Caratterizzante Microbiome Dynamics – flusso Cytometry basato su flussi di lavoro da colture Pure di comunità naturali

Summary

L'analisi cytometric di flusso si è dimostrato prezioso per l'indagine di colture pure e monitoraggio dinamiche comunità microbica. Presentiamo tre flussi di lavoro completi, dal campionamento all'analisi dei dati, delle colture pure e complessa comunità nel medio chiaro anche come matrici impegnativi, rispettivamente.

Abstract

L'indagine delle colture pure e monitoraggio delle dinamiche di comunità microbica è di vitale importanza per comprendere e controllare gli ecosistemi naturali e applicazioni tecniche, guidate da microrganismi. Prossima generazione metodi di sequenziamento sono ampiamente utilizzati per risolvere microbiomi, ma sono generalmente risorse e tempo intensivo e fornire informazioni per lo più qualitativo. L'analisi citofluorimetrica microbiome non soffrono di tali svantaggi e può fornire le abbondanze subcommunity relativo e assoluto cellula numeri alla produzione. Anche se non fornisce informazioni dirette filogenetiche, può aumentare la profondità di analisi e risoluzione di sequenziamento approcci. In netto contrasto con le applicazioni mediche in ambienti di routine sia la ricerca, citometria a flusso è ancora non ampiamente usato per l'analisi del microbioma. Informazioni mancanti su tubazioni di analisi dati e preparazione del campione possono creare una barriera all'ingresso per i ricercatori sfide microbiome analisi sarebbe spesso applicazioni di cytometry di flusso da manuale. Qui presentiamo tre flussi di lavoro completi per colture pure, comunità complesse in chiaro media e complessa comunità in matrici impegnativi, rispettivamente. Descriviamo le singole procedure di campionamento e la fissazione e ottimizzato che macchia i protocolli per i set di esempio. Elaborare l'analisi cytometric con una complessa ricerca centrata e un dispositivo top di applicazione mirata panca, descriviamo la cella ordinamento procedura e suggerire pacchetti di analisi dei dati. Inoltre proponiamo importanti controlli sperimentali e applicare i flussi di lavoro presentati ai rispettivi campione set.

Introduction

Microrganismi gioca un ruolo fondamentale in molti aspetti dell'essere umano vivo. Essi sono i principali fattori biotici del carbonio pianeti, azoto, fosforo e zolfo cicli¹e atto come degradante^2,3 , nonché di sintetizzazione⁴ biocatalizzatori in vari settori, quali il trattamento delle acque reflue ⁵ o biotecnologia⁶. Esse costituiscono anche il microbioma umano, che sta influenzando direttamente la salute umana e metabolismo^7,8. Pertanto, le informazioni sulla struttura, funzione e comportamento dinamico di microrganismi, in risposta al loro ambiente immediato, sono necessarie se il nostro obiettivo è di comprendere e manipolare questi sistemi. Next generation sequencing (NGS) è la tecnologia consolidata per la risoluzione di struttura e funzione microbiome⁹. Tuttavia, l'analisi e la valutazione di dati NGS non può cedere informazioni quantitative ed è ancora costosa, richiede molto tempo e in nessun modo pronto a fornire risultati in loco all'interno di corridoi di prestazioni. Alcuni batteri visualizzare tempi di generazione sotto 1 h e causa strutture comunitarie in determinati ambienti¹⁰in continua evoluzione. A seguito di tali dinamiche, utilizzando approcci di sequenziamento supererebbe la capacità finanziaria e della forza lavoro dei laboratori più scientifici.

