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Articolo metodologico

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

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DOI:

10.3791/58028

⸱

11 dicembre 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Neurobiology, Neuroscience Program, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), L'Hospitalet de Llobregat, 2Department of Pathology and Experimental Therapy, School of Medicine, University of Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat, 3Institute of Neurosciences, University of Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Girini di Xenopus offrono una piattaforma unica per studiare la funzione del sistema nervoso in vivo. Descriviamo le metodologie per valutare l'elaborazione di informazioni olfattive in vita Xenopus larve in normali condizioni di allevamento o dopo la ferita.

Abstract

Girini di Xenopus offrono una piattaforma unica per studiare la funzione del sistema nervoso. Essi forniscono molteplici vantaggi sperimentali, quali l'accessibilità a numerosi approcci di imaging, tecniche elettrofisiologiche e comportamentali saggi. Il sistema olfattivo di Xenopus girino è particolarmente adatto per studiare la funzione delle sinapsi stabilito durante lo sviluppo normale o riformato dopo la ferita. Qui, descriviamo le metodologie per valutare l'elaborazione delle informazioni olfattive nella vita di larve di Xenopus . Descriviamo una combinazione di misurazioni in vivo delle risposte del calcio presinaptico in glomeruli del bulbo olfattivo con dosaggi comportamento olfattivo-guida. Metodi possono essere combinati con il transection dei nervi olfattivi per studiare il riavvolgimento delle connessioni sinaptiche. Gli esperimenti sono presentati utilizzando animali wild-type e geneticamente modificati che esprimono i reporter GFP in cellule del sistema nervoso centrale. Applicazione degli approcci descritti a girini geneticamente modificati può essere utile per svelare le basi molecolari che definiscono il comportamento dei vertebrati.

Introduzione

Girini di Xenopus costituiscono un eccellente modello animale per studiare la funzione normale del sistema nervoso. Trasparenza, un genoma sequenziato completamente1,2e accessibilità alle tecniche chirurgiche, elettrofisiologiche e imaging sono proprietà uniche delle larve di Xenopus che consentono di indagare funzioni neuronali in vivo3 . Alcune delle possibilità più sperimentale di questo modello animale sono illustrate da studi approfonditi su girino sistemi sensoriali e motori4,5,6. Un circuito neuronale particolarmente adatto per studiare molti aspetti di elaborazione a livello delle sinapsi delle informazioni è il sistema olfattivo girino di Xenopus 7. In primo luogo, la sua connettività sinaptica è ben definita: neuroni olfattivi (ORNs) del progetto al bulbo olfattivo e stabilire contatti sinaptici con dendriti delle cellule mitrali/trapuntato all'interno dei glomeruli per generare mappe di odore. In secondo luogo, sua ORNs vengono continuamente generati da neurogenesi per tutta la vita per mantenere la funzionalità delle vie olfattive8. E in terzo luogo, perché il sistema olfattivo Mostra una grande capacità rigenerativa, girini di Xenopus sono in grado di riformare completamente il loro bulbo olfattivo dopo ablazione9.

In questo articolo, descriviamo gli approcci che combinano formazione immagine dei glomeruli olfattivi in girini vivente con esperimenti comportamentali per studiare la funzionalità delle vie olfattive. I metodi descritti qui sono stati utilizzati per studiare il recupero funzionale di connettività glomerulare nel bulbo olfattivo dopo nervo olfattivo transection10. I dati ottenuti in girini di Xenopus sono rappresentativi dei vertebrati poiché l'elaborazione olfattiva evolutivo conservato.

I metodi descritti sono esemplificati utilizzando X. tropicalis ma può essere facilmente implementati in X. laevis. Nonostante le dimensioni dell'adulto X. laevis, entrambe le specie sono notevolmente simili durante le fasi di girino. Le principali differenze risiedono a livello genomico. X. laevis Visualizza scarsa trattabilità genetico, determinato prevalentemente dalla sua allotetraploide genoma e tempo di lunga generazione (circa 1 anno). Al contrario, x. tropicalis è più suscettibili di modificazioni genetiche, grazie alla sua più breve tempo di generazione (5 – 8 mesi) e il genoma diploide. Gli esperimenti rappresentativi sono illustrati per animali di selvaggio-tipo e tre diverse linee transgeniche: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) e tubb2:GFP (X. laevis).

