Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero

Sommario

Qui è descritto un protocollo semplice ed e validato per la misurazione di massa autofagica sequestro attività in cellule di mammifero. Il metodo si basa su quantificare la percentuale di lattato deidrogenasi (LDH) in frazioni cellulari sedimentabili rispetto ai livelli LDH cellulari totali.

Abstract

L'autofagia alla rinfusa è caratterizzato tramite il sequestro di grandi porzioni di citoplasma in doppio/multi-membrane strutture definite autofagosomi. Qui è descritto un semplice protocollo per monitorare questo processo. Inoltre, sono disponibili i risultati tipici e validazione sperimentale del metodo in condizioni che inducono autofagia in vari tipi di cellule di mammiferi coltivate. Durante l'autofagia alla rinfusa, autofagosomi sequestrano il citosol e quindi anche proteine citosoliche solubili, a fianco di altri carichi autofagici. LDH è una stabile e altamente solubile, abbondante enzima citosolico che è non-selettivamente sequestrata in autofagosomi. La quantità di sequestro di LDH pertanto riflette la quantità di sequestro autofagica alla rinfusa. Per efficientemente ed esattamente determinare sequestro di LDH in cellule, ci avvaliamo di un protocollo basato su electrodisruption frazionamento che separa efficacemente sedimentabili da citosolico LDH, seguita dalla misurazione dell'attività enzimatica in sedimentabili frazioni contro campioni di cellule intere. Autofagica sequestro è determinato sottraendo la proporzione di sedimentabili LDH in cellule non trattate da quello nelle cellule trattate. Il vantaggio del dosaggio di sequestro di LDH è che dà una misura quantitativa del sequestro autophagic del carico endogeno, al contrario di altri metodi che sia coinvolgere l'espressione ectopica di sequestro sonde o semi-quantitativa della proteasi analisi di protezione di autofagia marcatori o recettori.

Introduzione

Autofagia (greco per "auto-eating") è un processo evolutivo conservato per vacuolar/lysosomal degradazione di materiale intracellulare. Al momento della scoperta dei geni autophagy-relative ("ATG"), che sono importanti per autofagia in lievito ed in esseri umani, e la realizzazione che autophagy svolge un ruolo significativo nella salute e nella malattia (riconosciuto dal premio Nobel 2016 in medicina o fisiologia di Yoshinori Ohsumi), l'autofagia è rapidamente diventato uno dei processi più intensamente studiati in biologia cellulare^1,2.

Macroautophagy (in appresso denominato "autofagia") è caratterizzata dall'espansione e pieghevole di cisterne intracellulare membrana ("phagophores") in strutture sigillate, doppio - o multi - membrane ("autofagosomi") che sequestrano efficacemente il materiale avvolto dal resto del citoplasma. Al momento della fusione di autofagosomi con i lisosomi, membrana dell'autofagosoma interiore e il carico sequestrato è degradato e riciclato. Autofagosomi possono sequestrare materiale citoplasmico sia casuale (non-selettivi dell'autofagia) e le buone maniere selettiva (selective autofagia). Bulk autofagia molto probabilmente rappresenta un mix di autofagia selettivo e non selettivi.

