Costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare

Summary

Per un controllo efficace della zanzara a carico di trasmissione del virus, la conoscenza del potenziale vettoriale delle rispettive zanzare è di particolare interesse. Descriviamo la salivazione forzato come un metodo per analizzare la competenza vettoriale di Aedes albopictus e tre diversi Culex taxa per la trasmissione del virus di Zika.

Abstract

Competenza vettoriale è definito come il potenziale di una specie di zanzara per trasmettere un virus zanzara (mobovirus) ad un ospite vertebrato. Particelle di virus vitale vengono trasmessi durante un pasto di sangue tramite la saliva di una zanzara infetta. Saggi di salivazione forzata consentono di stabilire il potenziale di vettore sulla base di singole zanzare, evitando l'uso di esperimenti sugli animali. Il metodo è adatto per analizzare un gran numero di zanzare in un esperimento entro un breve periodo di tempo. Analisi di salivazione forzata sono state usate per analizzare 856 individuali zanzare intrappolate in Germania, tra cui due diversi biotipi di Culex pipiens pipiens , Culex torrentium nonché Aedes albopictus, che sono stati infettati sperimentalmente con il virus di Zika (ZIKV) e incubate a 18 ° C o 27 ° C per due o tre settimane. I risultati hanno indicato la mancanza di competenza vettoriale dei taxa diversi Culex per ZIKV. Al contrario, Aedes albopictus era suscettibile di ZIKV, ma solo a 27 ° C, con velocità di trasmissione simile a una colonia di laboratorio di Aedes aegypti testata in parallelo.

Introduction

Nel 2015, virus di Zika (ZIKV), un virus zanzara (mobovirus), appartenente alla famiglia dei Flaviviridae, emerse in Colombia e in Brasile e si diffuse rapidamente in tutta l'America e i Caraibi, causando un'epidemia con un notevole numero di associati casi clinici di microcefalia e sindrome di Guillain-Barré¹. Le zanzare della specie Aedes aegypti e Aedes albopictus sono considerate i vettori primari e secondari di ZIKV², ma altre specie del genere Aedes hanno anche dimostrato di avere competenza vettoriale sperimentale³ . A differenza delle specie Aedes , la maggior parte della specie Culex testato finora non sono in grado di trasmettere il virus⁴. Semplicemente, i dati per Culex quinquefasciatus fornito risultati inconcludenti³. Allo stato attuale, manca un'informazione su competenza vettoriale zanzara per ZIKV in condizioni di temperatura moderata (< 20 ° C). Tuttavia, queste informazioni sono notevole per le valutazioni del rischio di spread possibili alle regioni con clima temperato come l'Europa centrale.

Un vettore competente per ZIKV è in grado di acquisire, mantenere, amplificare e infine trasmettere il virus. Di conseguenza, test zanzara corpi o parti di corpi, tra le gambe, del midgut, testa o ghiandole salivari, per ZIKV non è sufficiente per determinare la competenza vettoriale. È obbligatorio per verificare per particelle virali infettive all'interno della saliva rilasciata. Per valutare la competenza vettoriale, sia il tasso di infezione (IR, numero di corpi di zanzara ZIKV-positivo per il numero di zanzare gonfio) e velocità di trasmissione (TR, numero di zanzare con la saliva ZIKV-positivo per il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivi), devono essere determinato. IRs di zanzare possono essere facilmente analizzati dalle zanzare semplicemente omogeneizzazione, seguite da una reazione a catena d'inversione-transcriptase della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR) ZIKV di targeting. Inoltre, l'infezione può essere ulteriormente caratterizzato determinando i numeri di copia virale per zanzare. Al contrario, l'analisi dei tassi di trasmissione si basa sulla rilevazione delle particelle di virus vitale nella saliva delle zanzare individuali. Ciò può essere ottenuto alimentandosi di zanzare infette su animali ospite suscettibile, seguiti dall'analisi della viremia in host⁵. Tuttavia, questo metodo si basa sugli organismi di modello adatto ed è costoso e limitato dalle norme di benessere degli animali. Per evitare l'uso degli animali da laboratorio per l'analisi dei tassi di trasmissione e di ridurre i costi, ri-sistemi di alimentazione artificiale usando il sangue le goccioline sono stati descritti⁶. Tuttavia, test su scala individuale combinato con un elevato numero di individui è difficile e richiede tempo. La prima descrizione di un dosaggio di salivazione su scala individuale è stata pubblicata nel 1966⁷ e durante gli anni recenti, salivazione forzata esperimenti sono diventati il metodo di scelta per valutare la competenza di vettore di zanzare^3,8 .

