Method Article

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia di fluorescenza ha fatto grandi contributi nella dissezione dei meccanismi di complessi processi biologici a livello di singola molecola. Nelle analisi di singola molecola per lo studio delle interazioni DNA-proteina, ci sono due fattori importanti da considerare: il substrato di DNA con una lunghezza sufficiente per l'osservazione facile ed etichettatura una proteina con una sonda fluorescente adatta. 48,5 kb λ DNA è un buon candidato per il substrato del DNA. Punti quantici (QDot), come una classe di sonde fluorescenti, consentono l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini di alta qualità. In questa carta, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina a livello di singola molecola, che comprende preparando un λ site-specifically modificate del DNA e l'etichettatura di una proteina bersaglio con QDot rivestite con streptavidina. Per un proof of concept, scegliamo ORC (riconoscimento di origine complessa) nel lievito gemmante come una proteina di interesse e visualizzare la sua interazione con un ARS (sequenza autonomamente replica) utilizzando TIRFM. Rispetto ad altre sonde fluorescenti, QDot hanno evidenti vantaggi negli studi di singola molecola a causa della sua elevata stabilità contro photobleaching, ma va notato che questa proprietà limita la sua applicazione in analisi quantitative.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interazioni tra DNA e proteine sono essenziali per molti processi biologici complessi, come ad esempio la replicazione del DNA, riparazione del DNA e trascrizione. Anche se gli approcci convenzionali hanno fatto luce sulle proprietà di questi processi, molti meccanismi chiave sono ancora poco chiare. Recentemente, con le tecniche di singola molecola in rapido sviluppo, alcuni dei meccanismi sono stati indirizzati1,2,3.

L'applicazione di microscopia di fluorescenza di singola molecola sulla visualizzazione interazioni proteina-DNA in tempo reale principalmente dipende dallo sviluppo di rilevazione della fluorescenza e sonde fluorescenti. Per uno studio di singola molecola, è importante etichettare la proteina di interesse con una sonda fluorescente adatta poiché sistemi di rilevazione di fluorescenza per la maggior parte sono commercialmente disponibili.

Le proteine fluorescenti sono comunemente usate in biologia molecolare. Tuttavia, la bassa luminosità fluorescente e la stabilità contro photobleaching limitarne l'applicazione in molti saggi di singola molecola. Punti quantici (QDot) sono piccoli emettitori di luce nanoparticelle4. A causa di loro proprietà ottiche uniche, QDot sono 10 - 20 volte più luminoso e diverse migliaia di volte più stabile di ampiamente usato organici coloranti5. Inoltre, QDot hanno un grande Stokes shift (la differenza tra la posizione dei picchi di eccitazione e di emissione)5. Così, QDot può essere utilizzato per l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini con alti rapporti segnale-rumore, mentre essi non possono essere utilizzati in analisi quantitative.

Ad oggi, ci sono due approcci per etichettare una proteina bersaglio con QDot site-specifically: etichettatura con l'ausilio di anticorpi primari o secondari coniugati Qdot6,7,8; o etichettatura la proteina bersaglio con QDot direttamente, che si basa sull'interazione forte tra biotina e streptavidina9,10,11,12,13. Rivestite con streptavidina QDot sono disponibili in commercio. Nel nostro recente studio, site-specifically proteine biotinilate in lievito ad alta efficienza sono stati purificati dal co-sovraespressione di BirA e proteine etichettate Avi in vivo10. Segue e ottimizzando le analisi di singola molecola14,15,16,17, abbiamo osservato le interazioni tra DNA e proteine identificate Qdot a utilizzando il livello di singola molecola TIRFM10.

Qui, abbiamo scelto la gemmazione lievito origine riconoscimento complesso (ORC), che possa in particolare riconoscono e si legano alla sequenza autonomamente replica (ARS), come la proteina di interesse. Il seguente protocollo presenta una procedura dettagliata di visualizzare l'interazione di Qdot-labeled ORC con ARS utilizzando TIRFM. La preparazione del substrato DNA site-specifically modificato, la biotinilazione di DNA, la pulizia del vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, l'Assemblea di cella di flusso e l'imaging di singola molecola sono descritti.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparazione del substrato di DNA λ-ARS317

