Qui, presentiamo un protocollo per isolare le proteine che legano fucoxantina clorofilla a/c (FCP) da diatomee e incorporarli nei liposomi con composizioni lipidiche naturali per studiare il trasferimento di energia di eccitazione su cambiamenti della composizione dello ione.
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Articolo metodologico
Isolando e incorporando luce-raccolta di antenne da diatomea Cyclotella Meneghiniana in liposomi con i lipidi Thylakoid
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le prestazioni fotosintetiche delle piante, alghe e diatomee dipendono fortemente la regolazione veloce ed efficiente di raccolta luce ed energia dei processi di trasferimento nella membrana tilacoide dei cloroplasti. Trasferimento efficiente alla reazione fotosintetica centri anche per quanto riguarda foto-protezione dalla luce eccessiva e la luce raccolta dell'antenna di diatomee, le cosiddette proteine di legame di fucoxantina clorofilla a/c (FCP), sono necessari per l'assorbimento della luce. Il passaggio tra queste due funzioni è una questione di vecchia data di ricerca. Molti di questi studi sono stati effettuati con FCP in micelle detergente. Per gli studi di interazione, i detergenti sono stati rimossi, che ha condotto ad un'aggregazione aspecifica dei complessi FCP. In questo approccio, è difficile distinguere tra manufatti e fisiologicamente rilevanti dati. Quindi, più preziose informazioni sulla FCP e altra luce di membrana associata complessi di raccolta possono essere ottenuti dallo studio di interazioni proteina-proteina, il trasferimento di energia e altre caratteristiche spettroscopiche se sono incorporati nel loro ambiente nativo del lipido. Il vantaggio principale è che i liposomi hanno una dimensione definita e un rapporto definito dei lipidi/proteine mediante il quale viene controllata nella misura di FCP clustering. Ulteriormente, i cambiamenti della composizione ionica e pH che regolano la luce raccolta in vivo facilmente possono essere simulati. In confronto la membrana tilacoide, i liposomi sono più omogeneo e meno complessa, che lo rende più facile ottenere e comprendere dati spettroscopici. Il protocollo descrive la procedura di FCP isolamento e purificazione, preparazione dei liposomi e incorporazione di FCP in liposomi con composizione lipidica naturale. Risultati da un'applicazione tipica sono data e discusse.
Introduzione
Gli organismi fotosintetici come le diatomee devono affrontare condizioni di luce mutevoli e rispondere con meccanismi sofisticati di acclimatazione che sostengono ad alta efficienza fotosintetica e proteggono da danno foto-ossidativo causato dalla luce eccessiva. Un importante processo di luce-protettivo negli eucarioti fotosintetici è l'alta energia tempra (qE) di luce assorbita che si presenta come il principale contributo per la tempra non fotochimica (NPQ) sotto condizioni di luce lo stress1,2 ,3. Il luce complessi antenna raccolta (LHC) sono coinvolti nella ....
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Protocollo
Nota: Fotosintetici complessi quali FCPs sono altamente vulnerabili alla luce e al calore. Sempre lavorare sul ghiaccio e sotto una luce molto fioca.
1. isolamento di FCP dalle cellule
-
Thylakoid isolamento dalle cellule di c. meneghiniana
- C. meneghiniana in cinque palloni 500 mL che ciascuno riempito con 300 mL di ASP-medio23,25 e 50 milioni di cellule si sviluppano. Collegare le beute con un tappo di cotone e permettono alle cellule di crescere per la fase di crescita esponenziale per circa una settimana su un....
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Risultati
Il protocollo descrive l'isolamento della frazione totale di FCP da Cyclotella meneghiniana e incorporazione in liposomi con composizione lipidica nativa. L'isolamento di thylakoid è altamente riproducibile, ma la resa di thylakoid potrebbe cambiare. Il risultato è accettabile se più del 50% di tutti i pigmenti sono recuperati nel passaggio 1.1.4. Più dell'80% è ottimale.
La solubilizzazione dei tilacoidi è un passo fon.......
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Discussione
Liposomi FCP con composizione lipidica naturale forniscono uno strumento pratico, semplice e riproducibile per indagare le proprietà spettroscopiche in vitro. L'ambiente del lipido in liposomi FCP ricorda la situazione all'interno della membrana tilacoide, dando luogo a risultati sperimentali che sono più vicini alle condizioni naturali.