Basato sul nostro studio di competenza vettoriale di Europa centrale le zanzare recentemente pubblicato⁹, descriviamo forzata salivazione, come riportato da Anderson et al. ⁸ con alcune modifiche. Questo metodo consente a resa elevata standardizzata esperimenti in condizioni di biosicurezza alto livello (BSL-3) e include l'identificazione del virus attivo di cultura basata su cellule saggi. Gli esperimenti descritti qui includono 856 zanzare. Sono stati infettati con ZIKV da farine di sangue artificiale e successivamente analizzati per la presenza di particelle virali infettive nella saliva. Le zanzare introdotte in esperimenti comprendeva due laboratorio consolidata popolazioni di biotipo Ae. aegypti e Culex pipiens pipiens molestus (Cx. p. molestus), come pure il campo catturato Culex pipiens pipiens biotipo pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) e due popolazioni di Ae. albopictus . Con l'eccezione di una delle due popolazioni Ae. albopictus , che è stato raccolto in Italia, tutte le zanzare sono stati raccolte in Germania.

Protocol

1. preparare le zanzare femmina

1. Raccogliere le zanzare da una gabbia grande utilizzando un aspiratore (circa 400 zanzare per grande gabbia).
2. Anestetizzare le zanzare con l'anidride carbonica (CO₂) per 7 s.
3. Ordinare 20 femmine per flaconcino in plastica (Ø 50 mm × 100 mm).
   Nota: Se le zanzare si svegliano, utilizzare un altro 3 s di CO_2.
4. Morire di fame le zanzare durante la notte.

2. artificiale farine di sangue

Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.

1. Preparare il pasto di sangue infettivo.
   1. Diluire lo stock di virus alla concentrazione di 1 x 10⁸ placca formando unità (PFU) / mL.
      Nota: La concentrazione di magazzino è stata determinata eseguendo il metodo di coltura del tessuto infezione dose 50 (TCID50) e calcolata da Spearman & Kärber algoritmo^10,11.
   2. Mix scaduto sangue umano (conservazione del sangue) dalla banca del sangue (non adatto per umano piu ', ma utile per le zanzare) con fruttosio (soluzione all'8%), filtrato siero bovino (FBS) e soluzione di lavoro dello stock virus (umano sangue: fruttosio: FBS è scaduto: soluzione di lavoro = 5:3:1:1).
      Nota: Abbiamo scelto il sangue umano, perché questo è l'ospite mammifero naturale noto di ZIKV.
2. Congelare 140 µ l di miscela di farine di sangue per ulteriori analisi tramite TCID50.
3. Eseguire la nutrizione artificiale utilizzando diversi metodi di alimentazione, a seconda della specie:
   1. Aedes aegypti: utilizzare una membrana sistema di alimentazione per 30 min (1 mL / alimentatore).
   2. Culex spp.: fornire il sangue infettivo tramite un bastoncino di cotone durante la notte e non riscaldare il sangue (300 µ l per flaconcino).
   3. Aedes albopictus: mettere due gocce (50 µ l) del mix di farine di sangue nella fiala di plastica e lasciare che le zanzare feed per 2 h. Non riscaldare il sangue.
      Nota: Le zanzare confluiranno nel primo 15 min. Il tempo di incubazione prolungata è necessario per ragioni di sicurezza. Le goccioline di sangue vengono drenate dopo 2 h, che così si riduce il rischio di contaminazione durante l'ordinamento di alimentato le zanzare.
4. Anestetizzare le zanzare con CO₂ per 7 s.
   Nota: Se le zanzare si svegliano, utilizzare un altro 3 s di CO₂.
5. Ordinamento e totali completamente gonfio le zanzare in un nuovo flacone.
6. Aggiungere un batuffolo di cotone, saturato di fruttosio (8% soluzione) tra il flaconcino e una spina.
7. Mantenere le zanzare alla temperatura di 18 ° C o di 27 ° C dell'umidità dell'80% designata per 14 o 21 giorni.
8. Nutrire le zanzare con tamponi di cotone saturato di fruttosio. Ricostituire ogni 72h con 1,5 mL di fruttosio (8% soluzione) per flaconcino (fino a 20 zanzare, a seconda l'alimentazione frequenza, vedere passaggio 2.5).

3. costretto salivazione saggio il giorno 14 o 21

Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.