  1. Imballaggio e la costruzione di DNA substrato
    1. Digerire DNA nativo λ usando Xhoio enzima; amplificare un 543 cuscinetto del frammento del DNA bp ARS317 dal DNA genomico di germogliamento lievito usando i primer contenenti 20 bp omologa sequenze di upstream e downstream di Xhoio sito enzima DNA di lambda. Aggiungere 100 ng di Xhoho digerito il DNA λ e 10 ng di DNA frammento a 10 µ l di sistema di reazione di ricombinazione omologa e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.
    2. Per assemblare il DNA di λ di ricombinazione, aggiungere 25 µ l di lambda imballaggio estratti nel prodotto ricombinazione e incubi la reazione a 30 ° C per 90 min. Quindi, aggiungere un ulteriore 25 µ l di lambda imballaggio estratti nella provetta di reazione. Continuare a incubare la reazione a 30 ° C per 90 min.
    3. Aggiungere 500 µ l di tampone di diluizione sterile (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), NaCl 100 mM, 10 mM MgCl2) nel sistema di reazione e mescolare delicatamente ruotando il tubo capovolto più volte. Aggiungere 25 µ l di cloroformio, mescolare delicatamente e conservare a 4 ° C.
    4. Aggiungere 100 µ l del fago confezionato e 100 µ l di batteri LE392MP (coltivate a 0.8 - 1.0 usando LB medium aggiunta con 10mm MgSO4) in una nuova provetta. Incubare a 37 ° C per 15 minuti.
    5. Aggiungere 200 µ l di miscela dei fagi-batterio in 4 mL di agar Ditop (LB medium + 0,7% agar + 10mm MgSO4, raffreddata a 48 ° C). Mescolare immediatamente ruotando il tubo capovolto più volte e versarla su un piatto pre-riscaldata (37 ° C) LB.
    6. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte e la placca di λ-ARS317 mediante PCR e sequenziamento a schermo.
  2. Purificazione di DNA substrato da lisati liquido11,18
    1. Raccogliere una placca in 200 µ l di ddH sterile2O con 10 mM MgCl2 e 10 nM CaCl2. Mescolare con 200 µ l di batteri LE392MP (coltivata pernottamento in mezzo LB) e incubare a 37 ° C per 15 min.
    2. Aggiungere la miscela dei fagi-batterio in 100 mL di NZCYM (10 g/L NZ-ammina, 5g/L lievito estratto, 5g/L NaCl, 1 g/L Casamino idrolizzato e MgSO4·7H2O 2 g/L) media e cultura per 7 h a 37 ° C. Aggiungere 250 µ l di cloroformio nella cultura ed agitare per altri 10 min.
    3. Diffondere la cultura in una beuta da 200 mL. Aggiungere 5,8 g di NaCl (concentrazione finale di 1 M), mescolare per sciogliere a mano e incubare in ghiaccio per 30 min.
    4. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante in una beuta da 200 mL e aggiungere 10% PEG8000 (m/V). Mescolare per sciogliere col mescolatore magnetico e incubare in ghiaccio per 30 minuti o più.
    5. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C per far precipitare il batteriofago. Eliminare il surnatante.
    6. Risospendere il precipitato in 2 mL di tampone di diluizione dei fagi. Trasferirlo in una provetta da 15 mL e aggiungere 10 µ l di RNAsi (concentrazione finale è 20 µ g/mL) e 40 µ l di dnasi (concentrazione finale è 5 µ g/mL). Incubare a 37 ° C per 30 min.
    7. Aggiungere 2 mL di 0,3 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, proteinasi di 15 µ l K (concentrazione finale è di 10 µ g/mL). Incubare a 65 ° C per 10 min.
    8. Aggiungere 2 mL di acetato di potassio pre-raffreddata (3M, pH 4.8) e incubare la provetta in ghiaccio per 10 min.
    9. Centrifugare a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere il materiale insolubile.
    10. Aggiungere 0,7 x volume di isopropanolo nel surnatante. Mescolare ruotando il tubo capovolto più volte e incubare per 2 min a temperatura ambiente (TA).
    11. Centrifugare a 8.000 x g per 10 min a RT per precipitare il DNA. Eliminare il surnatante.
    12. Lavare il DNA una volta con 70% etanolo mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min. eliminare il surnatante.
    13. Eluire il DNA utilizzando delicatamente il tampone di 500 µ l TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) e trasferire il DNA in provetta da 1,5 mL.
    14. Estrarre il DNA due volte con il fenolo: cloroformio mediante centrifugazione a 8.000 g per 10 min.
    15. Precipitare con 0,7 x volume di isopropanolo. Mescolare girando il tubo testa in giù delicatamente e centrifugare a 8.000 x g per 10 min.
    16. Lavare una volta con etanolo al 70%, risospendere in 200 µ l di TE. Misurare la concentrazione di DNA e conservare a-20 ° C in 12,5 µ g aliquote.