Le metodologie descritte nel lavoro attuale dovrebbero essere considerate a fianco la genetica progredisce nel campo di Xenopus . La semplicità e la facile implementazione di tecniche presentate li rende particolarmente utili per la valutazione già descritto mutanti11, nonché linee di Xenopus generati da CRISPR-Cas9 tecnologia12. Inoltre descriviamo una procedura chirurgica utilizzata per transetto nervi olfattivi che può essere implementati in qualsiasi laboratorio avendo accesso a girini di Xenopus . Gli approcci utilizzati per la valutazione delle risposte del calcio presinaptico e olfattivo-Guida di comportamento richiedono attrezzature specifiche, seppur disponibile ad un costo moderato. Metodologie sono presentati in una forma semplice per promuovere il loro uso in gruppi di ricerca e potrebbero porre le basi di analisi più complesse sia implementando miglioramenti o l'associazione ad altre tecniche, ossia approcci di genetica o istologici, .

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Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico di ricerca animale all'Università di Barcellona.

Nota: X. tropicalis e X. laevis girini sono allevati secondo metodi standard13,14. Acqua di girino è preparato aggiungendo sali commerciali (Vedi Tabella materiali) all'acqua da osmosi inversa. Conducibilità è regolato in µS ∼700 e ∼1, 400 µS per girini X. tropicalis e X. laevis , rispettivamente. Le larve possono essere ottenute mediante accoppiamento naturale o fecondazione in vitro14. Gli embrioni sono dejellied con 2% di che l-cisteina preparata in di 0,1 x Marc Modified Ringers (MMR). 1 x MMR contiene (in mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0,1 EDTA, pH 7,8. Le larve sono trasferite dopo 2 – 3 giorni (fase 25) L 2 serbatoi con acqua girino. Quando girini raggiungono fase 40 del Nieuwkoop-Faber (NF) criteri15, sono posizionati in serbatoi di 5L e mantenuti ad una densità di 10 animali/L. temperatura viene mantenuta costante a 23 – 25 ° C e 18 – 20 ° C per X. tropicalis e X. laevis girini, rispettivamente. Animali che si trovano in fasi 48 – 52 dei criteri NF sono utilizzati per esperimenti.

