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Articolo metodologico

Una nuova tecnica chirurgica come una Fondazione per In Vivo parziale ingegneria del fegato nel ratto

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DOI:

10.3791/57991

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6 ottobre 2018

 ,  ,  ,  , 
1Experimental Transplantation Surgery, Department of General, Visceral and Vascular Surgery, University Hospital Jena

In questo articolo

Sommario

Stabiliamo una nuova tecnica chirurgica per un modello di aspersione del singolo lobo del fegato in vivo nel ratto come prerequisito per ulteriormente lo Studio in vivo fegato parziale Ingegneria in futuro.

Abstract

Ingegneria dell'organo è una nuova strategia per generare sostituti di organo del fegato che possono essere potenzialmente utilizzati nel trapianto. Recentemente, in vivo del fegato di ingegneria, compreso in vivo decellularizzazione organo seguita da ripopolamento, è emerso come un promettente approccio sopra ingegneria ex vivo del fegato. Tuttavia, la sopravvivenza postoperatoria non è stata realizzata. Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una nuova tecnica chirurgica di in vivo aspersione selettiva lobo del fegato in ratti come prerequisito per l'ingegneria in vivo del fegato. Generiamo un circuito di bypass solo attraverso il lobo laterale sinistro. Quindi, lobo laterale sinistra è irrorato con soluzione fisiologica eparinizzata. L'esperimento è eseguito con 4 gruppi (n = 3 ratti per gruppo) basato su tempi diversi aspersione di 20 min, 2h, 3h e 4h. sopravvivenza, come pure il cambiamento in modo macroscopico visibile di colore e istologicamente determinato assenza di cellule del sangue nella triade portale e i sinusoids, è considerato un indicatore per una struttura di modello di successo. Dopo aspersione selettiva del lobo laterale sinistro, osserviamo che il lobo laterale sinistra, infatti, trasformato da rosso a giallo debole. In una valutazione istologica, non le cellule del sangue sono visibili nel ramo della vena portale, la vena centrale e sinusoidi. Il lobo laterale sinistro diventa rosso dopo la riapertura dei vasi bloccati. 12/12 ratti è sopravvissuto la procedura per più di una settimana. Siamo i primi a segnalare un modello chirurgico per in vivo di aspersione singolo lobo del fegato con un periodo di sopravvivenza lunga di più di una settimana. In contrasto con il rapporto precedentemente pubblicato, il vantaggio più importante della tecnica presentata qui è che l'aspersione del 70% del fegato è mantenuto durante tutta la procedura. L'istituzione di questa tecnica fornisce una base per in vivo parziale ingegneria del fegato in ratti, tra cui decellularizzazione e ricellularizzazione.

Introduzione

Le indicazioni per trapianto dell'organo sono in continua espansione. Al contrario, tassi di donazione di organi e la qualità complessiva degli organi sono in declino, che conduce ad una crescente domanda per gli innesti. Il numero di candidati aggiunto alla lista d'attesa di trapianto di fegato ha continuato ad aumentare (ad es., negli Stati Uniti, 11.340 pazienti sono stati aggiunti nel 2016, confrontato con 10.636 nel 2015)1. Nonostante i notevoli sforzi, il numero di organi disponibili non soddisfa le esigenze cliniche. A causa dell'incidenza aumentata di malattia epatica, molti pazienti con stadio finale muore di malattie del fegato in lista d'attesa di trapianto prima di un organo del donatore diventa disponibile. Per soddisfare l'enorme richiesta di innesti di fegato da donatore, approcci alternativi usando il tessuto del fegato, principi di ingegneria sono stati attivamente perseguito2. Al giorno d'oggi, una nuova concezione tecnica biologica di ingegneria del fegato potrebbe potenzialmente superare questa carenza.

Ingegneria del fegato è costituito da due passaggi: la generazione di un'impalcatura acellulare, seguita da un ripopolamento dell'impalcatura. Per ottenere un'impalcatura del fegato acellulare biologica, il fegato espiantato è irrorato tramite il sistema vascolare con detergenti ionici e non ionici, in grado di rimuovere il materiale cellulare dal fegato. Nella maggior parte degli studi precedente, un'impalcatura di fegato acellulare biologica è stata realizzata tramite aspersione del fegato con una combinazione di solfato dodecilico di sodio e TritonX100. Di conseguenza, tutte le cellule sono state rimosse, mentre è stata mantenuta la struttura della matrice extracellulare. I ponteggi di organo erano reseeding con cellule mature, danno epatocellulare, nonché linee di cellule endoteliali ed epatociti primari con o senza l'applicazione simultanea di cellule endoteliali o cellule staminali mesenchimali (MSC). Maggior parte dei focus di ricercatori sulla ex vivo del fegato ingegneria3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Tuttavia, nella maggior parte degli studi precedente, solo piccoli pezzi di cubi ripopolato patibolo sono stati trapiantati in siti di impianto heterotopic differenti. In alcuni studi, impalcature ripopolate parziale sono state trapiantate come un innesto ausiliario. Tuttavia, il tempo di sopravvivenza massima segnalata era solo 72 h8,14. Per quanto ne sappiamo, trapianto ortotopico di un innesto completo del fegato ripopolato non ancora è stato eseguito o pubblicato su. La funzione a lungo termine e il trapianto di organi ingegnerizzati sono ancora nella loro infanzia. Pertanto, è necessario un approccio alternativo all'ingegneria ex vivo del fegato.