2. λ-ARS317 DNA biotinilazione

  1. Fosforilare oligonucleotidi biotinilati (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-biotina-3') complementari all'estremità sinistra del nativo di λ DNA, aggiungere 1 µ l (100 µM) di oligonucleotidi, 7,5 µ l di ddH2O, 1 µ l di tampone di ligasi 10x e 0,5 µ l di T4 PNK. Incubare la reazione a 37 ° C per 3 h.
  2. Per fosforilare λ-ARS317, aggiungere 12,5 µ g di λ-ARS317, 3 µ l di tampone di ligasi 10x, 1 µ l di T4 PNK e ddH2O al volume totale di 30 µ l. incubi la reazione a 37 ° C per 3 h.
  3. Per temprare oligonucleotidi con λ-ARS317, aggiungere 0,5 µ l di oligonucleotidi fosforilati, 195 µ l di ddH2O, 25 µ l di tampone di ligasi × 10 nel tubo fosforilato λ-ARS317. Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta e incubare a 65 ° C per 5 min turno spento il riscaldatore blocco e lasciare raffreddare il campione a inferiore a 33 ° C nel blocco.
  4. Per lega i oligonucleotides con λ-ARS317, aggiungere 1 µ l di T4 DNA ligasi e 0,63 µ l del trifosfato di adenosina (200 mM). Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta e incubare a temperatura ambiente per 2 h o a 4 ° C durante la notte. Conservare a 4 ° C per 1 mese.
    Nota: Per evitare di rompere il DNA, tutte le fasi di miscelazione devono essere eseguite capovolgendo delicatamente il tubo, invece di mescolare utilizzando pipette.