Negli anni ' 60 e 70 ("la morfologica era" della ricerca di autofagia), sequestro autofagica principalmente è stato valutato attraverso analisi ultrastrutturali. Negli anni ottanta e inizio anni ' 90 ("l'era di biochimica") Per Seglen e colleghi di lavoro — che ha studiato l'autofagia in epatociti primari del ratto — ha sviluppato i primi metodi per misurare quantitativamente autofagica sequestro attività³. Utilizzando queste analisi, Seglen definito e caratterizzato diverse fasi del pathway autofagico-lisosomiale^4,5, scoperto e coniato il amphisome⁶ (il prodotto della fusione di endosome-autofagosoma) e fu il primo a descrivere il ruolo della fosforilazione della proteina nell'autofagia regolamento⁷. Tuttavia, dopo la scoperta dell'ATG nel 1990 ("l'era molecolare") e la prima caratterizzazione di una proteina di ATG8 dei mammiferi, proteina microtubule-collegata 1A/1B-luce catena 3 (LC3) nel 2000⁸, l'uso di proteine ATG come marcatori per la processo autofagico rapidamente guadagnato popolarità, e i più vecchi e più laboriosi metodi biochimici sono stati lasciati indietro. Infatti, sopra gli ultimi 18 anni, western blot e analisi di microscopia di fluorescenza di LC3 sono diventati di gran lunga più popolari (e in molti casi l'unico) mezzi di studiare l'autofagia in cellule di mammifero. Il vantaggio è la relativa facilità con cui questi metodi possono essere effettuati. Lo svantaggio è che uno sta studiando un componente carrello (LC3) piuttosto che di effettivo carico autofagico. Questo è uno svantaggio piuttosto grave, perché il rapporto tra gli Stati e/o flusso di LC3 attraverso la via contro il sequestro e il flusso di merci è molto chiaro. Infatti, abbiamo dimostrato che il flusso di merci alla rinfusa può essere mantenuta ad alti livelli in condizioni dove non c'è nessun flusso di LC3, nonostante la presenza di LC3 coniugati in cellule⁹. Inoltre, abbiamo dimostrato che autophagy di massa non è influenzato da efficiente LC3 svuotamento e quindi probabilmente è LC3-indipendente⁹. Ciò che trova è stata confermata più tardi da LC3 knock-out studi^10,11, che inoltre indicano che mitophagy Parkin-dipendente (l'autofagia selettiva dei mitocondri) è indipendente di LC3^10,11 .

In sintesi, c'è una chiara esigenza di analisi del carico-based monitorare attività autofagica. In modo ottimale tali dosaggi dovrebbero essere ampiamente applicabili, ben definito e facile da eseguire. Negli ultimi anni abbiamo preso un particolare interesse nell'analisi di sequestro della LDH, che è stato sviluppato da Per Seglen nei¹²anni ' 80 e si basa sulla misurazione del transfer di LDH citosolico a sedimentabili, cella contenenti vacuolo autophagic frazioni. LDH è una proteina citosolica stabile, solubile che co-è prontamente sequestrata quando phagophores enwrap citoplasmico del carico. Sequestro di LDH è pertanto una misura generale di sequestro autofagico. LDH è esclusivamente degradata dalla via autofagica lysosomal¹². Così, in presenza di inibitori di degradazione lisosomiale, ad es., methyladenine A1 (Baf)¹³, direttamente gli effetti del trattamento sperimentale riflettono le alterazioni nell'attività di sequestro autofagici. In assenza di inibitori di degradazione, l'effetto netto delle alterazioni nel sequestro di LDH e degradazione può essere misurata.

Il dosaggio di sequestro di LDH è largamente applicabile, poiché LDH è altamente e ubiquitariamente espressa in tutti i tipi di cellule, e livelli di LDH possono essere quantificati con precisione da un dosaggio enzimatico^14,15. Tuttavia, l'originale protocollo¹² — stabilito in epatociti primari del ratto — piuttosto che richiede tempo e necessitava di una quantità elevata di inizio materiale nonché un condensatore scarico elettrico su misura. In maniera graduale, abbiamo trasformato gradualmente il dosaggio in un metodo facile e versatile. In primo luogo, il protocollo originale è stato adattato per l'uso in cellule di mammifero linee¹⁶. In secondo luogo, il metodo era sostanzialmente ridimensionato^3,9. Terzo, sono stati eliminati diversi passaggi nel protocollo, tra cui un cuscino di densità laborioso passo¹⁷. Questo permesso simultaneamente un downscaling ulteriormente del metodo, il punto di partenza originale di usando un piatto di 10 cm per esempio¹⁶ all'utilizzo di un singolo pozzo da una piastra 12-pozzetti per campione (vale a dire, circa 15 volte meno a partire materiale)¹⁷. In quarto luogo, abbiamo identificato un'apparecchiatura di elettroporazione commerciale che potrebbe sostituire il condensatore scarica elettrica su misura¹⁷.

Qui è presentato il nostro protocollo più aggiornata del dosaggio di sequestro di LDH, che comprende alcune ulteriori semplificazioni del metodo rispetto al precedentemente pubblicato il¹⁷ . Inoltre, viene presentata una serie di tipici risultati ottenuti in un certo numero di diversi tipi di cellule, e soprattutto, più righe di convalide sperimentali del metodo utilizzando farmacologica nonché genetica atterramento e knockout approcci sono forniti. Per uno schema globale di flusso del protocollo intero, Vedi Figura 1.