1. transection dei nervi olfattivi

  1. Preparare una soluzione anestetizzante dello 0,02% MS-222 in 50 mL di acqua di girino a temperatura ambiente.
  2. Preparare un piccolo serbatoio (1 – 2 L) con girino acqua per permettere il recupero di animali dopo l'intervento chirurgico.
  3. Tagliare le parti rettangolari di carta da filtro qualitativa cellulosa (4 cm x 3 cm, Vedi Tabella materiali).
  4. Bagnato 2 pezzi di carta da filtro qualitativa cellulosa in una soluzione 0,02% MS-222 e metterli nell'ambito di dissezione.
  5. Scegli un girino dal serbatoio e immergerlo nella soluzione anestetizzante. L'animale smette di nuotare all'interno di 2 – 4 min e non reagisce agli stimoli meccanici applicati a livello di coda con una pinzetta.
  6. Posto il girino anestetizzato sui pezzi rettangolari di carta da filtro. Posizionare l'animale con la parte dorsale è rivolta verso l'alto, in modo che strutture cerebrali possono essere visualizzati.
    1. Utilizzando le forbici di Allerød (Vedi Tabella materiali) tagliare uno o entrambi i nervi olfattivi (a seconda del tipo di test da effettuare). Transetto un singolo nervo per esperimenti che richiedono un controllo interno della ferita del nervo.
    2. Per gli esperimenti comportamentali, transetto entrambi i nervi al fine di sopprimere tutte le informazioni di odorizzante che arrivano al bulbo olfattivo. L'efficienza di sezionamento dei nervi olfattivi possa essere facilmente osservata nell'ambito di dissezione; Tuttavia, posizione di pigmentazione o animale possa essere fattori limitanti.
      Nota: (Opzionale) Il modo migliore per certificare la validità della procedura utilizza girini transgenici che esprimono reporter fluorescenti sul loro sistema nervoso (Vedi risultati rappresentativi). A questo scopo, è necessario utilizzare un ambito di dissezione dotato di fluorescenza (Figura 1). Se solo animali di selvaggio-tipo sono disponibili, può essere impiegato l'analisi con CM-diI. Seguire il protocollo 2 (Vedi sotto) per iniettare una soluzione di 0,5 mg/mL di CM-diI preparato in 0,3 M saccarosio nella capsula nasale. Vedi 16 per informazioni dettagliate sulla preparazione e deposito di CM-diI. Perdita della tintura fuori della cavità principale deve essere minimizzare. A questo scopo, è necessario modificare la pressione di iniezione e l'apertura di micropipette. Fluorescenza a livello dello strato glomerulare del bulbo olfattivo diventa ovvio 24 h dopo l'applicazione di CM-diI. Il presente lavoro utilizza un'etichettatura con CM-diI solo per certificare la procedura transection; Tuttavia, questo metodo può essere utilizzato anche per ottenere informazioni morfologiche dei glomeruli olfattivi utilizzando procedure istologiche convenzionali.
  7. Trasferire gli animali per il serbatoio di recupero. Girini dovrebbero recuperare normale di nuoto all'interno ~ 10 min. eseguire un controllo attento per la presenza di emorragie, che sono attesi in ~ 1% di animali sottoposti ad intervento chirurgico.
  8. Eutanasia animali feriti in una soluzione di 0,2% MS-222.

2. etichettatura dei neuroni olfattivi con indicatori fluorescenti calcio

  1. Preparare una soluzione contenente 12% calcio verde-1-destrano (Vedi Tabella materiali), 0,1% Triton X-100 e 1 mM NaCl17. Conservare la soluzione a-20 ° C o a-80 ° C se non deve essere utilizzato entro un mese.
  2. Pipette di vetro con punta aperture ~ 1-2 µm (diametro simile a microelettrodi utilizzato per esperimenti di patch-clamp) prepararsi microinjection usando un estrattore micropipetta (Vedi Tabella materiali).
  3. Calibrare il volume di microiniezioni. Usando acqua distillata, regolare il tempo di pressione e l'iniezione al fine di ottenere volumi di iniezione di 0,15-0,3 µ l.
    Nota: Una procedura semplice consiste nel contare il numero di impulsi per svuotare una pipetta riempita con 1 µ l di acqua necessaria. Parametri tipici sono una pressione di 30 psi e 50 ms tempo di iniezione.
  4. Posizionare una pipetta nella microinjector e caricarlo con ~ 2 µ l di soluzione di calcio verde-1 destrano.
  5. Preparare un girino come segue 1.1 a 1.6.
  6. Spostare la punta della pipetta nella cavità principale della capsula nasale.
    Nota: Vedere la Figura 2A che descrive la posizione di vie olfattive in un girino di Xenopus.
  7. Utilizzando impostazioni ottenute al punto 2.3, consegnare un paio di soffi. Limitare la presenza di colorante alla capsula nasale.
  8. Lasciate che il girino riposare per 2 – 3 minuti utilizzando una pipetta Pasteur, versare gocce di soluzione di MS-222 0,02% sulle parti più caudale dell'animale per evitare l'essiccazione.
  9. Trasferire l'animale per il serbatoio di recupero.
    Nota: Si dovrebbe recuperare il normale di nuoto all'interno ~ 10 min manipolazione degli animali potrebbe causare lesioni.
  10. Eutanasia girini che non recuperano comportamento normale di nuoto 15 min dopo l'iniezione usando una soluzione di 0,2% MS-222.
  11. Osservare la fluorescenza a livello dello strato glomerulare del bulbo olfattivo il giorno dopo l'iniezione.