3. vetrino coprioggetto pulizia e funzionalizzazione

  1. Vetrino coprioggetti pulizia
    1. Posto 20 vetrini coprioggetti in 4 vaschette per colorazione (5 vetrini coprioggetti/vasetto), Sonicare per 30 minuti in etanolo e sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 3 volte.
    2. Sonicare per 30 minuti con 1 M di idrossido di potassio (KOH) e sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 3 volte. Ripetere l'etanolo e KOH sonicazione una volta.
    3. Sonicare con acetone per 30 minuti e poi sciacquare abbondantemente con ultrapura H2O (almeno 3 volte).
      Nota: Acetone deve essere rimosso completamente risciacquando con ultrapura H2O, perché può causare un'esplosione quando solvente organico (ad esempio acetone) mescolato con la soluzione piranha erroneamente14.
    4. Inserire i vetrini coprioggetto soluzione piranha (miscela 3:1 di H2SO4 e 30% H2O2) e incubare a 95 ° C per 1 h.
      Nota: La soluzione Piranha è altamente energico e corrosiva, quindi usare con cautela. Quando si prepara la soluzione piranha, aggiungere 50 mL di H2O2 prima in un becher di vetro 500 mL e quindi aggiungere 150 mL di H2così4 lentamente nel bicchiere graduato.
    5. Sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 5 volte. Quindi lavare ogni vetrino coprioggetti con ultrapura H2O accuratamente con 3 bicchieri riempiti con ultrapura H2O ed asciugare il vetrino coprioggetto utilizzando carta dal bordo del coverslip. Inserire la vaschetta di colorazione del vetrino coprioggetto e asciugare il vetrino coprioggetto accuratamente in forno a 110 ° C per 30 minuti.
      1. Sciacquare il vetrino coprioggetto con metanolo e mettere la vaschetta di colorazione in forno 110 ° C per asciugare il vetrino coprioggetti.
        Nota: Asciugare accuratamente il vetrino coprioggetto è molto importante, perché APTES avrà un sacco di possibili strutture superficiali, una volta che si è in presenza di acqua19.
  2. Vetrino coprioggetti funzionalizzazione
    1. Aggiungere 70 mL di soluzione di silano (93% metanolo, 5% acetico e 2% APTES) in ogni vaso, avvitare il tappo e lasciare il vaso a temperatura ambiente durante la notte.
    2. Lavare e asciugare i vetrini coprioggetti, come descritto al punto 3.1.5, tranne per il fatto asciugare i vetrini coprioggetti accuratamente con gas azoto invece di metterli in forno.
    3. Sciogliere 150 mg di mPEG (metossi-polietilene glicole) e 6 mg di biotina-PEG (biotina-polietilenglicole) in 1 mL di 0.1 M fresca fatta NaHCO3 (pH 8.2) accuratamente. Poi Centrifugare a 17, 000 x g per 1 min a togliere pioli insolubile.
      Nota: Appena fatte NaHCO3 è pronto; non c'è nessuna necessità di regolare il suo pH.
    4. Posizionare i vetrini coprioggetti silanizzata nelle caselle e mettere due vetrini coprioggetti piccoli sulla parte superiore due estremità delle lamelle silanizzato. Pipettare 100 µ l di soluzione di PEG sul centro del coprivetrino silanizzata e inserire un altro vetrino coprioggetti silanizzata in alto a sinistra.
    5. Aggiungere alcuni ultrapura H2O nella finestra per mantenerlo umido e incubare i vetrini coprioggetti con soluzione PEG per almeno 3 ore al buio. Un'incubazione overnight può lavorare bene.
    6. Separare le coppie di coprioggetto e continuate il volto di superficie funzionalizzato, sciacquare i coprioggetti usando ultrapura H2O ampiamente e asciugarle con gas azoto.
    7. Contrassegnare il lato funzionalizzato di lamelle su uno degli angoli utilizzando un pennarello, tenere il lato funzionalizzato affrontare, metterli in scatole e archiviazione le caselle in un essiccatore sotto vuoto per 1 mese.
    8. Per memorizzare i coprioggetti per un tempo più lungo, porre un coprivetrino in una provetta da 50 mL forata con un buco sul suo tappo, poi mettere il tubo in un sacchetto di plastica e sigillare il sacchetto usando una macchina per il sottovuoto. In questo modo, lamelle possono essere immagazzinate a-20 ° C circa 3 mesi.

4. flusso Cell Assembly

  1. Tagliare un canale 15 × 2 mm al centro di un pezzo di nastro biadesivo (30 mm × 12 mm) utilizzando un perforatore.
  2. Staccare il lato della carta del nastro biadesivo e incollarlo sul vetrino con due fori. Premere per rimuovere le bolle d'aria. Basandoci sulla nostra esperienza, è più facile rimuovere le bolle d'aria di pelatura fuori il lato della carta rispetto al lato di plastica del nastro biadesivo.
  3. Tagliare un vetrino coprioggetti funzionalizzato (60 mm × 24 mm) in quattro pezzi (30 mm × 12 mm) utilizzando un punta di diamante di vetro scribe e rimuovere i detriti utilizzando gas azoto. Ricordarsi di tenere il funzionalizzati lato faccia in su.
  4. Staccare la plastica laterale del nastro biadesivo e incollare la diapositiva il coprivetrino funzionalizzato. Premere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria tra il nastro e il vetrino coprioggetti. Rimozione di bolle d'aria accuratamente può proteggere la cella di flusso da perdite mentre buffer sono stati pompati in esso.
  5. Inserire aspirazione e tubo di uscita nei fori piccoli e grandi, rispettivamente. Fissare il tubo con resina epossidica.
  6. Pompa 20 µ l di streptavidina (0,2 mg/mL) nella cella di flusso utilizzando una siringa manualmente e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Quindi pompa blocco buffer10 nella cella di flusso per sostituire streptavidina e tenerlo a temperatura ambiente.