Al contrario, citometria a flusso può fornire comunità impronte simili ai dati NGS, pur mantenendo un'alta efficienza di tempo, lavoro e costi. Qui, presentiamo tecniche cytometric di flusso in grado di seguire la dinamica comunità microbica alla produzione a livello di singola cellula. A differenza di NGS, citometria a flusso non fornisce informazioni o affiliazione filogenetica su geni funzionali, ma offre numeri quantitativa delle cellule. Mediante citometria a flusso, comunità microbiche possono essere risolti in subcommunities con distinte dispersione della luce e le proprietà di fluorescenza (forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) forniscono indicazioni delle dimensioni della cella e granularità, rispettivamente). L'approccio presentato utilizza prevalentemente cella dimensione - e DNA importo informazioni correlate che sono associati a determinati tipi di cellule e stati fisiologici (crescita). Il contenuto di DNA è quantificato utilizzando il UV-eccitabile 4', 6-diamidino-2'-phenylindole tintura di (DAPI), che si lega a regioni ricche di A-T del DNA e anche in grado di risolvere diversi livelli cromosomici. Combinando la fluorescenza di DAPI e FSC oltre 50 subcommunities può essere distinto e monitorato per la commutazione abbondanze tempo¹¹. Le variazioni di abbondanza di subcommunity possono essere correlate con i cambiamenti nei dintorni micro-ambientali, quali pH e prodotto i titoli¹², con i parametri globali, quali il meteo^13,14, o in caso di intestino o saliva microbiomi con determinati trattamenti medici¹⁵. Queste correlazioni rivelano chiave subcommunities responsabile per particolari funzioni nella rete metabolica di tutta la Comunità. La chiave subcommunities può quindi essere specificamente promosso soppressa alterando il micro-ambienti circostanti o ordinati per ordinamento successivo¹⁵ o proteomica indagine¹⁶.

Tuttavia, citometria a flusso di comunità microbica non è ancora largamente stabilito a causa di un numero piuttosto basso di flusso cytometric dispositivi in grado di risolvere correttamente popolazioni microbiche o comunità. Inoltre, la mancanza di esperienza, comunità analisi condotte e valutazione dei dati efficace può rappresentare una barriera all'ingresso per i ricercatori microbiome analisi sfide. Abbiamo stabilito i flussi di lavoro complete per affrontare questi problemi. Per illustrare la loro applicabilità generale, li presenteremo su tre insiemi di campione esemplare (File supplementari 1-S1), vale a dire io) una coltura pura (PC) per applicazioni biotecnologiche coltivate in terreno chiaro definito (Pseudomonas putida KT 2440 su glucosio), ii) una comunità di laboratorio complesse in chiaro medio (comunità di fanghi (ASC) in acque reflue sintetica) e iii) una comunità complessa da ambienti naturali in una matrice densa (comunità di biogas (BC) in insilato di mais).

Parecchi fattori influenzano la scelta del protocollo per ciascuno di questi insiemi di campioni. Surgelazione rinuncia l'uso di sostanze chimiche tossiche ma è principalmente limitata agli ambienti di laboratorio a causa dell'uso dell'azoto liquido per glassa di scossa. La stabilizzazione di formaldeide ed etanolo successiva fissazione consente il campionamento di massa senza la necessità di preparazione aliquotare e ha dimostrato di essere stabile per lunghi periodi. Tuttavia, i campioni ricchi di proteine quali saliva umana¹⁵ possono essere problematici, perché flocculi di proteina, sgrassarla dalla formaldeide, possono causare il segnale sfavorevole ai rapporti di rumore. L'essiccazione del campione richiederà più tempo (circa 1 h in totale) delle procedure in questo confronto, ma può essere eseguita sul posto senza sostanze chimiche tossiche. Produce pellet stabile nei tubi, che possono essere facilmente spediti senza raffreddamento o ulteriori precauzioni di pericolo. Inoltre, un sacco di metodi di fissazione alternativi sono stati proposti¹¹. Consigliamo vivamente di testare la stabilità ad alta risoluzione e la fissazione di diversi protocolli quando l'introduzione di un nuovo set di esempio.

Abbiamo usato due citometri a flusso diversi per analizzare i set: i) una ricerca altamente sofisticato e costoso, centrato Classificatore celle e ii) un'applicazione dedicata panca analizzatore superiore che sembra essere più appropriato per applicazione in loco⁵. Il BC è stato misurato con l'analizzatore top panchina, mentre il PC e ASC sono stati misurati con il classificatore celle. L'analisi del campione esemplare tre imposta richieste procedure diverse per riproducibilità ottimizzata, la stabilità del campione e la convenienza del flusso di lavoro. Il seguente protocollo specificherà le sezioni per i tre diversi sistemi.