In vivo del fegato ingegneria può rappresentare un'alternativa per lo studio di ripopolamento epatico in condizioni fisiologiche. I vantaggi dell'ingegneria in vivo del fegato rispetto all' ex vivo del fegato ingegneria sono molteplici. L'impalcatura parziale del fegato in vivo ripopolata è sottoposto alla perfusione fisiologico del sangue con temperatura adeguata, sufficiente ossigeno, sostanze nutritive e fattori di crescita in contrasto con ex vivo aspersione con terreno di coltura artificiale. Inoltre, il rimanente fegato normale parziale mantiene la funzione epatica, principalmente permettendo la sopravvivenza a lungo termine. Poiché un impiantato ex vivo progettato dell'innesto del fegato è ancora incapace di sostenere la sopravvivenza a lungo termine degli animali da esperimento tramite la funzione epatica8, immaginiamo che in vivo parziale del fegato engineeringwould diventare in definitiva un modello promettente per approfondire ulteriormente l'evoluzione dei fegati ingegnerizzati con osservazioni di sopravvivenza più lunghe rispetto ex vivo.

Recentemente, un gruppo di ricerca (Pan e colleghi) ha presentato, per la prima volta, una tecnica di fegato in vivo 15di ingegneria. Hanno raggiunto l'aspersione isolata del lobo inferiore di destra del fegato in ratti viventi nonostante sfide Anatomiche e tecniche. Hanno riferito i primi risultati intraoperative di ripopolamento in vivo utilizzando una linea cellulare degli epatociti primari di ratto. Tuttavia, il modello di aspersione chirurgica in vivo di Pan et al. ha svantaggi. Hanno raggiunto la perfusione di singolo lobo del fegato in ratti a scapito di bloccare completamente la vena portale e la vena cava inferiore, che può causare gravi danni all'animale. I ratti sperimentali sono stati sacrificati dopo solo 6 ore di tempo di osservazione intraoperatoria. Pertanto, la tecnica di aspersione del lobo del fegato in vivo ha bisogno di ulteriore miglioramento ai fini della sopravvivenza postoperatoria.

Abbiamo sviluppato un modello di sopravvivenza romanzo per in vivo di aspersione lobo del fegato, sulla base di precedenti studi di anatomia epatica del ratto16, la tecnica di inserimento di una canula della vena portale per il monitoraggio emodinamico in topi17e Bioingegneria del fegato 18 , 19. i passaggi principali per la procedura sono illustrati in Figura 1A - 1E.

Questa tecnica è adatta per chi desidera utilizzare questo modello sperimentale in vivo di aspersione per ricerca di base sul trattamento parziale dell'organo da infusione con le droghe, in vivo decellularizzazione come una resezione chimica per le malattie dell'organo (per esempio. , cancro del fegato), in vivo coltura cellulare in una matrice decellularizzata confrontando ex vivo bidimensionale e tridimensionale delle cellule cultura sistemi20,21,22,23 , 24 , 25 , 26e in vivo del fegato di ingegneria di decellularizzazione e ripopolamento.

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Protocollo

L'alloggiamento e tutte le procedure effettuate erano in conformità con la legislazione tedesca sul benessere degli animali. Tutte le garze, rivestimento vestiti e strumenti chirurgici sono sterilizzati in autoclave e preparati prima dell'operazione. Tutte le procedure vengono eseguite in condizioni sterili.