1. 2 x 10⁴ cellule Vero di semi / per pozzetto in un 96 bene piastra con 200 µ l di terreno di coltura (Dulbecco´s modificato supplementato eagle (DMEM) con 3% FBS, 100 U/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina, 5 µ g/mL anfotericina B, 2 mM L-Glutammina 1% non essenziali aminoacidi (NEAA), piruvato di sodio 1%).
2. Preparare il dispositivo di salivazione:
   1. Posizionare una lastra di vetro quadrato (20 × 20 cm) sul banco in un angolo di 30°.
      Nota: Questa è necessaria a causa di depressione nel laboratorio di sicurezza. Se la piastra è orizzontale o verticale, sarà perdita di liquido.
   2. Posizionare il nastro biadesivo sulla parte superiore della lastra di vetro.
   3. Ruolo l'argilla di modellistica fino a quando raggiunge un diametro di 0,5 cm e attaccarlo in orizzontale 1 cm di distanza il nastro adesivo su due lati.
   4. Tagliare i primi 0,3 cm della punta di una punta di filtro 10 µ l.
      Nota: Si consiglia di preparare questo prima di iniziare l'esperimento di fuori del laboratorio di biosicurezza.
   5. Riempire i puntali con filtro con 10 µ l di tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4).
   6. Posizionare i puntali con filtro sull'argilla di modellistica con la punta verso il nastro adesivo.
   7. Fissare le punte di filtro con una leggera pressione.
3. Preparare le zanzare:
   1. Anestetizzare le zanzare con CO₂.
   2. Rimuovere le gambe e le ali per immobilizzare le zanzare.
   3. Difficoltà la zanzara vivente corpi sul nastro appiccicoso sopra una punta di filtro.
   4. Inserire delicatamente la proboscide la punta del filtro.
   5. Eseguire il test di salivazione per 30 min.
   6. Rimuovere i puntali con filtro ed eliminare l'argilla e il nastro.

4. elaborazione della Saliva

Nota: Passaggi 4.1 – 4.6.2 vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.

1. Espellere il contenuto nelle provette di reazione contenente 10 µ l di PBS.
2. Mescolare delicatamente e trasferire il contenuto nei pozzetti della piastra ben 96 preparati utilizzando un pozzetto per campione.
3. Incubare la piastra per 7 giorni a 37 ° C con 5% CO₂.
4. Utilizzare il binocolo per controllare le cellule per la presenza di effetto citopatico (CPE).
5. Se il pozzo è positivo per CPE, raccogliere il surnatante di pipettaggio 140 µ l in una provetta di reazione per l'estrazione di RNA.
6. Purificare il RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA.
   1. Mix 140 µ l del surnatante con 560 µ l di AVL buffer (buffer di lisi virale) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   2. 560 µ l di etanolo (96%) e vortexare il campione.
      Nota: I campioni sono inattivati dopo questo passaggio e possono essere scaricati dal laboratorio BSL-3.
   3. Dispensare 630 µ l del campione su una colonna e la centrifuga con 6.000 x g per 1 min.
   4. Scartare il filtrato, dispensare il restante µ l 630 sulla colonna, quindi ripetere la centrifugazione.
   5. Lavare il RNA, associato alla membrana della colonna, aggiungendo 500 µ l di tampone 1 per la colonna e la centrifuga di lavaggio a 6.000 x g per 1 min.
   6. Gettare la provetta di raccolta e posizionare la colonna in una nuova provetta di raccolta. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio 2 e centrifugare a 12.500 x g per 3 min.
   7. Gettare la provetta di raccolta e posizionare la colonna in una provetta di reazione di 1,5 mL.
   8. Aggiungere 50 µ l di tampone di eluizione e incubare per 1 min a temperatura ambiente.
   9. Centrifugare a 6.000 x g per 1 min e poi scartare la colonna.
7. Analizzare i campioni per ZIKV RNA tramite RT-qPCR.

5. il trattamento dei corpi di zanzara

Nota: Passaggi 5.1 – 5.5 vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.

1. Rimuovere i corpi della zanzara e collocare ogni corpo in una provetta di reazione.
   Nota: È possibile mettere in pausa l'esperimento a questo punto e conservare i campioni a-80 ° C.
2. Aggiungere 500 µ l di media di omogeneizzazione (DMEM senza eventuali supplementi) nella provetta di reazione.
3. Omogeneizzare il corpo usando motore sbattitore e utilizzare un pistillo nuovo per ogni campione.
4. Aggiungere 200 µ l di omogenato in una piastra a 96 pozzetti per la purificazione.
   Nota: È possibile mettere in pausa l'esperimento a questo punto e conservare i campioni a-80 ° C.
5. Inattivare la piastra mediante incubazione per 60 min a 60 ° C.
6. Purificare il RNA da purificazione automatizzata degli acidi nucleici.
   Nota: È possibile mettere in pausa l'esperimento a questo punto e conservare i campioni a-80 ° C.