Ci sono diversi vantaggi di usando c. meneghiniana come sistema modello per antenna FCP. Si sviluppa relativamente veloce ed è più robusto r.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Rana Adeel Ahmad per assistenza nella purificazione di FCP. Prof. ssa Claudia Büchel è riconosciuto per le utili discussioni e leggere il manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da German Research Foundation LD (DI1956-1/1) e la fondazione Humboldt per una borsa di Feodor-Lynen di LD
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| da centrifuga da 500 ml | |||
| centrifuga ad alta velocità | Heraeus | ||
| Bead Mill VI 2 | Edmund-Bü hler (edmund-buehler.de) | versione più recente: Vibrogen-Zellmü hle Vl 6 | |
| Silibeads S 400 µ m | Sigmund-Lindner.com | 5223-7 | |
| Silibeads S 1,-1,3 mm | Sigmund-Lindner.com | 4504 | |
| Imbuto filtrante VitraPOR - por1 | ROBU GmbH | 21121 | |
| fiale di ultracentrifuagtion in policarbonato (30 mL) per T-865 | Beranek Laborgerä te (Laborgeraete-beranek.de) | 314348 | |
| Ultracentrifuga Discovery 90SE | Sorvall | n.a.rotor | |
| T 865 | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 51411 | |
| Neubauer Cell Counter Chamber (migliorata) | Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) | T729.1 | |
| Zeiss Mikroskop Primostar (7) | Optik-Pro (optik-pro.de) | 51428 | |
| cuvette in vetro ottico (6040-OG) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | "6040-10-10" | |
| V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software) | Jasco (jasco.de) | V-630 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | D310LA | |
| Provette ultra-trasparenti 17 ml per AH629 | Beranek Laborgerä te (Laborgeraete-beranek.de) | 344061 | |
| rotore AH629-17-mL | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 54285 | |
| Membrana concentrator_Centriprep taglio 30 kDa | Millipore (merckmillipore.com) | 4307 | |
| Biometra Minigel-Twin | Analytik Jena AG (analytik-jena.de) | 846-010-100 | |
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad (bio-rad.com) | ||
| foglio di calcolo per ufficio libero | La base del documento | https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/ | |
| cuvette di vetro speciali per fluorescenza (101-0S) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | 101-10-20 | |
| Spettrofluorimetro FP-6500 (incl. software) | Jasco (jasco.de) | FP-6500 | |
| Buffer di caricamento SDS Roti-Load | ROTH (carlroth.com) | K929.1 | |
| n-ottil β-D-glucopiranoside | ANATRACE (anatrace.com) | O311 | |
| Monogalattosil diacliglicerolo (MGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1300 | fare soluzione madre in cloroformio |
| Digalattosil diacilglicerolo (DGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1310 | fare soluzione madre in cloroformio |
| Sulphoquinovosil Diacylglycerol (SQDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1230 | make soluzione madre in cloroformio |
| L-alfa-Fosfatidilglicerolo (PG) | Larodan AB (larodan.com) | 37-0150 | make soluzione madre in cloroformio |
| L-&alfa;-Fosfatidilcolina | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | P3782 SIGMA | make soluzione madre nel bagno di sonicatore di cloroformio |
| S-50TH | Sonicor (getmedonline.com | SONICOR-S-50TH | |
| mini-estrusore | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610000 | |
| Membrana in policarbonato Nuleopore | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610005 | |
| membrana per dialisi Visking 14 kDa cutoff | ROTH (carlroth.com) | 0653.1 | bollire in acqua distillata prima dell'uso |
| Biobeads SM2 Adsorbente | Biorad (Bio-rad.com) | 152-3920 | |
| saccarosio epicloridrina copolimero - Ficoll 400 | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | F4375 | |
| Fiale di ultracentrifuazione in policarbonato (2,7 mL) per TFT 80.4 | Beranek Laborgerä te (Laborgeraete-beranek.de) | 252150 | |
| rotore TFT 80.4 | Millipore (merckmillipore.com) | 54356 | |
| materiale elencato in ordine di aspetto | Per istruzioni di sicurezza specifiche, fare riferimento alle schede di sicurezza dei materiali e ai relativi manuali. I materiali e le sostanze standard di laboratorio non sono elencati. |
Riferimenti
- Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
- Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B.
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Ristampe e permessi