1. preparazione del ratto per la procedura chirurgica

  1. Posizionare il ratto in una camera di induzione e anestetizzare il topo con isoflurano vaporizzato il 4% e 100% ossigeno a 0,5 L/min per circa 3 minuti, fino a quando il ratto è completamente anestetizzato.
  2. Prendere il topo dalla camera di induzione e misurare il suo peso corporeo.
  3. Radere il pelo della regione chirurgica sull'addome.
  4. Posto sul retro degli animali nella camera di isoflurane per altri 2 minuti approfondire l'anestesia.
  5. Posizionare il ratto sul tavolo operatorio in posizione supina.
  6. Fissare la maschera di anestesia nella regione di bocca del ratto e tenere l'animale anestetizzato con un flusso continuo di gas del 2% vaporizzato isoflurano e 100% ossigeno ad una portata di 0,5 L/min.
  7. Difficoltà degli arti con pezzi di nastro.
  8. Applicare unguento veterinario su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
  9. Amministrare la buprenorfina 0,05 mg/kg per via sottocutanea, per alleviare il dolore durante il periodo di funzionamento.
  10. Disinfettare il campo chirurgico dell'addome con 3 turni di tintura di iodio, seguita da 2 giri di alcol al 70%.
  11. Posto sterilizzato garza intorno alla zona dove l'incisione sarà fatto per lasciare solo il campo di funzionamento dell'addome esposto.
  12. Procedere per eseguire l'operazione quando il riflesso di punta-pizzico ritiro del ratto è assente.

2. la laparotomia del ratto

  1. Rendere un addominale del muscolo e della pelle incisione trasversale con delle forbici, un Coagulatore elettrico.
  2. Difficoltà e tirare il processo xifoideo verso la testa utilizzando una sutura in polipropilene 4-0.
    Nota: Prestare attenzione a sollevare il processo xifoideo verticalmente per esporre meglio il fegato, ma procedere con cautela per evitare il soffocamento e restrizione respiratoria severa.
  3. Aprire la cavità peritoneale tirando entrambi i lati delle pareti addominali verso la testa con due ganci subcostale per esporre il fegato.
  4. Coprire il duodeno e piccolo intestino nella cavità addominale con una garza inumidita per evitare la disidratazione.
  5. Sollevare i lobi spartitraffico destro e sinistro utilizzando una garza inumidita e li tengono contro il torace per esporre meglio l'ILO del fegato.
  6. Posto il ratto sotto uno stereomicroscopio (ingrandimento 8x).
  7. Cadere qualche soluzione salina calda nell'addome e sulla superficie del fegato e intestino ogni alcuni minuti, per evitare l'essiccazione durante l'intera procedura.

3. creazione di un passaggio di Bypass all'interno del lobo laterale sinistro

  1. Sezionare la sinistra della vena portale e lega i con una sutura in seta 6-0 alla base (Figura 2A).
  2. Bloccare l'arteria epatica sinistra, dotto biliare di sinistro insieme a sinistra vena portale mediana, l'arteria epatica sinistra mediana e dotto biliare mediano sinistro con micro pinze per impedire un flusso del perfusato al lobo mediano sinistro (Figura 2B).
  3. Separare il lobo laterale sinistro, tagliando i legamenti circostanti del lobo con micro-forbici.
  4. Bloccare la vena epatica laterale sinistra di bloccaggio alla base del lobo laterale sinistro con micro morsetti (Figura 2).
    Nota: Assicurarsi di non morsetto sinistro della vena pure per errore.
  5. Utilizzare dispositivi di bloccaggio della zanzara di tenere la legatura della vena portale sinistra e mantenere la vena con la giusta tensione per il successivo inserimento di una canula.
  6. Attentamente, fare un'incisione nella parete anteriore della vena portale sinistra da puntura con un catetere di ago-abitazione-24G ( Figura 3A).
    Nota: Per creare un bypass, sono necessari punti di accesso vascolare su sinistro della vena e la vena epatica di sinistra. Per questo passaggio, è preferibile creare l'accesso vascolare i vasi di puntura con un ago, piuttosto che fare una grande incisione con le forbici. Questo riduce il rischio di sanguinamento e successiva stenosi.
  7. Ritirare il catetere e prendere l'ago fuori il catetere per ottenere un catetere senza ago 24-G.
  8. Collegare il catetere ad un tubo di aspersione, di cui l'altro endpoint si connette a una siringa da 20 mL con 15 mL di 40 U/mL eparinizzata su una pompa di perfusione.
  9. Accendere la pompa per che irrora il tubo per espellere l'aria fuori dal tubo e il catetere senza ago.
  10. Spegnere la pompa di perfusione.
  11. Ancora una volta, inserire il catetere senza ago alla sinistra della vena portale tramite l'incisione forato sulla vena (Figura 3B).
    Nota: A causa del fatto ci è spazio molto limitato per il fissaggio del catetere, non viene risolto a questo punto. Pertanto, il chirurgo deve prestare attenzione per evitare lo spostamento del catetere cannulato.
  12. Raccomandiamo di prestare un'altra incisione al margine della regione esposta della vena epatica sinistra laterale da puntura con un catetere di ago-abitazione di 22 o 24 G (Figura 3).
    Nota: È consigliabile che il catetere sia leggermente più piccolo del vaso.
  13. Ritirare il catetere e prendere l'ago fuori il catetere per ottenere un catetere senza ago 22-G.
  14. Accendere la pompa di perfusione per irrorare eparinizzata in lobo laterale sinistro tramite il 24 G cannulato senza ago catetere della vena portale sinistro ad una portata di 0,5 mL/min.
  15. Usare garza asciutta per assorbire il liquido fuori-fluente dei rifiuti intorno all'area di incisione della vena epatica laterale sinistra.
  16. Incannulare la vena epatica di sinistra laterale tramite l'incisione forato della vena con il catetere senza ago 22-G, per generare un fluido deflusso per minimizzare la contaminazione intra-addominale (Figura 3D).
    Nota: È tecnicamente difficile fissare il catetere cannulato al lobo del fegato. Pertanto, il chirurgo dovrebbe prestare attenzione per evitare lo spostamento del catetere. In alternativa, senza inserimento di una canula della vena epatica laterale sinistra con un catetere, fluido dei rifiuti può anche essere assorbito alla regione di incisione della vena solo con una garza asciutta.
  17. Tenere che irrora il lobo laterale sinistro con soluzione fisiologica eparinizzata per circa 20 min (gruppo 1) e poi solo con soluzione fisiologica per 2 h, 3 h o 4 h (gruppo 2, gruppo 3, gruppo 4, rispettivamente).
  18. Spegnere la pompa per interrompere la perfusione.