6. analisi

1. Quantificare le copie di RNA virale usando RT-qPCR.
   Nota: Le copie di RNA erano una media sopra tutti i corpi di zanzara ZIKV-positiva e senza includere le zanzare ZIKV-negativi.
2. Calcolare l'IR, definito come il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivo per il numero di femmine nutrite.
3. Calcolare il TR, definito come il numero di zanzare con la saliva ZIKV-positivo per il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivi. Impossibile calcolare la velocità di trasmissione per combinazioni di specie e temperatura con nessun corpo ZIKV-positivi.

Results

Aedes aegypti è noto come vettore competente per ZIKV almeno sotto condizioni climatiche tropicali¹². Di conseguenza, abbiamo usato Ae. aegypti come controllo positivo per stabilire il dosaggio e analizzare IRs come pure TRs a una temperatura di incubazione di 27 ° C e un'umidità dell'80%. IR e TR sono stati definiti come precedentemente descritto da Fortuna et al. ¹³. contestato Ae. aegypti ha mostrato IR del 50% e 72% e TR del 42% e 31% a 14 e 21 giorni post infezione (dpi), rispettivamente (Figura 1A e 1B). Successivamente, le zanzare europee sono state testate per infezione ZIKV e trasmissione utilizzando condizioni climatiche tropicali così come temperate.

Temperatura di incubazione di 27 ° C, tutte le specie di zanzare ha mostrato l'infezione di ZIKV alle 14 dpi, nonché 21 dpi, tranne Cx. p. pipiens e Cx. torrentium individui, che è stata positiva solo 14 dpi. Tutte le specie di Aedes ha mostrato maggiore IRs (tra 50% e 72%) così come più alta concentrazione di RNA virale (10⁶ fino a 10 campioni di copie/zanzara⁹ RNA) in confronto i diversi taxa di Culex , che ha rivelato IRs che varia tra 0 % e 32% e carichi virali di 10³ a 10 esemplari di⁴ RNA copie/zanzara. Tutte le specie di Aedes visualizzato saliva ZIKV-positiva (TR 13 – 42%), mentre nessuno dei campioni di saliva dai taxa di Culex contenute ZIKV (Figura 1A e 1B). Interessante, velocità di trasmissione alle 21 dpi erano simili in Ae. aegypti e Ae. albopictus dalla Germania (30%), ma erano sostanzialmente più bassi in Ae. albopictus dall'Italia (13%).

Incubazione di zanzare sfidate ad una temperatura moderata di 18 ° C ha rivelato generalmente inferiore virus viene caricato nelle specie Aedes (⁴– 10 10⁶ RNA copie/zanzara) così come in diversi taxa di Culex (10^{2 –}10⁴ RNA copie/zanzara). Tuttavia, alla temperatura di incubazione di 18 ° C, trasmissione di ZIKV non è stata osservata per una delle specie di zanzara studiato.

Figura 1: tassi di trasmissione di zanzare infettati sperimentalmente con ZIKV. Risultati di studi di competenza vettoriale con ZIKV in specie diverse zanzare. Sei zanzara diversi taxa sono stati infettati con ZIKV e incubate a 27 ° C, 18 ° C per 14 (A) o 21 (B) giorni. TR è definito come il numero di zanzare con la saliva ZIKV-positivo per il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivi. Il numero totale di zanzare studiato era 856, con un minimo di 30 persone per ogni taxa di zanzara/temperatura/punto di tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Precedentemente è stato indicato che i risultati ottenuti con salivazione forzata sono in linea con la classica rialimentazione esperimenti⁶. Tuttavia, ri-alimentazione esperimenti sia in nostro metodo presentato della salivazione forzata, è Impossibile direttamente prova attività salivazione o monitorare il rilascio di saliva. Per dimostrare l'attività di salivazione, campioni potrebbero essere testati per altri componenti presentano nella saliva (ad es., proteine, carboidrati, ecc.). Inoltre, ulteriori qPCRs dovrebbe consentire il rilevamento di copie di RNA virale. Questo, tuttavia, richiede frazionamento dei campioni di saliva per varie analisi, che possono limitare la sensibilità nell'analisi della cultura delle cellule in caso di numeri di particelle molto basso. A sua volta, questo potrebbe portare ad una sottovalutazione dei tassi di trasmissione determinato.