Protocollo

1. cellula semina e trattamento

1. Cellule aderenti di cultura in recipienti di coltura del tessuto² 75 cm in un incubatore con 5% CO₂ a 37 ° C, utilizzando il comodo mezzo di coltura per il tipo di cella in questione. Permettono alle cellule di crescere fino a raggiungere uno strato di cellule vicino-confluenti.
   Nota: Utilizzare RPMI 1640 supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) per LNCaP, HEK293, fibroblasti embrionali del mouse (MEFs), BJ, MCF-7 e cellule RPE-1.
   1. Lavare le cellule con soluzione da 3 mL Tampone fosfato 37 ° C (PBS), pH 7,4. Sostituire il PBS con 3 mL 0,25% (p/v) tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare la beuta in un incubatore con 5% CO₂ a 37 ° C fino a staccano le cellule (2 – 5 min).
   2. Risospendere le cellule indipendente con 7 mL terreno di coltura contenente 10% FBS. Mescolare un'aliquota di sospensione cellulare 10 µ l con 10 µ l 0,4% Trypan Blue in un tubo del microcentrifuge, utilizzando un puntale di 0,5 – 20 µ l. Utilizzare la stessa punta della pipetta per riempire immediatamente una conteggio diapositiva di camera e contare le celle in un contatore di cellule automatizzato.
2. Preparare un'adeguata diluizione (Vedi nota sotto) della sospensione delle cellule dal punto 1.1.2 using cultura media contenente 10% FBS ed il seme di 1 mL di sospensione cellulare diluito in ciascun pozzetto di una piastra (superficie ~3.8 cm²) di coltura del tessuto 12-pozzetti utilizzando asettica tecnica. Consentono la crescita in un incubatore con 5% CO₂ a 37 ° C fino a quando la densità di cella desiderata è stata raggiunta, ad esempio, 60 – 90% confluenza al momento del raccolto.
   Nota: La diluizione appropriata della sospensione delle cellule che darà il confluency di cella desiderata al momento del raccolto variano dal tipo delle cellule di tipo delle cellule, così come secondo la durata e il tipo di trattamenti sperimentali. Così, questo deve essere valutato empiricamente in ogni caso.
   1. Per gli esperimenti che devono essere entrambi trattati e raccolto 2 giorni dopo la semina, seme 2.5 x 10⁵ LNCaP, HEK293, o MCF-7 celle, 5 x 10⁴ MEFs, 4 x 10⁵ BJ o 1.5 x 10⁵ RPE-1 cellule in ciascun pozzetto della piastra 12-pozzetti.
   2. Per le cellule che aderiscono liberamente, ricoprire le piastre con il tipo di rivestimento consigliato per il tipo di cella in questione. Per le cellule di LNCaP (e HEK293) utilizzare piastre rivestite con poli-D-lisina (PDL).
   3. A tal fine, aggiungere 500 µ l PDL a 2,5 µ g/mL in sterile H₂O ad ogni pozzetto e incubare le piastre in un ambiente sterile per 30 min a temperatura ambiente (20 – 25 ° C). Rimuovere il PDL con aspirazione e lavare ogni bene brevemente con 1 mL sterile H₂O.
      Nota: In generale, punto 1.2.1 è fatto senza trattamenti sperimentali. Tuttavia, se si esegue RNAi, può essere conveniente per iniziare un transfection inverso con la semina⁹.
3. Eseguire trattamenti sperimentali a wells duplicate o triplicate per condizione.
   1. Ad esempio, trattare le cellule con 50 nM di Torin1 l'inibitore di mTOR, che generalmente è un induttore efficiente del sequestro autofagica o sottoporre le cellule a acuta inedia dell'aminoacido e siero - lavando le cellule con 1 mL di amino acidi Earle di equilibrato Mezzo di soluzione (EBSS) di sale e successivamente Incubare le cellule in 1 mL di EBSS in un incubatore con 5% CO₂ a 37 ° C.
   2. Lasciare una serie di pozzi non trattata al fine di definire livelli di fondo di sedimentabili LDH.
   3. Aggiungere una quantità saturante del post-sequestro inibitore methyladenine A1 (Baf)^3,13,16,18 nell'assenza o nella presenza dei trattamenti sperimentali, 3 – 4 h prima cella vendemmia. Incubare le cellule in un'incubatrice umidificata con 5% CO₂ a 37 ° C.
      1. Uso 100 nM Baf per LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 e cellule RPE-1 e 10 nM Baf per MEFs.
      2. Per trattamenti sperimentali che hanno una durata di solo 3 – 4 h (come quelli esemplificati in punto 1.3.1 hanno in genere), aggiungere Baf simultaneamente con i trattamenti. Per trattamenti più sperimentali, attendere 3-4 ore prima della raccolta e aggiungere 2 µ l di una 500 x concentrato Baf stock direttamente nel terreno.
      3. Mescolare agitando la piastra immediatamente dopo l'aggiunta di Baf. A questo punto è anche raccomandabile per aggiungere gli inibitori macroautophagic sequestro come controlli, ad esempio, il pan-fosfoinositide 3-chinasi (PI3K) inibitore della 3-metil adenina (3MA)¹⁹di 10 mM o 10 µM della classe selettiva di PI3K III inibitore di SAR-405²⁰.

