Articolo metodologico

L'uso del Mouse Splenocytes per valutare Pathogen-associated Molecular Pattern influenza sull'espressione del Gene dell'orologio

DOI:

10.3791/58022

⸱

24 luglio 2018

1Department of Biology, University of Hartford

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive una tecnica usando splenocytes del topo per scoprire pattern molecolari associati che alterano l'espressione genica di orologio molecolare.

Abstract

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Dal comportamento di espressione genica, i ritmi circadiani regolano quasi tutti gli aspetti della fisiologia. Qui, presentiamo una metodologia per sfidare splenocytes del topo con il pattern molecolari associati (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), il ODN1826 e il calore-ucciso Listeria monocytogenes ed esaminare il loro effetto su molecolare circadiano orologio. In precedenza, studi si sono concentrati sull'esame l'influenza di LPS sull'orologio molecolare usando una varietà di approcci in vivo ed ex vivo da un assortimento di modelli (ad es., topo, ratto e umani). Questo protocollo descrive l'isolamento e la sfida di splenocytes, nonché la metodologia per valutare la post-sfida espressione di gene di orologio tramite PCR quantitativa. Questo approccio può essere utilizzato per valutare non solo l'influenza di componenti microbiche sull'orologio molecolare ma anche altre molecole che può alterare l'espressione dell'orologio. Questo approccio potrebbe essere utilizzato per prendere in giro a pezzi il meccanismo molecolare di come l'interazione di PAMP-Toll-like receptor influenza espressione dell'orologio.

Introduzione

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Il master clock nei mammiferi, che orchestra oscillazioni 24h per quasi tutti gli aspetti della fisiologia e del comportamento, si trova all'interno del nucleo soprachiasmatico (SCN) dell'ipotalamo1,2. Oltre alla regolazione di processi biologici a livello organico, il master clock sincronizza anche periferici Orologi Cellulari in tutto il corpo3,4,5. Mentre il macchinario di orologio molecolare è costituito da almeno tre cicli di feedback trascrizionale traslazionale ad incastro, il nucleo è composto il periodo (Per1-3), crittocromo (Cry1-2), Bmal1, e orologio geni6,7. Oltre a mantenere la tempistica accurata dell'orologio molecolare core, anche alcuni prodotti del gene orologio accessorie (ad es., Rev-erbα e Dbp) regolano l'espressione dei geni dell'orologio non, cioè, orologio geni controllati (GCC)6 , 7.

Orologi molecolari funzionali sono state descritte in vari tessuti immuni (ad es., milza e linfonodi)8 e cellule (ad es., B cellule, cellule dendritiche, macrofagi)8,9. Queste cellule rilevare e rispondere ai pattern molecolari associati (PAMPs), conservati componenti microbici, attraverso recettori di riconoscimento immune innata come recettori Toll-like (TLR)10. Ad oggi, sono stati descritti 13 funzionale TLR, che riconoscono costituenti microbici quali componenti della parete cellulare batterica, proteina fustigatrice e acidi nucleici microbici10. La PAMP, lipopolisaccaride (LPS), un componente della parete cellulare dei batteri gram-negativi, riconosciuto da TLR4, è stato indicato per alterare i ritmi circadiani a livello sia organismica e molecolare. Ad esempio, in vivo sfida di LPS indotto da ritardi di fase fotica-come misurata dall'attività in topi11 e portato a orologio ridotta espressione genica nel SCN e nel fegato come determinato mediante ibridazione in situ e PCR quantitativa, rispettivamente, in ratti12. Dopo una sfida in vivo con LPS, analisi del sangue periferico umano leucociti13 e tessuto adiposo sottocutaneo14 ha rivelato alterata espressione di diversi geni dell'orologio come misurato tramite qPCR. Infine, ex vivo sfide LPS di macrofagi umani e macrofagi peritoneali del topo, inoltre ha condotto ad alterata espressione dell'orologio come misurato da qPCR14.