Per ottenere risultati riproducibili, è necessario garantire che tutte le zanzare rimanere in vita fino alla fine dell'esperimento. Questo è controllato controllando visivamente l'attività di movimento del corpo delle zanzare. Inoltre, l'uso del principio del dosaggio salivazione per una specie di zanzara dato deve essere testato alimentando virus di controllo, che sono conosciuti per essere trasmesso da questa specie di zanzara specifici. Viceversa, ogni virus introdotti in un esperimento deve essere testato in una zanzara suscettibile.

Saggi di salivazione forzata hanno molti vantaggi. Un numero elevato di zanzare possa essere testato contemporaneamente su un singolo esemplare base in condizioni standardizzate controllate senza entrare in conflitto con norme di benessere degli animali⁹.

Il metodo è utilizzato da diversi laboratori. Tuttavia, messe a punto esatti può variare, che può portare a differenze nei risultati tra i laboratori. Un componente critico è il capillare per raccogliere la saliva, che può essere fatto di vetro¹⁴ o plastica¹⁵. Per rispettare le norme di sicurezza ad alta di un insectary di livello 3 di biosicurezza, abbiamo usato plastica puntali con filtro invece di tubi capillari in vetro, riducendo così il rischio di lesioni. Inoltre, puntali con filtro hanno il vantaggio che il liquido raccolto possa essere trasferito facilmente utilizzando una pipetta.

L'installazione del dosaggio salivazione forzata qui presentato è basato su due ricercatori lavorano insieme e la condivisione di compiti. Smobilitazione della zanzara viene eseguita da una sola persona, mentre l'altro prepara simultaneamente l'installazione forzata salivazione. Ciò notevolmente riduce i tempi di movimentazione e minimizza il rischio di campione di commutazione come cambiare tra la smobilitazione-luogo di lavoro e la salivazione-piastra non è necessario. Inoltre, esso consente di posizionare le zanzare sul dispositivo salivazione forzato immediatamente dopo la smobilitazione. Questa zanzara piuttosto breve tempo di trattamento è essenziale per il successo salivazione forzata. Infine, le zanzare possono essere controllate direttamente per motilità in tutta l'intero esperimento.

Il dosaggio di salivazione presentato qui è usato per avere una chiara comprensione del potenziale vettoriale di specie di zanzare. Tuttavia, per rispondere a domande specifiche (ad es., i numeri di punture di zanzare che sono necessari per infettano i vertebrati), animale esperimenti potrebbero essere ancora necessari.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inject + matic Sleeper	Inject + matic
Bugdorm-1 Gabbia per l'allevamento di insetti	BugDorm Store
Tubi di coltivazione Drosophila	carl roth	PK11.2	fiala di plastica per zanzare
Plug per tubi di coltivazione drosophila	carl roth	PK15.1
Camera climatica costante	Binder	KBF-240
Sangue			umano conservato, scaduto, non utilizzabile per applicazioni mediche
Dumont-Pincette Electronic SS	Dumont	B40c
Vero cells	BNITM
Flash light aspirator	Bioquip	2809
nastro			nessun fornitore specifico
Gammex Guanti senza polvere con AMT	Ansell		per motivi di sicurezza necessario durante il lavoro con le punture nel laboratorio BSL3
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit	altona diagnostica	591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit	Thermo fisher scientific		4462359 Isolamento dell'RNA dei corpi delle zanzare
Qiamp viral RNA Mini Kit	Qiagen	52906	RNA-Isolamento del filtro surnatante
punte (20 µ L)	Sarstedt	701,116,210	Tagliare i primi 3 mm della punta del
motore manuale mixer	carl roth	esaurito
micro pestelli per motore manuale	mixer carl roth	CXH8.1
DMEM		P0403550
L Glutammina Penicilina/Streptomicina	PAN	P0819100
Amfotericina B	PAN	P06-0110
Fruttosio	carl roth	4981.5
Soluzione salina tamponata con fosfato	PAN	P04-36500
FBS	PAN
Sodio Pyruvat	PAN	P0443100
MEM NAA	PAN
Hemotek Hemotek		PS6
Light Cycler	Roche	480 II
Light Cycler Software	Roche	480 SW 1.5.1
Argilla			da modellare nessun fornitore specifico
King Fisher Flex Sistema di purificazione	ThermoFisher scientific
Aedes albopictus			le uova sono state raccolte a Friburgo, Germania
Binocolo	MOTIC	SMZ-168
Lampada binoculare	MOTIC	MLC-150C
CO2-Incubator	Thermo scientific	MIDI 40