4. fisiologico riperfusione del lobo laterale sinistro

  1. Togliere entrambi i cateteri da sinistro della vena e la vena epatica laterale sinistra.
  2. Chiudere l'incisione della vena portale sinistra con una sutura di poliammide 11-0.
  3. Chiudere l'incisione della vena epatica laterale sinistra con una sutura di poliammide 11-0 pure.
  4. Sbloccare la vena epatica laterale sinistra.
  5. Sbloccare la vena portale mediana sinistra, sinistro del dotto biliare e arteria epatica di sinistra.
  6. Tagliare la legatura sul sinistro della vena di riaprire la vena.

5. chiusura della parete addominale

  1. Chiudere lo strato muscolare della parete addominale suturando interrotto con una sutura assorbibile polyglactin 910 4-0.
  2. Chiudere lo strato della pelle della parete addominale suturando interrotto con una sutura assorbibile polidioxanone 4-0.
  3. Dopo la chiusura dell'addome, disinfettare l'incisione cutanea con alcool al 70%.

6. postoperatorio trattamento del ratto

  1. Metti l'animale su un tappetino riscaldante per la rianimazione per circa 10 min e poi metterlo in una nuova gabbia.
  2. Amministrare la buprenorfina 0,05 mg/kg per via sottocutanea 2 volte al giorno per un 3 d consecutivi postoperatorio a sollevare dal dolore.

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Risultati

Maschio di dodici (all'età di 12 - 13 settimane) Lewis ratti sono stati usati per valutare l'effetto della perfusione selettiva lobo del fegato. L'esperimento è stato effettuato in quattro gruppi (n = 3 ratti per gruppo). Utilizzando perfusione diversi periodi di 20 minuti, 2 ore, 3 ore e 4 ore, seguendo la procedura descritta sopra, abbiamo realizzato con successo in vivo di aspersione singolo lobo.

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Discussione

Bloccando e incannulamento sinistro della vena con un catetere come un fluido in entrata e la vena epatica laterale sinistra con un altro catetere come un fluido in uscita, abbiamo generato con successo un bypass in vivo fluido all'interno del lobo laterale sinistro, che indica che anche se la tecnica è altamente impegnativa a causa le piccole dimensioni dei vasi per inserimento di una canula e un elevato rischio di sanguinamento, è fattibile. Perfino i ratti sottoposti a un periodo lungo di aspersione di 4 ore ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrei ringraziare Jens Geiling dall'Istituto di anatomia I, ospedale universitario di Jena, per produrre i disegni schematici di anatomia del fegato del ratto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pompa di
Perfusor VIB. Braun,
CatetereTerumoSR+DU2419PX24G, 0,74&volte; 19mm
Versatus-W  CatetereTerumoSR+DU2225PX22G, 0,9&volte; Micro
strumento
micro forbiciF· S· Ln. 14058-09
micro serrefineF· S· LNo.18055-05
Applicatore di micro morsettiF· S· Ln. 18057-14
Micro pinza dirittaF· S· Ln. 00632-11
Micro pinza curvaF· S· LNo. 00649-11
micro porta aghiF· S· LNo. 12061-01
strumenti
sissors standardF· S·
morsetto per zanzareF· S·
pinza seghettataF· S·
pinza dentataF· S·
porta aghiF· S·
sutura
4-0 proleneethicon
4-0 ETHICON*IIethicon
6-0 silkethicon
11-0 poliammideethicon
perfusione catetere Melsungen Versatus-W chirurgico da 25 mm chirurgici generaliLLLLL

Riferimenti

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