Qui, descriviamo un protocollo per valutare l'influenza dei LPS PAMPs, ODN1826 (oligonucleotidi sintetici contenenti unmethylated CpG motivi) e calore-ucciso Listeria monocytogenes (HKLM), riconosciuto da TLR4, TLR9 e TLR2, rispettivamente, il espressione genica di orologio molecolare negli splenocytes del topo. Il protocollo comprende lo splenectomy mouse, isolamento splenocyte e sfida, RNA estrazione, sintesi del cDNA e qPCR per valutare l'espressione di diversi geni dell'orologio. Questo protocollo permette l'acquisizione tempestiva di un gran numero di cellule del sistema immunitario con molto piccolo animale o manipolazione cellulare, che può quindi essere contestato ex vivo con vari PAMPs. L'orologio molecolare è stato indicato per modulare i vari aspetti della risposta immunitaria8,15,16, pertanto, rottura dell'orologio molecolare molto probabilmente potrebbe compromettere la corretta variazione dipendente dal tempo della risposta immunitaria. Inoltre, poiché le interruzioni dei ritmi circadiani possono portare a gravi patologie17,18,19,20, può essere di interesse per i ricercatori di sfidare gli splenocytes con una vasta gamma di molecole e valutare la loro influenza sull'orologio.

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Protocollo

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Durante lo studio, trattamento e cura degli animali in osservanza politica National Institutes of Health, erano in conformità con le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal comitato di uso e cura animali istituzionale degli animali Università di Hartford.

1. trascinamento degli animali

Nota: Venti settimana-vecchio maschio B6129SF2/J topi sono usati nello studio.

  1. Salire sul treno topi per una 12 ore di luce (luce standard testa bianca) / 12h scuro ciclo per 2 settimane prima dell'esperimento.
    Nota: Qui tempo zeitgeber (ZT) 0 corrisponde a luci su e ZT12 a luci spente, mantenendo tutti gli altri fattori ambientali (cioè, alimento, acqua e temperatura ambiente) costante 21.

2. preparazione di strumenti, terreno di coltura e sfida Medium

  1. Autoclave pinze e le forbici per dissezione. Avvolgere le coppie di vetrini da microscopio smerigliato in foglio di alluminio e autoclave.
  2. Preparare mezzo di coltura con l'aggiunta di siero bovino fetale (FBS) di RPMI 1640 a una concentrazione finale di 10%. Preparare 10 mL di terreno di sfida in provette da 50 mL aggiungendo il seguente PAMPs al terreno di coltura (RPMI con 10% FBS); LPS (5 µ g/mL), ODN1826 (5 µ g/mL), calore-ucciso Listeria monocytogenes (108 HKLM/mL), o un altro PAMP nella sua concentrazione suggeriti.
  3. Caldo terreno di coltura e sfida medio a 37 ° C in un bagno d'acqua e tenere circa 70 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS, pH 7,2) a temperatura ambiente.
  4. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura utilizzando una pipetta da 10 mL e pipetta aiuti per un tubo da 50 mL e posto sul ghiaccio.
  5. Aggiungere circa 30 mL di etanolo al 70% a un'estremità di Becher e posto di 100ml di forbici e forcipe di dissezione nel bicchiere graduato per evitare la contaminazione microbica.
  6. Preparare il tampone di lisi per isolamento del RNA aggiungendo 10 µ l di β-mercaptoetanolo (sotto cappa aspirante) per ogni 1 mL di Buffer RLT in una provetta da 50 mL. Fare solo l'importo che sarà necessario (600 µ l per campione, che consiste di circa 1 x 106 cellule).
    Nota: Il Buffer RLT è un componente del kit di estrazione di RNA che supporta l'associazione di RNA per la membrana di silice.