Protocol

1. il campionamento e la fissazione

1. Coltura pura:^15,17 il congelamento
   1. Prendere 2 mL di sospensione cellulare, centrifugare per 5 min a temperatura ambiente (TA) e 5.000 x g e scartare il surnatante.
      Nota: La sospensione cellulare campionata è descritto nel File supplementari 1-S1.
   2. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone fosfato salino (PBS; 6 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM NaH₂PO₄, 145 mM NaCl con bi-distillata H₂O, pH 7,2) inoltre contenente glicerolo al 15% (v/v) come agente crioprotettivo.
   3. Incubare per 10 minuti su ghiaccio e shock congelamento in azoto liquido per successive operazioni di conservazione a-80 ° C.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni sono stabili per almeno un mese.
2. Attivata la comunità dei fanghi: stabilizzazione di formaldeide + etanolo fissazione^5,10,18
   1. Prendere 4 mL di sospensione cellulare, centrifugare per 20 min 15 ° C e 3.200 x g e scartare il surnatante.
      Nota: La sospensione cellulare campionata è descritto nel File supplementari 1-S1.
   2. Aggiungere 4 mL di formaldeide al 2% in PBS e incubare per 30 minuti a TA.
      1. Preparare soluzione stock di 8% formaldeide da paraformaldeide per evitare il conservazione metanolo additivo aggiunto alla formaldeide spediti in forma liquida. Aggiungere 4 g di paraformaldeide a 50 mL di PBS a 70 ° C. Aggiungere circa 125 µ l di soluzione di NaOH 10 M. Mescolare fino a quando la paraformaldeide è completamente dissolto e lasciarlo poi raffreddare RT. regolare il pH a 7.0 con circa 100 µ l 37% HCl. congelare la soluzione di formaldeide in aliquote da 15 mL per la conservazione. Non utilizzare decongelate aliquote superiore ai 10 giorni.
         Attenzione: Formaldeide deve essere maneggiato ed eliminato con cura grazie alle sue proprietà mutagene e tossiche. Indossare sempre i guanti durante l'impiego. Utilizzare una cappa di scarico mentre il paraformaldeide di dissoluzione per evitare l'esposizione ai fumi tossici.
   3. Centrifugare il campione per 10 min a 15 ° C e 3.200 x g e scartare il surnatante.
   4. Risospendere il campione in 4 mL di etanolo al 70% e conservare a-20 ° C.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni sono stabili per almeno 2 mesi. A seconda delle proprietà del campione, il passo di centrifugazione in 1.2.1 può essere eseguito anche per 10 min a 4 ° C per risparmiare tempo.
3. Comunità di biogas: essiccazione
   1. Utilizzare una punta ritagliato 1.000 µ l per campione 200 µ l del digestato viscoso in una provetta da 2 mL.
   2. 1.700 µ l di tampone PBS e mescolare accuratamente.
   3. Disporre le provette in un bagno ad ultrasuoni a 35 kHz e 80 W di potenza di output effettivo per 1 min per sciogliere gli aggregati di grandi cellule e staccare cellule attaccare residui delle cellule delle piante.
   4. Mescolare accuratamente il campione, filtrare il campione attraverso un filtro a maglia 50 µ l e divide il filtrato in quattro aliquote di circa 400 µ l.
      Nota: Preparare aliquote a questo punto offre due vantaggi principali. Volumi in primo luogo, più piccoli sono più facile e più veloce da asciugare meccanicamente (centrifuga) e termicamente (essiccazione), ma di campionamento di piccoli volumi dal solito fango spessa biogas può essere molto impegnativo. Secondo, extra campioni possono essere usati per successiva cella ordinamento, backup misure o controlli.
   5. Centrifugare le aliquote due volte per 10 min a 10 ° C e 4.000 x g e scartare il surnatante completamente entrambe le volte per meccanicamente asciuga il campione nel miglior modo possibile.
   6. Asciugare i campioni in una centrifuga vuoto riscaldata per 40 minuti a 35 ° C, kPa circa-97 e 2.500 x g per creare pellet stabile. Conservare il pellet a 4 ° C al buio.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I pellet sono stabili per almeno 6 mesi.