2. raccolta e preparazione per Electrodisruption delle cellule

1. Alla fine del periodo di trattamento, aspirare il mezzo con aspirazione e aggiungere 200 µ l cella distacco di soluzione (pre-riscaldata a 37 ° C) in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C fino a staccano le cellule (in genere circa 5 min).
   Nota: Considerando che 0,25% (p/v) tripsina-EDTA può essere usato anziché la soluzione di distacco delle cellule, quest'ultimo contiene DNasi, che aiuta a ridurre la viscosità delle cellule indipendente. Fino a quando il mezzo è accuratamente aspirato, non è necessario lavare le cellule prima dell'aggiunta della soluzione di distacco di tripsina-EDTA o cella.
2. Aggiungere 500 µ l temperatura ambiente (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, contenente 2% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) in ciascun pozzetto e risospendere con la pipetta fino a quando non ciuffi di cella sono visibili. Trasferire immediatamente la sospensione cellulare per provette per microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio.
   Nota: Se non diversamente specificato, è possibile eseguire tutti i passaggi successivi sul ghiaccio.
3. Sedimenti le cellule mediante centrifugazione a 400 x g per 5 min a 4 ° C.
4. Aspirare il supernatante (con aspirazione) per lasciare il pellet cellulare più asciutto possibile.
5. Aggiungere 400 µ l 10% (p/v) di saccarosio (in ultrapura H₂O) ad ogni provetta.

3. membrana plasmatica Electrodisruption e separazione delle frazioni di totale-cellula e sedimentabili

