rimuovere tutte le larve dalle piastre di dosaggio e ovunque di fuori le piastre dall'aspirazione.
7. Pulire le piastre di dosaggio, i tubi e il filtro cella accuratamente con acqua distillata. Riutilizzare le piastre di dosaggio preparate quel giorno a meno che la superficie di agarosio è danneggiata.
8. Calcolare la distribuzione percentuale delle larve in ciascuna zona.
   1. Aprire l'immagine fotografica dei risultati del saggio utilizzando qualsiasi software che permette di aggiungere le marcature all'immagine. Per indicare le zone di dosaggio, disegnare linee verticali ogni 2 cm basato su demarcazioni sulla piastra di dosaggio.
   2. Contare il numero di larve in ciascuna zona e registrare i numeri. Non contano le larve nelle regioni 0,5 cm da qualsiasi delle pareti. Il gel è più spesso vicino alle mura, e le temperature di superficie non sono lineari in queste regioni.
   3. Per il gradiente unidirezionale, calcolare la distribuzione percentuale in ciascuna zona come segue:
      (numero di larve in una determinata zona di 2 cm) / (numero totale delle larve in 6 zone) x 100.
   4. Per il gradiente di bidirezionale, calcolare la distribuzione percentuale in ciascuna zona come segue:
      (numero di larve in una determinata zona di 2 cm) / (numero totale delle larve in 5 zone su ciascun lato della sfumatura) x 100.

Risultati

Per stabilire un singolo 18 ° C - 28 ° C-direzionale gradienti, abbiamo impostato le temperature dei due bagni a 16,8 ° C e 31 ° C. Otteniamo le temperature a 13 punti misurando la temperatura a 26 posizioni all'interno di porzioni superiore ed inferiore di tutte le 6 zone, le linee di confine tra le zone e alle estremità della superficie del gel di agarosio (Figura 2, 2E). La distribuzione di temperatura lungo il gradiente era quasi lineare ...

Discussione

Per garantire il successo di questo protocollo, è importante adottare misure per ottenere un numero adeguato di larve per eseguire gli esperimenti. Questi includono pre-alimentazione le mosche in flaconcini contenenti pasta di lievito per 2-3 d migliorare la deposizione delle uova. I flaconcini devono essere collocati in una vaschetta contenente acqua fiale e racchiuso in un sacchetto di plastica trasparente, che mantiene l'umidità del cibo e promuove l'alimentazione efficace dalle larve permettendo l'esposizione a cicli...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Apparecchio per saggi a gradiente
PolyScience 9106, Bagno circolante refrigerato/riscaldato da 6 litri	Thomas Scientific	9106	Questo modello è fuori produzione. I modelli sostitutivi aggiornati includono: 1186R00 e 1197U04 per 120 V, 60 Hz, o 1184L08 e 1197U04 per 240 V, 50 Hz.
Piastra di analisi in alluminio (per gradiente unidirezionale)			Dimensioni esterne: 14 x 10,1 x 0,9 cm, dimensioni interne: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodizzato nero.
Piastra in alluminio (per gradiente bidirezionale)			25 x 22 x 0,2 cm, anodizzata nera.
Dimensioni			esterne: 25,5 x 5 x 1,4 cm, i parametri dei canali interni sono mostrati nella Figura 1D.
Connettore per blocchi e tubi in alluminio	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Tubi in silicone sanitario	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Articoli e reagenti per assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestello per provette da microcentrifuga da 1,5 mL
Termometro	Fluke	51II
Termocoppia	Fluke	tipo
Coperchio universale per micropiastre	Corning	6980A77
piatto da 35 mm	Corning	9380D40
Nastro per etichettatura (per gradiente bidirezionale)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand Nastro per etichettatura 2 pollici x 14 yds
Agarosio	Invitrogen	Preparare una soluzione all'1%
Saccarosio	Sigma	S0389-5KG	Preparare una soluzione al 18% subito prima di iniziare il test
Pennello	Fisher Scientific	11860
Provette	da centrifuga da 50 mlDenville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL flacone rotondo a bocca larga	Pyrex	1395-500
Filtro cellulare (poro 300 mm)	PluriSelect	43-50300	Articolo opzionale per il lavaggio delle larve
Scatola di cartone (vassoio per fiale)	Genesee Scientific	FS32-124
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Drosophila food
Acqua			22.400 ml
Farina di mais, gialla (maglia extra fine, floccata) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1.609 g
Lievito di birra 100 libbre	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® Farina di soia (10 kg/unità)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila Agar, Tipo II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
Sciroppo di mais leggero Karo	Karo		1.700 mL
Metil 4-idrossibenzoato (sospendere in etanolo 200 proof)	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Acido propionico puriss. p.a., >99,5% (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
Acido fosforico  Reagente ACS, ≥ 85 % in peso in H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL	8,5 mL