3. preparazione dei girini per Live Imaging delle risposte presinaptiche

  1. 24 – 48 h prima di condurre l'esperimento, cappotto 4 – 6 capsule di Petri di 35 mm di diametro con elastomero di silicone (ad es., Sylgard). Una volta che l'elastomero ha polimerizzato, fabbricare un pozzo rettangolare per adattare il girino.
    Nota: Dimensioni tipiche per girini X. tropicalis trovati in fasi NF 48 – 52 sono 10 x 4 mm.
  2. Preparare 100 mL di un 160 µM a soluzione di 1 mM dell'aminoacido che agisce come uno stimolo di odorizzante per girini. La soluzione può contenere una miscela di parecchi aminoacidi: leucina, istidina, arginina, metionina e lisina. Diluire gli amminoacidi in soluzione di Ringer lattato Xenopus , composta da (in mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, glucosio 10, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Assicurarsi che il pH è mantenuto a 7,8.
  3. Riempire un serbatoio elevato con 20 mL della soluzione dell'aminoacido. Collegare il serbatoio con polietilene tubi ad un tubo capillare di 28 G (Vedi Tabella materiali) posto sopra la capsula nasale.
    Nota: Il tubo capillare è montato su un micromanipolatore (Vedi Tabella materiali). Bolle d'aria devono essere assenti dal sistema di perfusione.
  4. Ottenere la precisione temporale nell'applicare la soluzione di aminoacidi utilizzando il transistor-transistor logic (TTL) controllo delle elettrovalvole a solenoide pizzico (Vedi Tabella materiali). Uno stimolatore viene utilizzato per generare impulsi TTL (Vedi Tabella materiali). Verifica la precisione temporale per fornire la soluzione odorant modificando la durata degli impulsi TTL, cioè., 0,1-1 s.
  5. Riempire un altro serbatoio elevato con 100 mL di soluzione di Ringer lattato Xenopus .
  6. Anestetizzare un girino e posizionarlo sotto l'ambito per dissezione (punti 1.1-1.6).
  7. Preparare un girino per l'imaging. Se girini albino sono disponibili, procedere al passaggio 3.9, altrimenti togliere la pelle sopra il bulbo olfattivo, perché contiene i melanociti che compromettere imaging (punto 3.8).
    Nota: Ci sono due modi per eseguire l'esperimento a seconda la pigmentazione dell'animale. È preferibile utilizzare animali albini. Albino ceppi sono disponibili per X. laevis e linee di albino X. tropicalis recentemente sono stati generati da CRISPR-Cas9 12 o TALENs18.
  8. Utilizzando le forbici Allerød, fare un'incisione laterale sulla pelle girino sul bordo del sistema nervoso centrale. Fare il taglio dovrebbe essere fatto a livello del bulbo olfattivo e mai raggiungere la posizione di tectum, che può essere facilmente identificato dalla posizione del nervo ottico.
  9. Pizzicare la pelle tagliata con una pinzetta e tirare sul sistema nervoso. Verificare la riuscita rimozione dall'assenza di melanociti sopra il bulbo olfattivo. Mantenere umido l'animale da versare gocce di soluzione di MS-222 0,02% utilizzando una pipetta Pasteur.
  10. Posizionare il girino nel pozzetto del piatto rivestito (Vedi Tabella materiali). Mettere un coprioggetto in vetro rivestito con grasso per vuoto alta sopra l'animale. Posizionare il vetrino coprioggetto per coprire la parte superiore di tectum fino alla fine della coda.
  11. Verificare che il bulbo olfattivo e placodi rimangano esposti al medium extracellulare. Mantenere immobile il girino durante la formazione immagine. Riempire la capsula di Petri con tubocurarina di Xenopus Ringer solutioncontaining 100 µM (Vedi Tabella materiali) per prevenire le contrazioni muscolari.
    Nota: Tubocurarina è memorizzato in aliquote a-80 ° C non più di 6 mesi.
  12. Mettere il piatto che tiene il girino sotto un microscopio in posizione verticale. Collegare il serbatoio contenente la soluzione di Ringer lattato Xenopus con il piatto utilizzando tubi di polietilene (Vedi Tabella materiali) per aspersione continua di lattato Xenopus Ringer per mantenere l'animale vivo per > 1 h.
    Nota: Mini pinze magnetiche (Vedi Tabella materiali) sono molto utili per collegare stabilmente tubi al piatto. Tubi di aspirazione e di perfusione devono trovarsi in angolo ~ 180°.
  13. Avviare che irrora lattato Xenopus Ringer. Mantenere il livello della soluzione nella costante piatto in tutto l'esperimento. Valutazione continua vitalità girino osservando la circolazione del sangue attraverso i vasi.