3. Splenocyte isolamento e sfida

  1. Eutanasia topi in un momento di particolare zeitgeber tramite narcosi mantenendoli nella loro gabbia originale e aggiungendo CO2 alla gabbia ad una portata di 3 L/min continua fornitura di CO2 per 1 min dopo l'arresto della respirazione.
  2. Confermare la morte tramite dislocazione cervicale posizionando il pollice e il dito indice su entrambi i lati del collo alla base del cranio. In alternativa, premere una canna alla base del cranio mentre si tira rapidamente (con l'altra mano) la base della coda o le zampe per causare la separazione delle vertebre cervicali dal cranio22.
  3. Spruzzare il tronco del mouse con etanolo al 70% e asciugare con un tovagliolo di carta. Posizionare il mouse sulla sua schiena e leggermente inclinata sul fianco destro. Tagliare via la pelliccia, mediante dissezione Forbici, lato sinistro del mouse, circa a metà strada tra la parte anteriore e le zampe posteriori.
  4. Usando il forcipe, afferrare il peritoneo e incidete con attenzione per non danneggiare la milza. Rimuovere la milza con le pinzette e posto in una provetta sterile da 50 mL contenente circa 10 mL di terreno di coltura su ghiaccio. Ripetere per gli altri animali.
    Nota: La milza è il colore di un fagiolo, ed è più lungo e più piatta rispetto il rene.
  5. Trasferire una milza con 2 mL di terreno di coltura per un piccolo piatto di Petri sterile.
    1. Omogeneizzare la milza di macinandolo fra la parte glassata di due diapositive smerigliati sterile. Se possibile, mantenere il problema e le cellule nel medium durante il processo di omogeneizzazione.
    2. Una volta accuratamente omogeneizzato, pipettare 2 mL di terreno di coltura contenente gli splenocytes attraverso un colino di cella di 40 µm in nylon in una provetta da 50 mL.
    3. Ripetere i passaggi sopra riportati per le milze rimanenti utilizzando nuove coppie di diapositive smerigliati, provette da 50 mL con terreno di coltura e filtri di cella.
  6. Aggiungere 8 mL di terreno di coltura fredda a ciascuna delle provette 50ml contenente gli splenocytes per un volume totale di 10 mL/tubo. Determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro.
  7. Aggiungere circa 1 x 106 cellule/pozzetto in piastre di coltura 6 pozzetti. Aggiungere celle per il numero di pozzetti che corrispondono al numero di diversi PAMPs viene utilizzato per l'esperimento e includere un controllo bene. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura o 3 mL di terreno di sfida a tutti i pozzetti.
  8. Incubare le piastre a 37 ° C in 5% CO2 per 3 h.
  9. Raschiare le cellule dal fondo del bene usando un puntale da 1.000 µ l collegato a una micropipetta P1000. Trasferire il supporto che contiene le celle utilizzando la stessa punta di dispensare 1.000 µ l in una provetta da 15 mL.
  10. Agglomerare le cellule tramite centrifugazione a 167 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 5 mL di PBS.
  11. Agglomerare le cellule una seconda volta a 167 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e aggiungere 600 µ l di tampone di lisi per il pellet cellulare per lisare le cellule. Procedere all'isolamento del RNA.

4. isolamento RNA e la sintesi del cDNA

  1. Isolare il RNA da splenocytes utilizzando il kit di estrazione di RNA secondo le istruzioni del produttore ed eseguire la digestione di DNA in colonna 'optional'.
  2. Prima sintesi del cDNA, calcolare la concentrazione di RNA mediante uno spettrofotometro di microvolume per verificare che la concentrazione sia all'interno della gamma ottima di RNA (fino a 2 µ g) di kit di sintesi di cDNA.
  3. Synthesize cDNA per ciascuno dei campioni utilizzando il kit di trascrizione inversa secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 10 µ l di RNA per ognuno dei campioni in un volume di reazione totale di 20 µ l. Al completamento della trascrizione inversa (thermocycler esegue) aggiungere 20 μL H2O ad ogni reazione.
  4. Costruire la curva standard utilizzando una micropipetta P10 o P20 per piscina mRNA da alcuni campioni di controllo (ad esempio, 5 µ l da 2 campioni per un totale di 10 µ l) in una provetta 0,5 mL per preparare il cDNA.
    1. Aggiungere 10 µ l 2 x mix master della trascrittasi inversa.
    2. Al completamento della trascrizione inversa, aggiungere 10 µ l di H2O al tubo di reazione, che servirà come la concentrazione iniziale ("1") della serie di diluizione per la curva standard.
    3. Eseguire una serie di diluizioni 10 volte (da 1 a 10-4) con l'aggiunta di 45 µ l di acqua utilizzando una micropipetta P100 o P200 nelle quattro provette 0,5 mL indicate 10-1, 10-2, 10-3e 10-4.
      1. Aggiungere 5 µ l di concentrazione iniziale "1" nel primo tubo (10-1) usando una micropipetta P20, mix pipettando su e giù parecchie volte, quindi trasferire 5 µ l dalla provetta 10-1 nel tubo indicato 10-2 e mix.
      2. Trasferire 5 µ l utilizzando una micropipetta P20 dal 10-2 tubo nel tubo indicato 10-3 e mescolare. Trasferire 5 µ l usando una micropipetta P20 dal 10-3 tubo nel tubo indicato 10-4 e mescolare.

