Method Article

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.

Abstract

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La microscopia di fluorescenza ha fatto grandi contributi nella dissezione dei meccanismi di complessi processi biologici a livello di singola molecola. Nelle analisi di singola molecola per lo studio delle interazioni DNA-proteina, ci sono due fattori importanti da considerare: il substrato di DNA con una lunghezza sufficiente per l'osservazione facile ed etichettatura una proteina con una sonda fluorescente adatta. 48,5 kb λ DNA è un buon candidato per il substrato del DNA. Punti quantici (QDot), come una classe di sonde fluorescenti, consentono l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini di alta qualità. In questa carta, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina a livello di singola molecola, che comprende preparando un λ site-specifically modificate del DNA e l'etichettatura di una proteina bersaglio con QDot rivestite con streptavidina. Per un proof of concept, scegliamo ORC (riconoscimento di origine complessa) nel lievito gemmante come una proteina di interesse e visualizzare la sua interazione con un ARS (sequenza autonomamente replica) utilizzando TIRFM. Rispetto ad altre sonde fluorescenti, QDot hanno evidenti vantaggi negli studi di singola molecola a causa della sua elevata stabilità contro photobleaching, ma va notato che questa proprietà limita la sua applicazione in analisi quantitative.

Introduction

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Interazioni tra DNA e proteine sono essenziali per molti processi biologici complessi, come ad esempio la replicazione del DNA, riparazione del DNA e trascrizione. Anche se gli approcci convenzionali hanno fatto luce sulle proprietà di questi processi, molti meccanismi chiave sono ancora poco chiare. Recentemente, con le tecniche di singola molecola in rapido sviluppo, alcuni dei meccanismi sono stati indirizzati1,2,3.

L'applicazione di microscopia di fluorescenza di singola molecola sulla visualizzazione interazioni proteina-DNA in tempo reale pri....

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Protocol

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1. preparazione del substrato di DNA λ-ARS317

  1. Imballaggio e la costruzione di DNA substrato
    1. Digerire DNA nativo λ usando Xhoio enzima; amplificare un 543 cuscinetto del frammento del DNA bp ARS317 dal DNA genomico di germogliamento lievito usando i primer contenenti 20 bp omologa sequenze di upstream e downstream di Xhoio sito enzima DNA di lambda. Aggiungere 100 ng di Xhoho digerito il DNA λ e 10 ng di DNA frammento a 10 µ l di sistema di reazione di ricombinazione omologa e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.
    2. Per assemblare il DNA di λ di ricombinazione, aggiungere 25 µ l di lambda imballaggio estratti ne....

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Results

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Per visualizzare l'interazione tra Qdot-labeled ORC e l'ARS, abbiamo costruito il substrato di DNA λ-ARS317. Un frammento di DNA che contiene ARS317 è stato integrato in XhoI sito (33,5 kb) del DNA nativo λ di ricombinazione omologa (Figura 1A). Il prodotto di ricombinazione è stato confezionato usando gli estratti e le particelle dei fagi confezionati sono state coltivate su piastre LB (Figura 1B). La placca positiva de.......

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Discussion

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Qui, presentiamo un protocollo per osservare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate utilizzando il TIRFM in una cella di flusso. I passi necessari sono site-specific modificazione del substrato di DNA, DNA biotinylation, pulizia vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, preparazione di cella di flusso e imaging singola molecola. Ci sono due punti chiave che dovrebbero essere notati. Innanzitutto, tutti i passaggi con λ DNA devono essere manipolati delicatamente per ridurre eventu.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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Si ringraziano il Dr. Hasan Yardimci e Dr.Sevim Yardimci dell'Istituto Francis Crick per tipo aiutare negli esperimenti singola molecola, Dr. Daniel Duzdevich dal laboratorio del Dr. Eric C. Greene della Columbia University, Dr. Yujie Sun della Peking University e Dr. Chunlai Chen di Tsinghua University per utile discussione. Questo studio è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation della Cina 31371264, 31401059, CAS Team di innovazione interdisciplinare e la Newton Advanced Fellowship (NA140085) dalla Royal Society.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lambda DNANew England BiolabsN3011Negozio 25 μ L aliquote a -20 ºC.
XhoI enzimaThermo Fisher ScientificFD0694
Kit di clonazione a fusione rapidaBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Confezione Estratti		EpicentreMP5110Ceppo batterico LE392MP
è incluso in questa confezione.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013092Qualsiasi marca è accettabile.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical worksN/A Qualsiasimarca è accettabile.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012818
CloroformioBeijing Chemical worksN/A Qualsiasimarca è accettabile.
NZ-amminaAmrescoJ853-250G
Acidi casaminoSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Apparecchio di agitazione magneticoIKAKMO2 basic
15 mL Eppendorf tubo Eppendorf3012215115 mL, sterile, sfuso, 500pz
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinasi KAmresco0706-100MG
Primer biotinilatiThermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA ligasi, T4 DNA ligasi, tampone di reazione (10x)New England BiolabsM0202
Vetrino coprioggettiThermo Fisher Scientific22266882
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009259
Idrossido di potassio (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcetoneThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80120891acido solforico
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001121830% Perossido di idrogeno
MetanoloSigma-Aldrich322415-2L
Acido aceticoSigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(metossi-polietilenglicole)		LysanmPEG-SVA-5000
biotina-PEG
(biotina-polietilenglicole)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Essiccatore sottovuotoTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Sigillatrice sottovuotoMAGIC SEALWP300
Scriba in vetro con punta di diamanteSCIENZE DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA70036
Vetrino scorrevoleVela Marca7101
Tubo di ingressoSCI (Scientific Commodities INC.)BB31695-PE/2diametro interno 0,38 mm; diametro esterno 1,09 mm.
Tubo di uscitaSCI (Scientific Commodities INC.)BB31695-PE/4diametro interno 0,76 mm; diametro esterno 1,22 mm.
Nastro biadesivoSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpossidicoLEAFTOP9005cinque minuti epossidico
StreptavidinSigma-AldrichS4762
Microscopio a fluorescenzaOlympusIX71
Infusione/prelievo
pompa programmabile		Apparecchio Harvard70-4504
Laser a 532 nmLaser coerenteSapphire-532-50
640 nmFotocameraOBIS-640-100
EMCCDAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
ottica di scissione		Hamamatsu fotonica K.K.A12801-01
Sistema di illuminazione TIRFOlympusIX2-RFAEVA2
60× Obiettivo TIRFOlympusAPON60XOTIRF
Beamsplitter laser dicroico
quad-edge		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Filtro passa-banda quad-bandSemrockFF01-446/510/
581/703-25
Dicroic beamsplitterSemrockFF649-Di01-25x36
Filtro di emissioneChroma Technology CorpET585/65m
Filtro di emissioneChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck fluorescenza, vetrino di prova per microscopio #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin ConiugatoThermo Fisher Scientific Q10163MPStore a 4 º C, non congelare.
ATPAmresco0220-25GPreparare 200 mM di soluzione ATP, utilizzando ddH2O, regolare il pH a 7,0 e conservare 10 μ L aliquote a -20 ºC.
DTTAmrescoM109-5GPreparare la soluzione 1 M utilizzando ddH2O e conservare 10 μ l aliquote a -20 ºC.
coerente

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

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Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

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