Articolo metodologico
* These authors contributed equally
Qui è descritto un protocollo semplice ed e validato per la misurazione di massa autofagica sequestro attività in cellule di mammifero. Il metodo si basa su quantificare la percentuale di lattato deidrogenasi (LDH) in frazioni cellulari sedimentabili rispetto ai livelli LDH cellulari totali.
L'autofagia alla rinfusa è caratterizzato tramite il sequestro di grandi porzioni di citoplasma in doppio/multi-membrane strutture definite autofagosomi. Qui è descritto un semplice protocollo per monitorare questo processo. Inoltre, sono disponibili i risultati tipici e validazione sperimentale del metodo in condizioni che inducono autofagia in vari tipi di cellule di mammiferi coltivate. Durante l'autofagia alla rinfusa, autofagosomi sequestrano il citosol e quindi anche proteine citosoliche solubili, a fianco di altri carichi autofagici. LDH è una stabile e altamente solubile, abbondante enzima citosolico che è non-selettivamente sequestrata in autofagosomi. La quantità di sequestro di LDH pertanto riflette la quantità di sequestro autofagica alla rinfusa. Per efficientemente ed esattamente determinare sequestro di LDH in cellule, ci avvaliamo di un protocollo basato su electrodisruption frazionamento che separa efficacemente sedimentabili da citosolico LDH, seguita dalla misurazione dell'attività enzimatica in sedimentabili frazioni contro campioni di cellule intere. Autofagica sequestro è determinato sottraendo la proporzione di sedimentabili LDH in cellule non trattate da quello nelle cellule trattate. Il vantaggio del dosaggio di sequestro di LDH è che dà una misura quantitativa del sequestro autophagic del carico endogeno, al contrario di altri metodi che sia coinvolgere l'espressione ectopica di sequestro sonde o semi-quantitativa della proteasi analisi di protezione di autofagia marcatori o recettori.
Autofagia (greco per "auto-eating") è un processo evolutivo conservato per vacuolar/lysosomal degradazione di materiale intracellulare. Al momento della scoperta dei geni autophagy-relative ("ATG"), che sono importanti per autofagia in lievito ed in esseri umani, e la realizzazione che autophagy svolge un ruolo significativo nella salute e nella malattia (riconosciuto dal premio Nobel 2016 in medicina o fisiologia di Yoshinori Ohsumi), l'autofagia è rapidamente diventato uno dei processi più intensamente studiati in biologia cellulare1,2.
Macroautophagy (in appresso denominato "auto....
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1. cellula semina e trattamento
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Utilizzando il protocollo descritto qui, attività di sequestro autofagica alla rinfusa in un certo numero di linee cellulari di mammifero diversi, tra cui LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, fibroblasti embrionali (MEFs) il mouse, RPE-1, Cellule HEK293, BJ e LNCaP è stata misurata. Sequestro è stato valutato in condizioni basali (in mezzo completo, ricco di sostanze nutritive), o in cellule acutamente affamato per il siero e gli aminoacidi (u.......
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In sintesi, il protocollo descritto qui rappresenta un metodo affidabile e ampiamente applicabile per monitorare l'attività di sequestro autofagica alla rinfusa in cellule di mammifero. Rispetto per l'originale metodo12,16, abbiamo rimosso una serie di passaggi inutili, semplificato molti dei passaggi rimanenti e presentare un downscaling sostanziale. Di conseguenza, il protocollo è notevolmente migliorato in relazione alla efficienza di costi e tempo, e la stess.......
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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Consiglio norvegese della ricerca, dell'Università di Oslo, il Anders Jahre Foundation, la Fondazione di Nansen e l'eredità nella memoria di Henrik Homan. Ringraziamo il dottor Noboru Mizushima per il ATG5 + / + MEFs e ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu per il ATG7 + / + MEFs e ATG7-/-MEFs e Dr. Shizuo Akira per il ATG9A + + MEFs e ATG9A-/-MEFs. Ringraziamo Frank Sætre per assistenza tecnica e Dr. Per O. Seglen per discussioni costruttive metodologiche.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL e 2 mL | Eppendorf | 211-2130 e 211-2120 | |
| piastre a 12 pozzetti | Falcon | 353043 | |
| Accumax | Tecnologie cellulari innovative | A7089 | Mantenere le aliquote a -20 gradi C per anni, e in frigo per qualche mese |
| Bafilomicina A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Sciogliere in cellule DMSO |
| BJ | ATCC | CRL-2522 | utilizzare al passaggio < 30 |
| Albumina sierica bovina (BSA) | VWR | 422361V | |
| Camera di conteggio Burker | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Camera di conteggio delle cellule Vetrini | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Contatore di cellule automatizzato Countess II | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Vetro di copertura per la camera | di conteggio BurkerFisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterio Tris-HCl Gel, 4– 20%, 26 pozzetti, 15 µ L, 13,3 cm x 8,7 cm (L x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) | Gibco | 24010-043 | contiene 0,1% |
| glucosio EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Cuvetta per elettroporazione (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Elettroporatore a onde di decadimento esponenziale | BTX Harvard Apparecchiatura | EMC 630 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | F7524 | 10% concentrazione finale in RPMI 1640 cellule medie |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave una soluzione da 65 mM e conservare in frigorifero per mesi |
| Incubatrice; Incubatore a CO2 a calore diretto IR Autoflow | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamina RNAiMAX Reagente di trasfezione | ThermoFisher | 13778150 | |
| cellule LNCaP | ATCC | CRL-1740 | utilizzo al passaggio < 30 |
| 3-metil adenina (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Scorta di calore a 65 ° C per 10 minuti e utilizzare a concentrazione finale di 10 mM |
| Microcentrifuga refrigerata | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Microcentrifuga refrigerata con funzione soft-mode | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 cloridrato (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inibisce l'attività chinasica ULK. Dissolvere in DMSO. |
| Strumento multianalizzatore MaxMat | Erba Diagnostics | PL-II | |
| Celle MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Siero ridotto Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Puntali per pipette 3 (0,5-20 &; micro; L) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Puntali barriera |
| Puntali per pipette (1-200 &; L) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Punte barriera |
| Puntali per pipette (100-1.000 µ L) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Punte barriera |
| Pipette | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Preparare una soluzione madre da 1 mg/mL in H2O sterile. Questa soluzione è stabile a -20 ° C per almeno 1 anno. |
| Piruvato | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| cellule RPE-1 (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inibisce la fosfoinositide 3-chinasi di classe III (PIK3C3). Dissolvere in DMSO. |
| Silenziatore Seleziona Controllo negativo #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silenziatore Seleziona siRNA mirato ATG9 (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silenziatore Seleziona siRNA mirato FIP200 (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silenziatore Seleziona siRNA mirato ULK1 (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silenziatore Seleziona siRNA mirato a ULK2 (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silenziatore Seleziona siRNA mirato a GABARAP (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silenziatore Seleziona siRNA mirato a GABARAPL1 (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silenziatore Seleziona siRNA mirato a GABARAPL2 (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodio fosfato monobasico diidrato (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodio fosfato bibasico diidrato (Na2HPO4 & 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Saccarosio | VWR | 443816T | 10% concentrazione finale in acqua; filtrare 0,45 &; m filtrare e conservare in frigorifero per mesi |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inibisce la pompa SERCA ER Ca2+. Dissolvere in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% finale |
| Trypan colorazione blu 0,4% | Sonde molecolari | T10282 | |
| Tripsina-EDTA (0,25% p/v tripsina) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0,01% finale |
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