4. live Imaging presinaptici Ca2 + modifiche in Glomeruli olfattivi

Nota: La procedura di imaging è descritto per microscopia grandangolari, ma potrebbe essere facilmente adattata ad un microscopio confocale regolando le impostazioni di acquisizione. La formazione immagine dovrebbe essere effettuata in un microscopio verticale montato su un tavolo antivibrazione.

  1. Visualizzare il girino con un obiettivo di ingrandimento basso, ad esempio 5x.
  2. Spostare gli assi del micromanipolatore per posizionare il capillare offrendo la soluzione odorant sulla cima di una capsula nasale formando un angolo di 90 ° con il nervo olfattivo. Il flusso della soluzione odorant sopra il bulbo olfattivo dovrebbe essere evitato perché potrebbe causare turbolenze che distorcono la formazione immagine.
  3. Trovare il bulbo olfattivo situato ipsilaterally alla capsula nasale (soggette a stimolazione) utilizzando un alto ingrandimento, distanza di funzionamento lunga, acqua obiettivo a immersione: 60Xx, 0,9 N.A.
  4. Controllare l'emissione di fluorescenza ad occhio. Strutture glomerulari dovrebbero essere ovvio (Figura 2B).
  5. Effettuare l'acquisizione dal vivo con una fotocamera adatta per l'imaging del calcio. Definire una scatola contenente l'intero bulbo olfattivo, in genere di 256 x 256 o 512 x 512 pixel. Insieme all'acquisizione di tasso cornice di acquisizione a 20 – 40 Hz. regolare il guadagno, in modo che i valori di fluorescenza basale sono ~ 20% di saturazione. Acquisire un video s 5.
  6. Visualizzare il filmato. Verifica immagine messa a fuoco, l'assenza di artefatti di movimento e regioni che contengono pixel saturi. I valori di fluorescenza tipico delle regioni glomerulare dovrebbero essere di 5.000 – 20.000 a.u. se utilizza una fotocamera di 16 bit. Procedere al passaggio successivo se imaging le condizioni sono ottimali. Ripetere il passaggio 4.6 se necessario per migliorare la qualità dell'immagine o regolare le impostazioni di guadagno.
  7. Avviare un'acquisizione di time-lapse per registrare risposte evocate da stimoli olfattivi.
    Nota: Applicazione precisa della soluzione odorant è controllata da stimoli TTL. Un tipico esperimento contiene un periodo basale di 4 s, seguita da stimolazione tempi che vanno da 0,1 a 0,5 s e un periodo di recupero di 6 – 10 s.
  8. Eseguire stimolazioni ripetitive di odorizzazione per intervalli di tempo > 2 minuti impostare la portata di 1 – 1,5 ml · min-1. Poiché l'aspersione globale è il durante tutti gli esperimenti, applicati localmente gli aminoacidi sono sbiaditi.
    Nota: Il volume di soluzione nel piatto è ~ 3 mL.
  9. Analisi dell'immagine
    1. Rilevazione delle risposte
      1. Esportazione di filmati ImageJ.
        Nota: L'obiettivo è individuare la presenza delle regioni glomerulare risponde agli stimoli.
      2. Trasformare la prime sequenze di immagini di fluorescenza da un film di0 ΔF/F. Misurare le variazioni relative a fluorescenza basale secondo la seguente relazione: (F-F0) / f0, dove F0 indica livelli basali di fluorescenza.
      3. Disegnare le regioni di interesse (ROI) nei dintorni di zone che mostrano fluorescenza presunti aumenti durante la stimolazione e registrare la loro posizione in gestione ROI (Figura 2E). Disegnare un ROI per rilevare livelli di fluorescenza di fondo in un'area priva di strutture glomerulari.
    2. Quantificazione delle risposte.
      1. Posto il ROIs definiti nella sequenza raw delle immagini di fluorescenza. Ottenere il valore di grigio medio di ROIs selezionato per ogni fotogramma. Trasferire la sequenza di valori ottenuti ad un programma di analisi (ad es.., Igor Pro).
      2. Sottrarre la fluorescenza di fondo e quindi calcolare le modifiche ΔF/F0 per ogni ROI (Figura 2F). Tracciare gli aumenti in ΔF/F0 per ciascuna delle ROIs selezionato. Calcolare la deviazione standard di ΔF basale/F0 (prima di stimolazione).
        Nota: Una risposta positiva è considerata se aumenti in ΔF/F0 ottenuti durante la stimolazione sono più grandi di 2 deviazioni standard dei valori basali.