2. colorazione

Nota: Colorazione DAPI ha dimostrato di fornire trame puntino ad alta risoluzione e pertanto è particolarmente vantaggioso quando si analizzano le comunità. La concentrazione di DAPI nella soluzione colorante deve essere ottimizzato per garantire un'intensità di fluorescenza del cancello di cella ben di sopra del livello di rumore, ma sotto le perline. L'optimum dipende dalla scelta di sensibilità e perlina di strumento, può variare tra insiemi di campione a causa del contenuto di G/C dei microrganismi contenuti e generalmente dovrebbe essere testato per set di esempio appena introdotta. Test di concentrazioni tra 0.24 µM DAPI e 1 µM DAPI è consigliato per l'installazione presentata. Altri coloranti potrebbero essere usati per applicazioni specifiche. L'uso di un SYBR Green mi protocollo di colorazione è consigliato quando la cella assoluta precisione di conteggio è una priorità sopra le impronte digitali di^6,di analisi (File supplementari 1-S1)¹⁵. Esso include meno passaggi di movimentazione e centrifugazione del campione ed è applicabile con celle fisse e vitale. L'uso di cellule vitali riduce ulteriormente le procedure di gestione di esempio saltando la fissazione e quindi richiede solo una centrifugazione per la raccolta delle cellule. Ciò minimizza il potenziale perdita delle cellule e l'errore di misurazione di conseguenza sistematica. Il PBS, permeabilization buffer e macchiatura soluzione utilizzata durante tutti i passaggi seguenti deve essere filtrato attraverso filtri per siringa 0,2 µm per ridurre il carico di ulteriori particelle nel campione. La colorazione di un campione contenente Escherichia coli BL21 (DE3) come standard biologici con piscina ogni campione è consigliato.

1. Coltura pura
   1. Scongelare i campioni, centrifuga per 5 min a RT e 5.000 x g e scartare il surnatante.
   2. Risospendere il pellet cellulare in PBS freddo ghiaccio pipettando ripetute e regolare il OD_700nm a 0,035 (percorso lunghezza_cuvetta = 0,5 cm).
   3. Preparare le celle per la colorazione.
      1. Centrifugare 1 mL di sospensione cellulare regolato per 5 min a RT e 5.000 x g e scartare il surnatante.
      2. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di permeabilizzazione contenente acido citrico 0.3 M e 4,1 mM Tween20 e mescolare accuratamente.
      3. Incubare il campione per 10 min sul ghiaccio per creare membrane permeabili per la successiva colorazione.
      4. Centrifugare il campione per 5 min a RT e 5.000 x g e scartare il surnatante.
   4. Aggiungere 1 mL di soluzione contenente 0.68 µM DAPI nel buffer di 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (289 mM Na₂HPO₄, 128 mM NaH₂PO₄ con bi-distillata H₂O, pH 7) la macchiatura, mescolare e Incubare per almeno 15 min a RT nel buio.
      Nota: Regolazione precisa OD è cruciale per garantire misurazioni comparabili perché la fluorescenza di DAPI varierà con la densità delle cellule, se la concentrazione di DAPI è mantenuta costante. Il surnatante dovrebbe essere tolte con cautela a causa di un pellet generalmente fragile per impedire la perdita delle cellule.
      Attenzione: Maneggiare e smaltire DAPI con cura grazie alle sue proprietà mutagene.
2. Comunità di fanghi attivi
   1. Mescolare accuratamente il campione fisso e trasferire 0,6 mL in una provetta di vetro. Aggiungere 1,4 mL di PBS e trattare con ultrasuoni per 10 min a RT come descritto al punto 1.3.3. Centrifugare il campione per 10 min a 4 ° C e 3.200 x g e rimuovere il surnatante. Aggiungere 2 mL di PBS e mescolare accuratamente. Sonicare per 5 min.
   2. Regolare il OD_700nm a 0,035 (percorso lunghezza_cuvetta = 0,5 cm) con PBS.
   3. Preparare le celle per la colorazione.
      1. Centrifugare il campione per 10 min a 4 ° C e 3.200 x g e rimuovere il surnatante.
      2. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di permeabilizzazione contenente acido citrico 0,11 M e 4,1 mM Tween20 e mescolare accuratamente.
      3. Incubare per 20 min a RT per creare membrane permeabili per la successiva colorazione.
      4. Centrifugare il campione ancora per 10 min a 4 ° C e 3.200 x g e rimuovere il surnatante.
   4. Aggiungere 2 mL di soluzione colorante contenente 0,68 µM DAPI e 417 mM tampone Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ , mescolare accuratamente e incubare per almeno 60 minuti a RT nel buio.
      Nota: È consigliato l'uso di tubi di vetro, come alcuni microrganismi tendono ad aderire alle pareti del tubo di plastica e possono essere persi durante il processo. Incubazione durante la notte è anche possibile e solitamente semplifica le procedure di laboratorio.
      Attenzione: DAPI deve essere maneggiato ed eliminato con cura grazie alle sue proprietà mutagene.
3. Comunità di biogas
   1. Sospendere il pellet cellulare secchi in PBS.
      1. Aggiungere 800 µ l di PBS, mescolare accuratamente e lasciare il pellet in ammollo per 15 min.
      2. Aspirare la fase liquida con una pipetta di 1.000 µ l e spostare il pellet imbevuto nella sezione cilindrica della parete del tubo con la punta della pipetta. Dovrebbe attaccare lì.
      3. Spostare la punta della pipetta in un movimento circolare a schiacciare la pallina lungo le pareti del tubo.
      4. Lavare i residui risultanti fuori le mura di tubo da fase liquida dalla punta della pipetta lungo la parete del tubo di erogazione.
      5. Agitare la sospensione ad aspirazione ed sospendendolo nella pipetta tre volte.
   2. Lavare il campione con PBS due volte.
      1. Centrifugare per 5 min a 10 ° C e 4.000 x g e scartare il surnatante.
      2. Aggiungere 1.500 µ l di PBS e mescolare accuratamente.
      3. Ripetere i due passaggi sopra una volta.
   3. Disporre le provette in un bagno ad ultrasuoni per 1 min, come descritto al punto 1.3.3 e, successivamente, filtrare ogni campione attraverso un filtro a maglia 50 µ l in una provetta di vetro individuali.
   4. Diluire 2 mL del campione a OD_700nm 0,035 (percorso lunghezza_cuvetta = 0,5 cm) con PBS.
   5. Preparare le celle per la colorazione come spiegato al punto 2.2.3 sopra.
   6. Aggiungere 2 mL di soluzione colorante contenente 0,24 µM DAPI e 417 mM tampone Na₂HPO /NaH₄₂PO₄ , mescolare accuratamente e incubare tutta la notte a temperatura ambiente al buio.
      Attenzione: DAPI deve essere maneggiato ed eliminato con cura grazie alle sue proprietà mutagene.