1. Risospendere il pellet cellulare con una pipetta per ottenere una sospensione unicellulare nei pressi e trasferirlo in una cuvetta di elettroporazione di 4 mm.
   Nota: Pipettaggio altalenante ~ 10 – 15 volte, utilizzando una punta di pipetta 100 – 1.000 µ l, è in genere sufficiente.
2. Disponga la provetta in un decadimento esponenziale onda electroporator e Scarica un singolo impulso elettrico a 800 V, 25 µF e 400 Ω; Queste impostazioni producono un impulso di durata ~ 8 ms.
3. Utilizzare un nuovo puntale per trasferire la disruptate di cella a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 400 µ l di soluzione ghiacciata saccarosio di tampone fosfato (monofosfato di sodio 100 mM, 2 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA e 1,75% saccarosio, pH 7.5) e mescolare brevemente di pipettaggio.
   1. Facoltativo: Per verificare l'efficiente membrana plasmatica electrodisruption¹⁷, mescolare 10 µ l della disruptate cella diluito dal punto 3.3 con 10 µ l 0,4% Trypan blu in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Trasferire in una camera di conteggio e verificare che la percentuale di cellule positive Trypan Blue è > 99%.
      1. Lasciare il campione nella camera di conteggio per 30 min a temperatura ambiente (20 – 25 ° C) e verificare che la percentuale di cellule positive tripan blu è rimasta > 99%.
   2. Facoltativo: Per verificare che il electrodisruption non è stato troppo duro, che è, esso non ha perturbato organelli intracellulari, eseguire passaggi 1.1 – 3.3 come descritto sopra, ma utilizzare un materiale di partenza più grande (un bene da una piastra a 6 pozzetti con uno strato di cellule confluenti ~ 80%), e utilizzare 150 µ l 10% di saccarosio in passo 2.5 e 150 µ l tampone fosfato saccarosio soluzione senza DTT in fase 3.3.
      1. Utilizzare una pipetta a attentamente strato 200 µ l della soluzione diluita cella disruptate sopra un cuscino di densità 1,2 mL di mezzo gradienti di densità 8% (p/v) di tampone fosfato (ad es., 8% Nycodenz, fosfato di sodio di 50 mM, 2,2% saccarosio, 1 mM EDTA) in una centrifuga di 2 mL tubo. Centrifugare a 20.000 x g per 45 min a 4 ° C in una microcentrifuga con funzione soft-mode (per dolce accelerazione e decelerazione) e con attenzione mettere i tubi sul ghiaccio.
      2. Rimuovere delicatamente 60 µ l della frazione superiore ~ 200 µ l, facendo attenzione a non prendere qualsiasi soluzione di medio gradiente di densità e trasferire ad un tubo del microcentrifuge fresco.
         Nota: Questo dovrebbe contenere citosol di eccezionale purezza, definito "cella sap"²¹.
      3. Prova la purezza della frazione ottenuta nel passaggio precedente, eseguendo analisi western blot di proteine contenute organello, utilizzando tecniche standard e 4 – 20% gel gradiente¹⁶.
      4. Eseguire ad esempio immunoblotting per catepsina B²¹, citocromo c e isomerasi del bisolfuro della proteina, per verificare che l'elettroshock nel passaggio 3.2 non ha sconvolto i lisosomi, mitocondri o reticolo endoplasmico di massima, rispettivamente e immunoblot per LDH per verificare la presenza di una proteina citosolica nella linfa delle cellule.
      5. In parallelo, è possibile eseguire immunoblotting su estratti proteici fatti dal totale delle cellule disruptate soluzione¹⁶ per confermare che gli anticorpi utilizzati in grado di rilevare le proteine contenute in organelli che sono in fase di valutazione.
4. Ripetere i passaggi da 3.1-3.3 per ogni campione.
5. Rimuovere 550 µ l da ogni soluzione di disruptate cella diluito (ottenuta al punto 3.3) per microcentrifuga 2 mL contenente 900 tampone di risospensione ghiacciata µ l (monofosfato di sodio di 50 mM, 1 mM DTT, 1 mM EDTA e 5,9% saccarosio, pH 7.5) completati con BSA 0.5% e 0,01% Tween-20 e mescolare brevemente di pipettaggio.
6. Centrifuga a 18.000 x g per 45 min a 4 ° C per produrre il pellet contenente "sedimentato LDH". Aspirare il supernatante (con aspirazione) per lasciare i pellet più asciutto possibile. Posizionare i campioni in un congelatore a-80 ° C.
7. Trasferire 150 µ l di ogni soluzione di disruptate cella diluito (ottenuta al punto 3.3) in nuove provette e posizionare i campioni in un congelatore a-80 ° C. Utilizzare questi esempi per determinare i livelli di "totale LDH" nelle cellule.
   Nota: A questo punto l'esperimento può essere sospeso per fino a quando lo si desidera.