5. singola molecola Visualization

  1. Ottenere l'allineamento focale del rosso e da' con A5 sulla prova di microscopio di fluorescenza #1 eccitazione simultanea utilizzando un laser a 532 nm e laser 640 nm. Produrre immagini di doppia lunghezza d'onda con la scissione ottica (Vedi Tabella materiali).
  2. Posizionare la cella di flusso sul microscopio e collegare il tubo di uscita per un più lungo collegamento tubazione con una molla di 10ml installata su una pompa di infusione/ritiro automatici programmabili.
    Nota: Pompaggio buffer nella cella di flusso indicato di seguito significa ritirare buffer dal tubo di ingresso della cella di flusso alla siringa.
  3. Pompa tampone bloccante a 500 µ l/min nella cella di flusso per rimuovere rapidamente l'aria e garantire che il buffer nella cella di flusso è sbloccato. Pompare il tampone bloccante a 200 µ l/min nella cella di flusso, quindi capovolgere il tubo di uscita per rimuovere le bolle d'aria dal tubo di aspirazione e la cella di flusso accuratamente.
    Nota: Tutti i buffer pompati nella cella di flusso dovrebbero essere degassificati in un essiccatore sotto vuoto per almeno 15 minuti prima dell'uso.
  4. Aggiungere 0,5 µ l di DNA λ-ARS317 biotinilati in 80 µ l di tampone bloccante e pompa in cella di flusso a 25 µ l/min per 2 min. Quindi sciacquare λ-ARS317 DNA utilizzando 200 µ l di tampone bloccante ad un tasso di 50 µ l/min.
  5. 200 µ l di binding buffer10 ad un tasso di 50 µ l/min per rimuovere il tampone bloccante nella cella di flusso della pompa.
  6. Aggiungere 0,2 µ l di rivestite con streptavidina Qdot705 (1 µM) e 0,2 µ l di biotinylated ORC (1,2 µM) in una provetta e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 20 µ l di binding buffer nel tubo, quindi posizionarlo sul ghiaccio. La concentrazione finale di ORC-Qdot705 è di circa 10 nM.
  7. Aggiungere 2 µ l di ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µ l di DTT (100 mM), 1 µ l di ATP (200 mM) in 96 µ l di tampone di associazione. La concentrazione finale di ORC-Qdot705 è di 0,2 nM.
  8. Nella cella di flusso della pompa 20 µ l di 0,2 nM ORC-Qdot705 al tasso di 10 µ l/min. Scovare di eccessiva ORC-Qdot705 utilizzando 200 µ l di tampone di associazione al ritmo di 100 µ l/min. Quindi pompa buffer obbligatorio con 30 nM SYTOX arancio nella cella di flusso a macchiare substrati DNA ad un tasso di 100 µ l/min.
  9. Eccitare il segnale di705 ORC-Qdot e SYTOX arancio macchiato segnale di DNA utilizzando un laser di 405 nm e 532 nm laser, rispettivamente. Osservare i segnali simultaneamente con 100 µ l/min flusso utilizzando un filtro passabanda Quad-band (FF01-446/510/581/703-25) e registrare le immagini di EM-CCD con 100 ms per ogni frame. Raccogliere 20 serie di immagini provenienti da diversi campi.