3. misurazione

Nota: I set esempio esemplare sono stati analizzati con due citometri a flusso diverse. Il PC e l'ASC sono stati analizzati con una ricerca più complessa, altamente regolabile e facilmente personalizzabile, centrato Classificatore celle. Per l'analisi di PC, questo dispositivo era dotato di un laser impostato fino come descritto nella precedente pubblicazione¹⁶, in breve un blu (488 nm, 400 mW) e un ultravioletto (334 – 364 nm, 100 mW) laser dello ione dell'argon. Per l'analisi ASC, blu più recenti (488 nm, 400 mW) e ultravioletto (355 nm, 150 mW) laser a semiconduttore sono stati installati. In entrambi i casi, il laser blu ha indotto il FSC (passa-banda filtro 488 nm ± 5 nm, filtro a densità neutra 1,9) e la SSC (passa-banda filtro 488 nm ± 5 nm, filtro a densità neutra 1,9, trigger). Queste caratteristiche ottiche sono legate alla dimensione delle cellule e la densità delle cellule, rispettivamente. I laser UV eccitato la fluorescenza di DAPI (passa-banda filtra a 450 nm ± 32,5 nm) per la quantificazione del contenuto di DNA cellulare. Il sistema fluidico è stato eseguito 56 psi (3.86 bar) con la sovrapressione di campione massimo 0,3 psi e un ugello di 70 μm. Tutti i parametri sono stati registrati come altezze dei picchi invece le aree dei picchi per migliorare la risoluzione di misura. Il monitoraggio a lungo termine della comunità di biogas è stata condotta con la cuvetta flusso meno complessa, basata, analizzatore top panchina. Un laser a semiconduttore ultravioletta (355 nm, 50 mW) è stato usato per indurre il FSC (passa-banda filtra 355 nm ± 5 nm) e SSC (passa-banda filtro 355 nm ± 5 nm, trigger) segnali ed eccitare la fluorescenza di DAPI (passa-banda filtro 455 nm C). L'acqua utilizzata per il buffer di guaina di entrambi i dispositivi era bi-distillata e 0,1 µm filtrata. Il PBS utilizzato per la diluizione del campione deve essere filtrato attraverso filtri per siringa 0,2 µm per ridurre il rumore delle particelle nelle misurazioni per quanto possibile.