5. analisi di comportamento olfattivo-Guida

Nota: Un diagramma schematico del setup per eseguire il dosaggio è illustrato nella Figura 3.

  1. Fare piccoli fori per adattarsi a tubi di 1.57 mm O.D. x 1,14 mm di diametro nella parte superiore di ciascun pozzetto di un piatto 6 pozzetti. Inserire il tubo e guarnizione utilizzando un adesivo epossidico (Vedi Tabella materiali).
    Nota: Il piatto modificato può essere riutilizzato molte volte dopo accurato lavaggio con acqua distillata.
  2. Preparare 50 mL di una soluzione dell'aminoacido che contiene metionina, leucina, istidina, arginina e lisina (Vedi punto 3.2 per dettagli). Le concentrazioni possono variare da 160 µM a 1 mM. Posto 20 mL della soluzione in un serbatoio con privilegi elevato.
  3. Non si nutrono di girini per almeno 12 ore prima del dosaggio. Prendere 6 girini da loro serbatoio di alloggiamento e metterli in 2 L di acqua pulita girino per ridurre al minimo l'esposizione a odoranti.
  4. Mettere il piatto 6 pozzi modificate su un bianco LED-transilluminatore (Figura 3).
  5. Coppie le insenature di aspersione al serbatoio contenente la soluzione di aminoacidi utilizzando un collettore (Vedi Tabella materiali). Controllare il sistema di perfusione ed eliminare bolle d'aria. Riempire i 6 pozzetti contemporaneamente. Regolare l'altezza del serbatoio per consentire la consegna di ≥ 5 mL di soluzione di odorizzante entro ~ 30 s.
    Nota: Lavare ogni ben 4 volte con acqua distillata doppia dopo l'esposizione alla soluzione di odorizzante.
  6. Riempire ogni bene con 10 mL di acqua girino. 1 posto girino/pozzetto. Lasciare riposare per > 3 min.
  7. Impostare acquisizione immagine. Utilizzare una telecamera CCD convenzionale che può acquisire immagini a ≥ 5 Hz. Connetti la fotocamera al computer. Qui, usare una macchina fotografica Zeiss MRC5 controllata dal software Zen ma altre configurazioni equivalente possono essere utilizzati. Se è necessario aumentare la frequenza dei fotogrammi, applicare Pixelbinning. Immagini dovrebbero mostrare il piatto intero 6-pozzetti.
  8. Avvia acquisizione immagine tale che contengono film basale (30 s), stimolo (25 – 35 s) e periodi di recupero (30 – 60 s).
  9. Restituire gli animali dal piatto 6 pozzi ai serbatoi dopo formazione immagine.
  10. Analizzare il film in ImageJ utilizzando plugin come wrMTrck19,20 che forniscono più parametri associati a motilità.
  11. Per preparare le immagini per l'analisi, selezionare prima un pozzo disegnando un ROI rettangolare di 35 x 35 mm (Figura 4A). Ottenere un'immagine di sfondo calcolando la massima sporgenza dell'intera sequenza. Si dovrebbe visualizzare un'immagine del pozzo senza il girino.
  12. Sottrarre la massima proiezione del film crudo. Eseguire la soglia sul film 32 bit generato e applicare il plugin wrMTrck. Regolare i parametri di WrMTrck per tenere traccia dei movimenti degli animali in modo affidabile. Trasferire l'ottenuti coordinate X, Y in un programma di analisi.
  13. Le coordinate utilizzando X-Y, calcolare la distanza euclidea all'origine odorant (ingresso di aspersione nel pozzo), applicando l'equazione seguente:
    figure-protocol-1
    dove il sistema operativo indica la posizione della fonte di odore e tad indica la posizione di girino in un dato momento. Vedi Figura 4A per i dettagli.