4. LDH estrazione e misurazione dell'attività enzimatica di LDH

1. Disgelo "LDH sedimentato" (dal punto 3.6) e "totale LDH" campioni (punto 3.7) sul ghiaccio.
2. Aggiungere 300 µ l di tampone di risospensione ghiacciata contenente 1,5% Triton X-405 a "LDH totale" campioni (producendo una concentrazione finale di Triton X-405 dell'1%). Ruotare i campioni su un rullo in una cella frigorifera (4 – 8 ° C) per 30 min.
3. Aggiungere 750 µ l di tampone di risospensione ghiacciata con 1% Triton X-405 a "LDH sedimentato" campioni e risospendere il pellet con una pipetta, fino a quando non raggiunge una soluzione omogenea.
4. Centrifugare i campioni dal punto 4.2 e 4.3 a 18.000 x g per 5 min a 4 ° C a detriti cellulari sedimento non disciolto.
5. Mix 4 parti di imidazolo freddo 65 mM (piruvato di pH 7.5)/0.75 mM con una parte dell'imidazolo freddo 65 mM (pH 7,5) / 1,8 mM NADH per ottenere una soluzione di lavoro è stabile per almeno tre settimane a 4 ° C.
6. Mescolare 3 – 30 µ l di surnatanti dal passaggio 4.4 con 200 µ l di soluzione di lavoro il passaggio 4.5.
7. Determinare la quantità di LDH misurando l'attività enzimatica LDH come il calo di nicotinamide adenindinucleotide (forma ridotta) assorbanza (NADH) a 340 nm a 37 ° C, rispetto ad uno standard con una concentrazione nota di LDH. Eseguire misure di assorbanza fino a quando la reazione si è avvicinato completamento, cioè fino a quando l'assorbanza a 340 nm non cambia con il tempo.
   Nota: Questo è il metodo classico di biochimico per misurare l'attività LDH. Anche se l'attuale protocollo esegue la reazione a 37 ° C, può anche essere eseguita a temperatura ambiente (20 – 25 ° C), che è consigliabile se facendo manuale spettrofotometria. L'attuale protocollo utilizza uno strumento di multianalyzer robotico, che in modo automatico mescola campioni con soluzione di lavoro in una piastra a 96 pozzetti e misura l'assorbanza a 340 nm a 37 ° C ogni 20 s per 3 min. Da allora in poi, il software dello strumento calcola la concentrazione di LDH, espressa come unità (U) / L, confrontando la pendenza delle misurazioni assorbanza nel tempo rispetto ad una curva standard ottenuta attraverso la calibrazione con standard di LDH noto concentrazione. La gamma lineare di rilevamento di questo approccio è 30 – 1.500 U/L. In alternativa, esiste una vasta gamma di kit commercialmente disponibili per misurare LDH. Alcuni di loro sono basati sulla reazione enzimatica per la generazione di prodotti colorimetrici o fluorescente, che permette la rilevazione di altri mezzi di spettrofotometria UV e con altre gamme lineari di rilevazione di accoppiamento.

5. calcolo del sequestro di LDH

1. Calcolare la percentuale di LDH sedimentato di LDH totale per ciascun campione, prendendo le diluizioni e campionamento in considerazione:
   Sedimentato LDH (%) =
   Nota: Durante le fasi 3.1-3.3 circa 50 µ l è perso a causa di trasferimento dentro e fuori la cuvetta di elettroporazione. Così, calcolare da avere un totale di 750 µ l (invece di 800 µ l) di disruptate di cella diluito al punto 3.3.
2. Sottrarre la percentuale di LDH sedimentato ottenuti nei campioni da cellule non trattate (punto 1.3.2) dalla percentuale di LDH sedimentato ottenuta nei campioni di cellule trattate sperimentalmente e dividere il tempo di trattamento con Baf per ottenere la percentuale di LDH sequestrato all'ora nel periodo di campionamento:
   Sequestrato LDH (% / h) =

Risultati

Utilizzando il protocollo descritto qui, attività di sequestro autofagica alla rinfusa in un certo numero di linee cellulari di mammifero diversi, tra cui LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, fibroblasti embrionali (MEFs) il mouse, RPE-1, Cellule HEK293, BJ e LNCaP è stata misurata. Sequestro è stato valutato in condizioni basali (in mezzo completo, ricco di sostanze nutritive), o in cellule acutamente affamato per il siero e gli aminoacidi (u...