5. quantitativo reazione a catena della polimerasi (qPCR)

  1. Determinare la quantificazione relativa dei livelli di mRNA di qPCR. All'interno l'allestimento sperimentale, selezionare "Quantificazione – relativa curva Standard" e "TaqMan" chimica. Cambiare il volume di reazione a 10 µ l. Immettere le informazioni rilevanti nel layout del piatto (ad es., gene bersaglio, curva standard, giornalista, ecc.).
  2. Preparare la reazione, in modo che esso contiene 0,5 µ l del dosaggio primer/sonda, 5 µ l di mix master di espressione genica, 2 µ l di H2O e 2,5 µ l di cDNA (10 – 100 ng).
    1. Preparare un mix master moltiplicando ciascuno dei reagenti precedenti (tranne il cDNA) per il numero di reazioni, assicurandosi di includere quelli dalla curva standard, controlli negativi, esibendosi ogni reazione in duplicato e 2 reazioni supplementare che rappresenteranno per variazione di pipettaggio.
    2. Dispensare 7,5 µ l del mix master preparati in pre-determinati pozzetti in una piastra di reazione a 96 pozzetti con una micropipetta o una pipetta multicanale. Dispensare 2,5 µ l di cDNA nel pozzo appropriato per le incognite e gli standard e 2,5 µ l di H2O nei pozzetti di controllo negativo.
    3. Sono saggi di primer/sonda per vari geni orologio molecolare e includono un'analisi per un controllo endogeno (ad es., β-actina).
  3. Al fine di determinare i valori relativi di espressione, calcolare la quantità relativa media per ogni replica, quindi, per ogni campione, dividere la quantità relativa media per il gene dell'obiettivo di quantità relativa media per β-actina.

6. elaborazione statistica

  1. Utilizzando software di analisi statistica, inserire i dati nel programma sotto l'opzione di statistiche di colonna. Selezionare un one-way ANOVA con il test post-hoc di Dunnett per valutare le differenze tra i valori medi di espressione del gene dell'orologio dopo la sfida PAMP contro il controllo.

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Risultati

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Topi sono stati sacrificati a ZT13, splenocytes sono stati isolati e contestato ex vivo con il LPS PAMPs, ODN1826 o HKLM. Dopo 3 h, RNA è stato isolato e qPCR è stato utilizzato per valutare i livelli di espressione relativa dei geni orologio molecolare orologio, Per2, Dbp e Rev-erbα rispetto alle cellule di controllo incontrastato. Dopo la sfida PAMP, i livelli di espressione di Clock non erano significativamente differenti che l'espr...

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Discussione

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All'interno di questo protocollo, uno spettrofotometro di microvolume può essere utilizzato per quantificare e valutare la purezza del RNA utilizzato nel determinare l'espressione genica. Acidi nucleici assorbono UV luce a 260 nm, proteine in genere assorbono la luce a 280 nm, mentre altri potenziali contaminanti utilizzati durante una procedura di estrazione di RNA (ad es., fenolo) sono rilevabili a 230 nm. Pertanto, valutando l'assorbanza (A) rapporto a 260/280 nm (RNA alla proteina) e 260/230 nm (RNA a protei...

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Dichiarazioni

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L'autore non ha nulla di divulgare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da assegni di ricerca di facoltà dall'ufficio il College delle arti e del preside di Scienze presso l'Università di Hartford.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vetrini smerigliatiFisher12-550-343
Filtri cellulariFisher22363547
Lipopolisaccaride InvivoGenltrl-eklps
ODN1826InvivoGenTlrl-1826-1
HKLMInvivoGenTlrl-hklm
RPMI 1640Gibco11875-093
PBSGibco20012-043
RNeasy Mini KitQiagen74104 o 74106
Set DNasi senza RNasiQiagen79254
piastra per coltura cellulare a 6 pozzettiDenvilleT1006
Provette da 50 mLCorning352070
Provette da 15 mLCorning352097
Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacitàThermoFisher4368814
TaqMan Saggi di espressione genica b-actinThermoFisherMm00607939_s1
Saggi di espressione genica TaqMan Per2ThermoFisherMm00478113_m1
Saggi di espressione genica TaqMan Rev-erbaThermoFisherMm00520708_m1
Saggi di espressione genica TaqMan Bmal1ThermoFisherMm00500226_m1
Saggi di espressione genica TaqMan DbpThermoFisherMm00497539_m1
macchina qPCR StepOnePlusThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher4369016
MicroAmp Piastra di reazione rapida a 96 pozzetti (0,1 mL)ThermoFisher4346907
Prism 7.0a
Software di analisi statistica

Riferimenti

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