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Risultati

In questa carta, presentiamo una combinazione di due approcci complementari per eseguire in vivo studio della funzionalità del sistema olfattivo girino Xenopus : ho) un metodo per l'imaging presinaptici Ca2 + cambia nei glomeruli dei viventi girini utilizzando un indicatore fluorescente del calcio e ii) un odore guidata analisi comportamentale che può essere utilizzato per studiare la risposta a specifici odoranti a base acquosa. Dal momento che questi approcc...

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Discussione

Questo documento vengono descritte le tecniche che sono utili per analizzare la funzionalità delle vie olfattive in vita girini di Xenopus . Il protocollo attuale è particolarmente utile per i laboratori che lavorano, o hanno accesso a Xenopus; Tuttavia, è anche interessante per quei ricercatori che studiano le basi cellulari e molecolari di riparazione e rigenerazione neuronale. Risultati ottenuti in Xenopus possono essere combinati con dati raccolti in altri modelli vertebrati per identificar...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofinanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR), di premi di ricerca competitivo dalla M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship Fund, Laura e Arthur Colwin dotato estate Research Fellowship Fund , la compagnia di Fischbach e il grande fondo di generazione il Marine Biological Laboratory e la nazionale RRID:SCR_013731 di risorsa di Xenopus (Woods Hole, MA) dove una parte di questo lavoro è stato condotto. Ringraziamo anche il programma CERCA / Generalitat de Catalunya per sostegno istituzionale. A.L. è un collega di Serra Húnter.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sali per acquari (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaina (Etile 3-amminobenzoato metanosulfonato)Pinzetta Sigma-AldrichE10521
#5 (punta 0,025 x 0,005 mm)World Precision Instruments501985
Vannas Forbici (punta 0,015 x 0,015)World Precision Instruments501778
Whatman carta da filtro qualitativaFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropean Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Calcio Verde destrano, Sale di potassio, 10.000 MW, capillari borosilicati AnionicThermoFisher ScientificC-3713
per microiniezioneSutter InstrumentB100-75-10O.D.=1,0 mm., I.D.=0,75 mm.
PullerSutter InstrumentP-97
MicroiniettoreParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Micropipette Microfil WorldPrecision InstrumentsMF28G-5
Microscopio verticaleZeissAxioImager-A1
Master-8 stimolatoreA.M.P.I.
Telecamera CCDHamamatsuImmagine EM
ElettrovalvoleWarner InstrumentsVC-6 Sistema
Dow Corning Grasso per alto vuotoVWR Scientific636082B
Tubocurarina cloridratoSigma-AldrichT2379
Telecamera CCD TelecameraZeissMRC-5controllata da Zen
obiettivo per telecameraThorlabsMVL8ML3Ci sono molteplici possibilità che dovrebbero essere adattate al modello di telecamera utilizzato
Resina epossidicaRS Components
CollettoreWarner InstrumentsMP-6 Collettore
Micromanipolatore per la consegna locale di soluzioniNarishigeMN-153
Mini morsetti magneticiWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Tubi in polietileneWarner Instruments64-0755O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.
a sei canali software di perfusione

Riferimenti

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