6. analisi dei dati

  1. Ritaglia le immagini usando il software di Fiji con un nuovo plugin, che viene modificato da noi stessi basate sul plugin Image (OI_cut_RGBmerge) sviluppato da laboratorio di Dr. Ron Vale presso University of California, San Francisco.
    1. Ritagliare una pila di immagini (512 × 512 pixel) in due pile di immagini (256 × 256 pixel). Uno è un 532 nm laser risultato entusiasmante, e l'altro è un 405 nanometro laser risultato entusiasmante.
  2. Processo di 61 immagini sequenziali utilizzando Fiji-immagine-pile-Z project (intensità media).
  3. Misura la lunghezza del DNA (LDNA) e la distanza dal sito di ORC-Qdot705 (LORC) associazione il DNA al DNA legato fine manualmente.
  4. Calcolare il risultato della LORC/lDNA utilizzando excel, analizzare i dati utilizzando il metodo bootstrap di R, quindi creare l'istogramma e distribuzioni gaussiane in forma.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per visualizzare l'interazione tra Qdot-labeled ORC e l'ARS, abbiamo costruito il substrato di DNA λ-ARS317. Un frammento di DNA che contiene ARS317 è stato integrato in XhoI sito (33,5 kb) del DNA nativo λ di ricombinazione omologa (Figura 1A). Il prodotto di ricombinazione è stato confezionato usando gli estratti e le particelle dei fagi confezionati sono state coltivate su piastre LB (Figura 1B). La placca positiva de...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per osservare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate utilizzando il TIRFM in una cella di flusso. I passi necessari sono site-specific modificazione del substrato di DNA, DNA biotinylation, pulizia vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, preparazione di cella di flusso e imaging singola molecola. Ci sono due punti chiave che dovrebbero essere notati. Innanzitutto, tutti i passaggi con λ DNA devono essere manipolati delicatamente per ridurre eventu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Si ringraziano il Dr. Hasan Yardimci e Dr.Sevim Yardimci dell'Istituto Francis Crick per tipo aiutare negli esperimenti singola molecola, Dr. Daniel Duzdevich dal laboratorio del Dr. Eric C. Greene della Columbia University, Dr. Yujie Sun della Peking University e Dr. Chunlai Chen di Tsinghua University per utile discussione. Questo studio è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation della Cina 31371264, 31401059, CAS Team di innovazione interdisciplinare e la Newton Advanced Fellowship (NA140085) dalla Royal Society.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lambda DNANew England BiolabsN3011Negozio 25 μ L aliquote a -20 ºC.
XhoI enzimaThermo Fisher ScientificFD0694
Kit di clonazione a fusione rapidaBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Confezione Estratti		EpicentreMP5110Ceppo batterico LE392MP
è incluso in questa confezione.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013092Qualsiasi marca è accettabile.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical worksN/A Qualsiasimarca è accettabile.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012818
CloroformioBeijing Chemical worksN/A Qualsiasimarca è accettabile.
NZ-amminaAmrescoJ853-250G
Acidi casaminoSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Apparecchio di agitazione magneticoIKAKMO2 basic
15 mL Eppendorf tubo Eppendorf3012215115 mL, sterile, sfuso, 500pz
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinasi KAmresco0706-100MG
Primer biotinilatiThermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA ligasi, T4 DNA ligasi, tampone di reazione (10x)New England BiolabsM0202
Vetrino coprioggettiThermo Fisher Scientific22266882
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009259
Idrossido di potassio (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcetoneThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80120891acido solforico
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001121830% Perossido di idrogeno
MetanoloSigma-Aldrich322415-2L
Acido aceticoSigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(metossi-polietilenglicole)		LysanmPEG-SVA-5000
biotina-PEG
(biotina-polietilenglicole)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Essiccatore sottovuotoTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Sigillatrice sottovuotoMAGIC SEALWP300
Scriba in vetro con punta di diamanteSCIENZE DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA70036
Vetrino scorrevoleVela Marca7101
Tubo di ingressoSCI (Scientific Commodities INC.)BB31695-PE/2diametro interno 0,38 mm; diametro esterno 1,09 mm.
Tubo di uscitaSCI (Scientific Commodities INC.)BB31695-PE/4diametro interno 0,76 mm; diametro esterno 1,22 mm.
Nastro biadesivoSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpossidicoLEAFTOP9005cinque minuti epossidico
StreptavidinSigma-AldrichS4762
Microscopio a fluorescenzaOlympusIX71
Infusione/prelievo
pompa programmabile		Apparecchio Harvard70-4504
Laser a 532 nmLaser coerenteSapphire-532-50
640 nmFotocameraOBIS-640-100
EMCCDAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
ottica di scissione		Hamamatsu fotonica K.K.A12801-01
Sistema di illuminazione TIRFOlympusIX2-RFAEVA2
60× Obiettivo TIRFOlympusAPON60XOTIRF
Beamsplitter laser dicroico
quad-edge		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Filtro passa-banda quad-bandSemrockFF01-446/510/
581/703-25
Dicroic beamsplitterSemrockFF649-Di01-25x36
Filtro di emissioneChroma Technology CorpET585/65m
Filtro di emissioneChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck fluorescenza, vetrino di prova per microscopio #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin ConiugatoThermo Fisher Scientific Q10163MPStore a 4 º C, non congelare.
ATPAmresco0220-25GPreparare 200 mM di soluzione ATP, utilizzando ddH2O, regolare il pH a 7,0 e conservare 10 μ L aliquote a -20 ºC.
DTTAmrescoM109-5GPreparare la soluzione 1 M utilizzando ddH2O e conservare 10 μ l aliquote a -20 ºC.
coerente

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  3. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
  4. Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
  5. Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
  6. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62(2014).
  7. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
  8. Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
  9. Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
  10. Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062(2017).
  11. Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
  12. Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
  13. Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
  14. Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  15. Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
  16. Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
  17. Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
  18. Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
  19. Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
  20. Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

Related Articles