Qui, presentiamo un protocollo per determinare la temperatura ambientale preferita delle larve di Drosophila utilizzando un gradiente termico continuo.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti animali, tra cui la Mosca della frutta, Drosophila melanogaster, sono in grado di discriminare minuscole differenze nella temperatura ambientale, che permette loro di cercare il loro paesaggio termale preferito. Per definire le preferenze di temperatura delle larve in un definito intervallo lineare, abbiamo sviluppato un'analisi usando un gradiente di temperatura. Per stabilire un gradiente di singolo-direzionale, due blocchi di alluminio sono collegati ai bagni di acqua indipendenti, ognuno dei quali controlla la temperatura dei singoli blocchi. I due blocchi impostare i limiti superiori e inferiori della sfumatura. Il gradiente di temperatura viene stabilito dall'immissione una piastra di alluminio rivestite su agarosio sopra i due blocchi d'acqua controllato in modo che la piastra si estende la distanza tra di loro. Le estremità della piastra in alluminio che è situato in cima ai blocchi d'acqua definisce le temperature minime e massime, e le regioni-tra i due blocchi formano una sfumatura lineare di temperatura. Il dosaggio di sfumato può essere applicato alle larve di diversa età e può essere utilizzato per identificare i mutanti che presentano fenotipi, come quelli con mutazioni a carico di geni che codificano per canali TRP e opsine, che sono necessari per la discriminazione di temperatura.
Introduzione
Termotassi sono impiegato dagli animali mobili per selezionare un ambiente con condizioni più favorevoli1,2,3. Se il clima è troppo caldo o troppo freddo, questo comportamento è vitale per la sopravvivenza. Inoltre, molti animali sono sensibili alle differenze molto piccole di temperatura nella gamma confortevole e cercano un ambiente con una temperatura ideale. Questo è di particolare importanza per gli organismi pecilotermi come mosche della frutta, che equilibrare la loro temperatura corporea con l'ambiente. Saggi per monitorare termotassi larvali sono stati strumentali ne....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. le attrezzature fabbricazione e montaggio apparecchi per analisi di gradienti
- Fabbricare le piastre di dosaggio di alluminio per il dosaggio di gradiente unidirezionale.
- Tagliare e frantumare ogni piatto di dosaggio di alluminio (Figura 1A) da un unico pezzo di alluminio utilizzando una sega a nastro e taglienti mulino verticale con le seguenti dimensioni: la dimensione esterna è 140 x 100 x 9 mm e la dimensione interna è 130 x 90 x 8 mm (Figura 1B). Anodizzano all'interno di ciascuna piastra di dosaggio con vernice nera per renderlo più facile per visualizzare le larve e prevenire la rug....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Per stabilire un singolo 18 ° C - 28 ° C-direzionale gradienti, abbiamo impostato le temperature dei due bagni a 16,8 ° C e 31 ° C. Otteniamo le temperature a 13 punti misurando la temperatura a 26 posizioni all'interno di porzioni superiore ed inferiore di tutte le 6 zone, le linee di confine tra le zone e alle estremità della superficie del gel di agarosio (Figura 2, 2E). La distribuzione di temperatura lungo il gradiente era quasi lineare .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Per garantire il successo di questo protocollo, è importante adottare misure per ottenere un numero adeguato di larve per eseguire gli esperimenti. Questi includono pre-alimentazione le mosche in flaconcini contenenti pasta di lievito per 2-3 d migliorare la deposizione delle uova. I flaconcini devono essere collocati in una vaschetta contenente acqua fiale e racchiuso in un sacchetto di plastica trasparente, che mantiene l'umidità del cibo e promuove l'alimentazione efficace dalle larve permettendo l'esposizione a cicli.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
C.M. è supportato da finanziamenti da nia (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) e il NIAID (1DP1AI124453).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Apparecchio per saggi a gradiente | |||
| PolyScience 9106, Bagno circolante refrigerato/riscaldato da 6 litri | Thomas Scientific | 9106 | Questo modello è fuori produzione. I modelli sostitutivi aggiornati includono: 1186R00 e 1197U04 per 120 V, 60 Hz, o 1184L08 e 1197U04 per 240 V, 50 Hz. |
| Piastra di analisi in alluminio (per gradiente unidirezionale) | Dimensioni esterne: 14 x 10,1 x 0,9 cm, dimensioni interne: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodizzato nero. | ||
| Piastra in alluminio (per gradiente bidirezionale) | 25 x 22 x 0,2 cm, anodizzata nera. | ||
| Dimensioni | esterne: 25,5 x 5 x 1,4 cm, i parametri dei canali interni sono mostrati nella Figura 1D. | ||
| Connettore per blocchi e tubi in alluminio | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Tubi in silicone sanitario | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Articoli e reagenti per assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestello per provette da microcentrifuga da 1,5 mL |
| Termometro | Fluke | 51II | |
| Termocoppia | Fluke | tipo | |
| Coperchio universale per micropiastre | Corning | 6980A77 | |
| piatto da 35 mm | Corning | 9380D40 | |
| Nastro per etichettatura (per gradiente bidirezionale) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand Nastro per etichettatura 2 pollici x 14 yds |
| Agarosio | Invitrogen | Preparare una soluzione all'1% | |
| Saccarosio | Sigma | S0389-5KG | Preparare una soluzione al 18% subito prima di iniziare il test |
| Pennello | Fisher Scientific | 11860 | |
| Provette | da centrifuga da 50 mlDenville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL flacone rotondo a bocca larga | Pyrex | 1395-500 | |
| Filtro cellulare (poro 300 mm) | PluriSelect | 43-50300 | Articolo opzionale per il lavaggio delle larve |
| Scatola di cartone (vassoio per fiale) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Drosophila food | |||
| Acqua | 22.400 ml | ||
| Farina di mais, gialla (maglia extra fine, floccata) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1.609 g |
| Lievito di birra 100 libbre | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Farina di soia (10 kg/unità) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Tipo II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Sciroppo di mais leggero Karo | Karo | 1.700 mL | |
| Metil 4-idrossibenzoato (sospendere in etanolo 200 proof) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Acido propionico puriss. p.a., >99,5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Acido fosforico Reagente ACS, ≥ 85 % in peso in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8,5 mL |
Riferimenti
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B.....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
