Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Sommario

Il protocollo qui descritto si basa sulla quantificazione genoma di nuova sintesi mRNA purificato da cellule di lievito etichettate con 4-tiouracile. Questo metodo permette di misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione del mRNA e, quindi, fornisce una misurazione accurata della trascrizione del RNA polimerasi II.

Abstract

Globali difetti nella trascrizione del RNA polimerasi II potrebbero essere trascurati dagli studi di trascrittomica analizzando RNA allo steady-state. Infatti, la diminuzione globale nella sintesi del mRNA è stata indicata per essere compensata da una diminuzione simultanea nella degradazione di mRNA per ripristinare i livelli normali di stato stazionario. Quindi, la quantificazione del genoma di sintesi di mRNA, indipendentemente dalla degradazione del mRNA, è il miglior riflesso diretto dell'attività trascrizionale di RNA polimerasi II. Discutiamo qui, un metodo che utilizza non perturbante metabolica etichettatura degli RNA nascente in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). In particolare, le cellule sono coltivate per 6 min con un uracile analogico, 4-tiouracile e il RNAs recentemente trascritto con etichettato è purificato e quantificato per determinare i tassi di sintesi di tutti i singoli mRNA. Inoltre, utilizzando etichettati Schizosaccharomyces pombe cellule come standard interno permette di confrontare la sintesi di mRNA in diversi S. cerevisiae ceppi. Usando questo protocollo e montaggio i dati con un modello cinetico dinamico, i corrispondenti tassi di decadimento di mRNA possono essere determinati.

Introduzione

Le cellule rispondono a stimoli endogeni ed esogeni, attraverso l'alterazione dinamica del loro programma di espressione genica. Negli ultimi anni, un enorme sviluppo di metodologie di genoma permette la descrizione precisa e completa delle modifiche del trascrittoma in condizioni diverse. Nella maggior parte degli studi di transcrittomica, sequenziamento di ibridazione o ad alta velocità di microarray vengono utilizzati per quantificare i livelli di RNA da una frazione di RNA totale allo steady-state. Modifiche trascrizionali sotto una perturbazione specifica possono visualizzare una vasta gamma di risultati possibili, con un ampio spettro di geni essere up - o downr....

Protocollo

1. cellula coltura e lo svuotamento di rapamicina di una subunità SAGA

1. Per ogni ceppo di S. cerevisiae e replicare, tra cui wild type o ceppi di controllo, inoculare una singola Colonia da una piastra fresca al 5 mL di terreno YPD (2% Peptone, Estratto di lievito 1% e 2% di glucosio).
2. Crescere le cellule di S. cerevisiae durante la notte a 30 ° C con agitazione costante (150 rpm).
3. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) e diluire la cultura a un OD₆₀₀ di circa 0,1 in 100 mL di mezzo YPD e far crescere fino a quando il OD₆₀₀ è intorno a 0,8.
4. In parallelo, inoculare una singol....

Risultati

Quando si esegue etichettatura metabolica di RNA appena trascritto, diversi aspetti devono essere controllati: il tempo e l'efficienza dell'etichettatura, la proporzione di spike-a, il protocollo di estrazione e l'efficacia di biotinilazione (compreso signal-to-noise ratio), tra gli altri. Queste condizioni sono stati ampiamente e metodicamente indicate da altri^7,10,11. Qui ci concentriamo princi.......

Discussione

Mentre per analizzare i cambiamenti nella trascrizione del genoma strumenti ancora stanno migliorando, l'esclusiva analisi del trascrittoma attraverso la quantificazione dei livelli allo stato stazionario di RNA potrebbe non riflettere accuratamente le modifiche nell'attività di RNA polimerasi II. Infatti, i livelli di mRNA sono regolati non solo dalla sintesi di RNA, ma anche dalla loro maturazione e degradazione. Per misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione di mRNA, distinti protocolli sono stati svil.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4-Thiouracil	Sigma-Aldrich	Cat# 440736
Rapamicina	Euromedex	Cat# SYN-1185
Countess II FL Contatore di cellule automatizzato	ThermoFisher	N/A
Kit di purificazione dell'RNA RiboPure, lievito	ThermoFisher	Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spettrofotometro	ThermoFisher	ND-2000
Kit TURBO senza DNA	ThermoFisher	AM1907
EZ-Link HPDP Biotina	ThermoFisher	Cat# 21341
Tiolutin	Abcam	ab143556
µ Kit di streptavidina MACS	Miltenyi Biotec	Cat# 130-074-101
Trascrittore Trascrittasi inversa	Roche	03 531 295 001
SYBR Green I Master	Roche	4707516001
GeneChip Genoma del lievito 2.0	ThermoFisher	900555
GeneChip Fluidics Station 450	ThermoFisher	00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G	ThermoFisher	00-0210