Discussione

In sintesi, il protocollo descritto qui rappresenta un metodo affidabile e ampiamente applicabile per monitorare l'attività di sequestro autofagica alla rinfusa in cellule di mammifero. Rispetto per l'originale metodo^12,16, abbiamo rimosso una serie di passaggi inutili, semplificato molti dei passaggi rimanenti e presentare un downscaling sostanziale. Di conseguenza, il protocollo è notevolmente migliorato in relazione alla efficienza di costi e tempo, e la stess...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL e 2 mL	Eppendorf	211-2130 e 211-2120
piastre a 12 pozzetti	Falcon	353043
Accumax	Tecnologie cellulari innovative	A7089	Mantenere le aliquote a -20 gradi C per anni, e in frigo per qualche mese
Bafilomicina A1	Enzo	BML-CM110-0100	Sciogliere in cellule DMSO
BJ	ATCC	CRL-2522	utilizzare al passaggio < 30
Albumina sierica bovina (BSA)	VWR	422361V
Camera di conteggio Burker	Fisher Scientific	139-658585
Countess Camera di conteggio delle cellule Vetrini	ThermoFisher Scientfic	C10228
Contatore di cellule automatizzato Countess II	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Vetro di copertura per la camera	di conteggio BurkerFisher Scientific	139-658586
Criterio Tris-HCl Gel, 4– 20%, 26 pozzetti, 15 µ L, 13,3 cm x 8,7 cm (L x L)	Bio-Rad	3450034
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS)	Gibco	24010-043	contiene 0,1%
glucosio EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Cuvetta per elettroporazione (4 mm)	Bio-Rad	1652088
Elettroporatore a onde di decadimento esponenziale	BTX Harvard Apparecchiatura	EMC 630
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma	F7524	10% concentrazione finale in RPMI 1640 cellule medie
HEK293	ATCC	CRL-1573
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750	Autoclave una soluzione da 65 mM e conservare in frigorifero per mesi
Incubatrice; Incubatore a CO2 a calore diretto IR Autoflow	NuAire	NU-5510E
Lipofectamina RNAiMAX Reagente di trasfezione	ThermoFisher	13778150
cellule LNCaP	ATCC	CRL-1740	utilizzo al passaggio < 30
3-metil adenina (3MA)	Sigma-Aldrich	M9281	Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Scorta di calore a 65 ° C per 10 minuti e utilizzare a concentrazione finale di 10 mM
Microcentrifuga refrigerata	Beckman Coulter Life Sciences	368831
Microcentrifuga refrigerata con funzione soft-mode	Eppendorf	Eppendorf 5417R
MRT67307 cloridrato (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	Inibisce l'attività chinasica ULK. Dissolvere in DMSO.
Strumento multianalizzatore MaxMat	Erba Diagnostics	PL-II
Celle MCF7	ATCC	HTB-22
NADH	Merck-Millipore	1.24644.001
Nycodenz	Axis-Shield	1002424
Opti-MEM Siero ridotto Medium	ThermoFisher	31985062
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	20012-019
Puntali per pipette 3 (0,5-20 &; micro; L)	VWR	732-2223	Thermo Fischer ART Puntali barriera
Puntali per pipette (1-200 &; L)	VWR	732-2207	Thermo Fischer ART Punte barriera
Puntali per pipette (100-1.000 µ L)	VWR	732-2355	Thermo Fischer ART Punte barriera
Pipette	ThermoFisher	4701070	Finnpipette F2 GLP Kit
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	Preparare una soluzione madre da 1 mg/mL in H2O sterile. Questa soluzione è stabile a -20 ° C per almeno 1 anno.
Piruvato	Merck-Millipore	1066190050
cellule RPE-1 (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	21875-037
SAR-405	ApexBio	A8883	Inibisce la fosfoinositide 3-chinasi di classe III (PIK3C3). Dissolvere in DMSO.
Silenziatore Seleziona Controllo negativo #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
Silenziatore Seleziona siRNA mirato ATG9 (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	s35504
Silenziatore Seleziona siRNA mirato FIP200 (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	s18995
Silenziatore Seleziona siRNA mirato ULK1 (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	s15964
Silenziatore Seleziona siRNA mirato a ULK2 (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	s18705
Silenziatore Seleziona siRNA mirato a GABARAP (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	s22362
Silenziatore Seleziona siRNA mirato a GABARAPL1 (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	s24333
Silenziatore Seleziona siRNA mirato a GABARAPL2 (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	s22387
Sodio fosfato monobasico diidrato (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Millipore	1.06580.1000
Sodio fosfato bibasico diidrato (Na2HPO4 & 2H2O )	Prolabo	28014.291
Saccarosio	VWR	443816T	10% concentrazione finale in acqua; filtrare 0,45 &; m filtrare e conservare in frigorifero per mesi
Thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033	Inibisce la pompa SERCA ER Ca2+. Dissolvere in DMSO.
Triton X-405	Sigma-Aldrich	X405	1% finale
Trypan colorazione blu 0,4%	Sonde molecolari	T10282
Tripsina-EDTA (0,25% p/v tripsina)	Gibco	25200-056
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287	0,01% finale