Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.
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Articolo metodologico
Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia di fluorescenza ha fatto grandi contributi nella dissezione dei meccanismi di complessi processi biologici a livello di singola molecola. Nelle analisi di singola molecola per lo studio delle interazioni DNA-proteina, ci sono due fattori importanti da considerare: il substrato di DNA con una lunghezza sufficiente per l'osservazione facile ed etichettatura una proteina con una sonda fluorescente adatta. 48,5 kb λ DNA è un buon candidato per il substrato del DNA. Punti quantici (QDot), come una classe di sonde fluorescenti, consentono l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini di alta qualità. In questa carta, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina a livello di singola molecola, che comprende preparando un λ site-specifically modificate del DNA e l'etichettatura di una proteina bersaglio con QDot rivestite con streptavidina. Per un proof of concept, scegliamo ORC (riconoscimento di origine complessa) nel lievito gemmante come una proteina di interesse e visualizzare la sua interazione con un ARS (sequenza autonomamente replica) utilizzando TIRFM. Rispetto ad altre sonde fluorescenti, QDot hanno evidenti vantaggi negli studi di singola molecola a causa della sua elevata stabilità contro photobleaching, ma va notato che questa proprietà limita la sua applicazione in analisi quantitative.
Introduzione
Interazioni tra DNA e proteine sono essenziali per molti processi biologici complessi, come ad esempio la replicazione del DNA, riparazione del DNA e trascrizione. Anche se gli approcci convenzionali hanno fatto luce sulle proprietà di questi processi, molti meccanismi chiave sono ancora poco chiare. Recentemente, con le tecniche di singola molecola in rapido sviluppo, alcuni dei meccanismi sono stati indirizzati1,2,3.
L'applicazione di microscopia di fluorescenza di singola molecola sulla visualizzazione interazioni proteina-DNA in tempo reale pri....
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Protocollo
1. preparazione del substrato di DNA λ-ARS317
- Imballaggio e la costruzione di DNA substrato
- Digerire DNA nativo λ usando Xhoio enzima; amplificare un 543 cuscinetto del frammento del DNA bp ARS317 dal DNA genomico di germogliamento lievito usando i primer contenenti 20 bp omologa sequenze di upstream e downstream di Xhoio sito enzima DNA di lambda. Aggiungere 100 ng di Xhoho digerito il DNA λ e 10 ng di DNA frammento a 10 µ l di sistema di reazione di ricombinazione omologa e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.
- Per assemblare il DNA di λ di ricombinazione, aggiungere 25 µ l di lambda imballaggio estratti ne....
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Risultati
Per visualizzare l'interazione tra Qdot-labeled ORC e l'ARS, abbiamo costruito il substrato di DNA λ-ARS317. Un frammento di DNA che contiene ARS317 è stato integrato in XhoI sito (33,5 kb) del DNA nativo λ di ricombinazione omologa (Figura 1A). Il prodotto di ricombinazione è stato confezionato usando gli estratti e le particelle dei fagi confezionati sono state coltivate su piastre LB (Figura 1B). La placca positiva de.......
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Discussione
Qui, presentiamo un protocollo per osservare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate utilizzando il TIRFM in una cella di flusso. I passi necessari sono site-specific modificazione del substrato di DNA, DNA biotinylation, pulizia vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, preparazione di cella di flusso e imaging singola molecola. Ci sono due punti chiave che dovrebbero essere notati. Innanzitutto, tutti i passaggi con λ DNA devono essere manipolati delicatamente per ridurre eventu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Si ringraziano il Dr. Hasan Yardimci e Dr.Sevim Yardimci dell'Istituto Francis Crick per tipo aiutare negli esperimenti singola molecola, Dr. Daniel Duzdevich dal laboratorio del Dr. Eric C. Greene della Columbia University, Dr. Yujie Sun della Peking University e Dr. Chunlai Chen di Tsinghua University per utile discussione. Questo studio è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation della Cina 31371264, 31401059, CAS Team di innovazione interdisciplinare e la Newton Advanced Fellowship (NA140085) dalla Royal Society.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Negozio 25 μ L aliquote a -20 ºC. |
| XhoI enzima | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Kit di clonazione a fusione rapida | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Confezione Estratti | Epicentre | MP5110 | Ceppo batterico LE392MP è incluso in questa confezione. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013092 | Qualsiasi marca è accettabile. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A Qualsiasi | marca è accettabile. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012818 | |
| Cloroformio | Beijing Chemical works | N/A Qualsiasi | marca è accettabile. |
| NZ-ammina | Amresco | J853-250G | |
| Acidi casamino | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Apparecchio di agitazione magnetico | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tubo Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, sfuso, 500pz | |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinasi K | Amresco | 0706-100MG | |
| Primer biotinilati | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligasi, T4 DNA ligasi, tampone di reazione (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Vetrino coprioggetti | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009259 | |
| Idrossido di potassio (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80120891 | acido solforico |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011218 | 30% Perossido di idrogeno |
| Metanolo | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acido acetico | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (metossi-polietilenglicole) | Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotina-PEG (biotina-polietilenglicole) | Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Essiccatore sottovuoto | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Sigillatrice sottovuoto | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Scriba in vetro con punta di diamante | SCIENZE DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA | 70036 | |
| Vetrino scorrevole | Vela Marca | 7101 | |
| Tubo di ingresso | SCI (Scientific Commodities INC.) | BB31695-PE/2 | diametro interno 0,38 mm; diametro esterno 1,09 mm. |
| Tubo di uscita | SCI (Scientific Commodities INC.) | BB31695-PE/4 | diametro interno 0,76 mm; diametro esterno 1,22 mm. |
| Nastro biadesivo | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epossidico | LEAFTOP | 9005 | cinque minuti epossidico |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus | IX71 | |
| Infusione/prelievo pompa programmabile | Apparecchio Harvard | 70-4504 | |
| Laser a 532 nm | Laser coerente | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm | Fotocamera | OBIS-640-100 | |
| EMCCD | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging ottica di scissione | Hamamatsu fotonica K.K. | A12801-01 | |
| Sistema di illuminazione TIRF | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60× Obiettivo TIRF | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Beamsplitter laser dicroico quad-edge | Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 | |
| Filtro passa-banda quad-band | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 | |
| Dicroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Filtro di emissione | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Filtro di emissione | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescenza, vetrino di prova per microscopio #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Coniugato | Thermo Fisher Scientific Q10163MP | Store a 4 º C, non congelare. | |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Preparare 200 mM di soluzione ATP, utilizzando ddH2O, regolare il pH a 7,0 e conservare 10 μ L aliquote a -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Preparare la soluzione 1 M utilizzando ddH2O e conservare 10 μ l aliquote a -20 ºC. |
Riferimenti
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....
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Ristampe e permessi
