Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura

Sommario

Ribonucleotidi sono tra i più abbondanti nucleotidi non canonico incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA nucleare negli eucarioti. Se non correttamente rimosso, ribonucleotidi possono causare mutagenesi e danno del DNA. Qui, presentiamo due approcci sperimentali che sono utilizzati per valutare l'abbondanza di incorporazione ribonucleotide del DNA e dei suoi effetti mutageni.

Abstract

La presenza di ribonucleotidi in DNA nucleare ha dimostrata di essere una fonte di instabilità genomica. La misura dell'incorporazione del ribonucleotide può essere valutata da idrolisi alcalina ed elettroforesi su gel come RNA è altamente suscettibile di idrolisi in condizioni alcaline. Questo, in combinazione con l'analisi del sud della macchia può essere utilizzato per determinare la posizione e filo in cui sono stati incorporati i ribonucleotidi. Tuttavia, questa procedura è solo semi-quantitativa e potrebbe non essere abbastanza sensibile da rilevare piccole variazioni nel contenuto ribonucleotide, sebbene filo specifico del sud della macchia di sondaggio migliora la sensibilità. Come misura di uno delle conseguenze biologiche più eclatante di ribonucleotidi nel DNA, mutagenesi spontanea possono essere analizzata usando un'analisi di mutazione in avanti. Utilizzando i geni reporter appropriato, mutazioni rare che comporta la perdita della funzione possono essere selezionata e nel complesso e tassi di mutazione specifica possono essere misurati mediante la combinazione di dati provenienti da esperimenti di fluttuazione con sequenziamento del DNA del gene del reporter. Il test di fluttuazione è applicabile per esaminare un'ampia varietà di processi mutageni in background genetico specifico o le condizioni di crescita.

Introduzione

Durante la replicazione nucleare eucariotiche, ribonucleotidi sono incorporati nel genoma di tutti i tre principali replicases di DNA, DNA polimerasi (Pols) α, ε e δ^1,2. Riparazione per escissione RNasi H2-dipendente ribonucleotide (RER³) rimuove la maggior parte di questi ribonucleotidi incorporati.

Un ribonucleotide nel DNA è suscettibile di idrolisi, come il gruppo dell'idrossile 2' della parte dello zucchero in grado di attaccare il legame fosfodiesterico adiacente, rilasciando un'estremità con un 2' - 3' fosfato ciclico e l'altra con un 5'-OH

Protocollo

1. alcalino idrolisi e Strand-specifico del sud della macchia (Figura 1)

1. Crescita delle cellule e isolamento di DNA genomic
   1. Isolare il DNA genomico utilizzando un kit di purificazione di DNA seguendo le istruzioni del produttore del lievito lievito. Utilizzare le culture che sono in fase esponenziale di crescita tra (una densità ottica pari a 0,5) e 1. Risospendere il pellet di DNA finale in 35 mL di 1x buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)).
   2. Aggiungere 1 mL di 5 mg/mL RNasi al DNA ed incubare per 30 min a 37 ° C.
   3. Precipitare il DNA utilizzando....

Risultati

Trattamento del DNA genomico con alcali seguita da elettroforesi alcalina permette di rilevazione semi-quantitativa della frammentazione del DNA a causa dell'abbondanza di ribonucleotidi stabilmente incorporati. La figura 2 Mostra le immagini di gel di lievito DNA genomic trattato con o senza KOH⁵. La variante M644L del Pol2, la subunità catalitica della Polε, ha ridotto la capacità di incorporare ribonucleotidi, mentre il mutante M644.......

Discussione

Qui, descriviamo i protocolli per due serie di esperimenti che vengono spesso utilizzati per analizzare semi-quantitativamente ribonucleotidi incorporati durante la replicazione del DNA e gli effetti mutageni di ribonucleotidi non riparati. Sebbene questi approcci comportano eucariote il modello S. cerevisiae, queste tecniche possono essere facilmente adattate ad altri microbi e persino più alti eucarioti.

Sondaggio per ribonucleotidi non riparati nel DNA usando l'elettroforesi alcali.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
		20	g di destrosio, 20 g di peptone, 10 g di estratto di lievito, in H2O deionizzato fino a 1 L, aggiungere 20 g di Bacto agar per terreni solidi, in autoclave.
Piastre			1,3 g di miscela di dropout SC, 1,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi o (NH4)2SO4, 5 g di (NH4)2SO4, 20 g di destrosio, 20 g di Bacto agar deionizzato H2O fino a 1 L. Regolare il pH a 5,8. Autoclave e 30 – 35 ml per piastra.
Piastre			1,3 g di polvere di dropout SC-Ura, 1,7 g di lievito base azotata senza aminoacidi o (NH4)2SO4, 5 g di (NH4)2SO4, 20 g di destrosio, 20 g di Bacto agar, 25 mg di uracile e H2O fino a 1 L. Autoclave per 15 minuti a 121 ° C e raffreddare a 56 °C. Aggiungere 6 ml di soluzione di solfato di canavanina sterilizzata con filtro.
		5-FOA	1,3 g di polvere di dropout SC-Ura, 1,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi o (NH4)2SO4, 5 g di (NH4)2SO4, 20 g di destrosio, 20 g di Bacto agar, 25 mg di uracile e H2O fino a 800 ml. Autoclave per 15 minuti a 121 gradi C e raffreddare a 60 °C. Aggiungere 200 ml di soluzione sterilizzata con filtro allo 0,5% di 5-FOA.
L-Canavanina solfato	US Biological	C1050
5-FOA	US Biological	F5050
20 mL provetta			Qualsiasi marca
Rotatore di coltura in 30 ° Incubatore			L'incubatore shaker può essere utilizzato al suo posto
		a fondo rotondo a 96 pozzetti	Sterile, di qualsiasi marca
Perle di vetro da 3 mm Fisher	Scientific	11-312A	Autoclave prima dell'uso
Pipette			Qualsiasi marca
Ex Taq DNA Polimerasi	TaKaRa	RR001
Epicentre MasterPure Yeast DNA Kit di purificazione	Epicentro	MPY80200
3 M acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S7899
100% etanolo
Qubit 2.0 Fluorimetro	Invitrogen	Q32866	Modello più recente disponibile
dsDNA BR Kit di analisi	Invitrogen	Q32850
KOH	Sigma-Aldrich	221473
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Ficoll 400	Dot Scientific Inc.
Bromocresolo verde	Eastman	6356
Xilene cianolo FF	International Technologies Inc.	72120
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
1 M Tris-HCl (pH 8.0)	Teknova	T5080
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S11494
Transilluminatore
Amersham Membrana in nylon Hybond-N+	GE Healthcare	RPN303B
3 MM CHR Carta per cromatografia	Whatman	3030-392
NaCl	Caledon	7560-1
Stratalinker 1800	Stratagene
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
G-25 colonna rotante	GE Healthcare	27-5325-01
1 M Tampone fosfato di sodio (pH 7,2)	Sigma-Aldrich	NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)
SDS	Sigma-Aldrich	L4522
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Formamide	Sigma-Aldrich	47671
			Geiger

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