Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

Summary

L'identificazione delle interazioni fisiche tra geni ed elementi regolatori è impegnativo ma è stata facilitata dai metodi di cattura conformazione del cromosoma. Questa modifica del protocollo 4C-seq mitiga bias PCR riducendo al minimo eccessiva amplificazione dei modelli di PCR e massimizza la mappability di letture incorporando un passo di digest di aggiunta degli enzimi di limitazione.

Abstract

L'identificazione di elementi regolatori per un gene target dato pone una sfida tecnica notevole a causa della variabilità nelle misure di posizionamento e di effetto di elementi regolatori ad un gene dell'obiettivo. Alcuni progressi compiuti con il pronostico di bioinformatica dell'esistenza e la funzione delle modificazioni epigenetiche prossimale associata con l'espressione di gene attivato utilizzando siti di legame del fattore di trascrizione conservata. Gli studi di cattura di conformazione cromatinica hanno rivoluzionato la nostra capacità di individuazione dei contatti fisici della cromatina tra sequenze e anche all'interno di un intero genoma. Acquisizione di conformazione cromatinica circolare accoppiato con sequenziamento di nuova generazione (4C-seq), in particolare, è progettato per scoprire tutte le possibili interazioni fisiche della cromatina per una data sequenza di interesse (Belvedere), ad esempio un gene bersaglio o una regolamentazione Enhancer. Attuali strategie di 4C-seq direttamente sequenza all'interno il punto di vista ma richiedono numerose e punti di vista diversi da sequenziare contemporaneamente per evitare le sfide tecniche della divisa base chiamata (imaging) con successiva generazione di piattaforme di sequenziamento. Questo volume di esperimenti potrebbe non essere pratico per molti laboratori. Qui, segnaliamo un metodo modificato del protocollo di 4C-seq che incorpora sia un digest di ulteriori degli enzimi di limitazione e passaggi di amplificazione qPCR-basato che sono progettati per facilitare una maggiore acquisizione di sequenza diverse letture e ridurre il potenziale per Bias di PCR, rispettivamente. Il nostro metodo modificato di 4C è favorevole al laboratorio di biologia molecolare standard per la valutazione della architettura della cromatina.

Introduction

L'identificazione di elementi regolatori per l'espressione genica è stata facilitata dal progetto Enciclopedia di DNA Elements (ENCODE) che globalmente annotati attività funzionale per l'80% del genoma umano^1,2. L'identificazione dei siti per in vivo associazione di fattore di trascrizione, ipersensibilità di DNaseI e istone epigenetici e modifiche di metilazione del DNA in tipi cellulari individuali ha spianato la strada per l'analisi funzionale del candidato normativo elementi di espressione genica. Armati di questi risultati, dobbiamo affrontare la sfida di determinare l'interconnessione funzionale....

Protocol

1. selezione degli enzimi di limitazione

1. Identificare una regione di interesse (ad es., promotore del gene, polimorfismo a singolo nucleotide (SNP), enhancer) e ottenere la sequenza di DNA dai repository come centro nazionale per Biotechnology Information (NCBI).
2. Identificare gli enzimi di limitazione del candidato (REs) per la prima digestione degli enzimi di restrizione (RE1) che non tagliare all'interno della sequenza di interesse, che producono l'estremità appiccicosa (termini di DNA con sporgenze) dopo RE digestione, e cui attività non sono inibiti da Metilazione di CpG.
   Nota: La risoluzione dei dati è determinata da RE1. Un enzima....

Results

Keratinocytes umani primari sono stati isolati da 2 – 3 scartati neonatale prepuzi, riunita e colta in KSFM completati con 30 µ g/mL pituitaria bovina Estratto, 0,26 ng/mL ricombinante umano fattore di crescita epidermico e 0,09 mM di cloruro di calcio (CaCl₂ ) a 37 ° C, 5% di anidride carbonica. Le cellule sono state divise in due boccette, e una boccetta è stata differenziata dall'aggiunta di CaCl₂ a una concentrazione finale di 1.2 mM per cellule⁷ di 72.......

Discussion

4C risultati hanno il potenziale per rivelare le interazioni di cromatina che possono identificare gli elementi normativi precedentemente sconosciuti e/o geni bersaglio che sono importanti in un contesto biologico specifico^24,25,26. Tuttavia, gli ostacoli tecnici possono limitare i dati ottenuti da questi esperimenti. Bias PCR derivanti dalla eccessiva amplificazione del modello nei protocolli 4C è probabile. Questo protocollo r.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HindIII	NEB	R0104S
CviQI	NEB	R0639S
Primer per oligonucleotidi DNA	IDT		Da progettare dal lettore
Provette da centrifuga coniche da 50 mL	Fisher Scientific	06-443-19
Provette per microcentrifuga da 1,7 mL	Soluzione
	Thermo Fisher	14190-136
Formaldeide, senza metanolo	Microscopia elettronica Scienze	15710
Nutatore	VWR	15172-203
Glicina	JT Baker	4059-00
Centrifuga
Microcentrifuga
Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA)	Sigma-Aldrich	ED2SS
20% soluzione SDS	Sigma-Aldrich	05030
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
Vetrini Fisher	Scientific	12-550-143
Vetrini coprioggetti	VWR	16004-094
Microscopio
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
			termico di agitazione
2 M Tris-HCl	Qualità Biologica	351-048-101
Proteinasi K	NEB	P8107S
Fenolo:cloroformio:alcol isoamilico (25:24:1)	Sigma-Aldrich	P2069
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	M5661
20 mg/ mL di glicogeno	Thermo Fisher	R0561
Etanolo	Fisher Scientific	04-355-223
Acqua priva di nucleasi	Fisher Scientific	MT-46-000-CM
qPCR	cycler Thermo Fisher	4453536
piastre qPCR	Thermo Fisher	4309849
Thermo	Fisher	4375786
Provette per strisce	PCR MidSci	AVSST-FL
1 M Cloruro di magnesio	Qualità Biologico	351-033-721
Ditiotreotolo	Sigma-Aldrich	43815
Adenosina trifosfato	Sigma-Aldrich	A2383
T4 DNA Ligasi	NEB	M0202S
Agarosio	Sigma-Aldrich	A6013
RNase A	Thermo Fisher	EN0531
Kit di purificazione PCR Qiaquick
purificazione PCR MinElute Kit di purificazione PCR	Qiagen	28004
Spettrofotometro
Expand Long Template PCR System	Sigma-Aldrich	11681834001
dNTP mix	Thermo Fisher	R0191
SYBR Green I	Sigma-Aldrich	S9430
ROX	BioRad	172-5858
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S5886
End-It Kit di riparazione terminale del DNA	Lucigen	ER0720
LigaFast Sistema di legatura rapida del DNA	Promega	M8221
SYBR Safe	Thermo Fisher	S33102
Taq Polimerasi	NEB	M0267S
UltraSieve Agarosio	IBI Scientific	IB70054
Kit di estrazione su gel Qiaquick Qiagen		28704