1. Coltura pura e comunità di fanghi attivi
   1. Avviare la strumento, laser, computer e software e preparare per l'analisi del campione.
      1. Accendere il laser e correre per 15 minuti raggiungere la temperatura di funzionamento e garantire la stabilità del fascio.
      2. Riempire il serbatoio di guaina con guaina tampone (19mm KH₂PO₄, 38 mM KCl, 166 mM Na₂HPO₄, 1,39 M NaCl con bi-distillata H₂O): 10x diluito con bi-distillata H₂O a un 0.2 x soluzione di lavoro (per l'ordinamento delle cellule: 0,5 x soluzione di lavoro).
      3. Preparare il sistema fluidico con 56 psi sopra pressione e il serbatoio di scarico con circa vuoto di 6 psi.
      4. Eseguire lo strumento per minimo 15 min in modalità Backflush per sciacquare il portacampione, tubo e ugello.
   2. Calibrare con perline standard.
      1. Preparare il mix di perle per la calibrazione nella (1 μm blu + 2 μm giallo-verde fluorescente) lineare e logaritmica gamma (0,5 μm e 1 μm blu fluorescenti). Diluire la sospensione tallone dalle sospensioni stock originale per ottenere concentrazioni uguali.
      2. Continuamente misurare il mix di perle lineare e montare le cime del tallone per un modello di calibrazione preimpostata manipolando l'ugello e posizioni di ottica di pre-calibrazione dello strumento nell'intervallo lineare del laser.
      3. Passare al campo logaritmica e misuriamo costantemente il mix di perle logaritmica. Montare i picchi di perlina al loro modello di calibrazione preimpostata per sintonizzare l'hardware dello strumento. Effettuare le regolazioni finali per la posizione di tallone utilizzando l'impostazione del guadagno dei tubi di fotomoltiplicatore (PMT).
      4. Verificare la posizione del rumore strumentale ed eventualmente modificarla per adattarla al modello di calibrazione.
         Nota: Un modello di taratura fissa per la posizione delle perle deve essere preparato prima un progetto di misurazione e non può essere modificato (Vedi File supplementari 1-S4). Rumore strumentale può essere indotta da particelle nel campione ovvero il rumore elettronico della PMT e sarà sempre registrato in una certa misura. Non si consiglia di nascondere completamente il rumore da guadagno regolazione o stampa offset. L'abbondanza e la posizione degli eventi rumore può essere una preziosa fonte di informazioni e pertanto deve essere contenuti nei dati raw. Campioni di particelle molto intensivo potrebbero richiedere la successiva rimozione del rumore per motivi di analisi dati e stampa. Controllare la calibrazione a intervalli regolari durante una giornata di misura per garantire la stabilità dello strumento e quindi assaggiare comparabilità.
   3. Misurare un campione contenente lo standard biologico come descritto in 2.1.4 (DAPI macchiato Escherichia coli BL21 (DE3), provato e risolto durante la fase stazionaria (16h) secondo il protocollo ASC descritto in 1.2). Controllare la posizione di picco rispetto al loro modello di calibrazione preimpostata (Vedi File supplementari 1-S5).
      Nota: La routine colorazione e misura dello standard biologici con ogni pool di campioni servirà anche come controllo interno per la procedura di colorazione. Se il dispositivo è calibrato utilizzando perline e lo standard biologico non si adatta il modello di calibrazione preimpostata, la procedura di colorazione probabilmente ha bisogno di essere ripetuta.
   4. Acquisizione del campione.
      1. Eseguire la soluzione colorante per 10 min sciacquare il tubo e pozzetto campione e garantire la stabilità della fluorescenza DAPI in campioni successivi.
      2. Filtrare il campione macchiato con un filtro a rete 50 μm prima della misurazione per impedire l'intasamento dell'ugello citometro o flusso capillare.
      3. Aggiungere il mix di perle logaritmica nell'esempio per monitorare la stabilità dello strumento e fornire la possibilità per un controllo di calibrazione retrospettiva. I campioni devono contenere tra 1.000 e 2.500 eventi in ciascuna delle porte due perle.
      4. Creare un cancello di cella nel software dello strumento durante le misurazioni di prova prime di un nuovo set di esempio. Questa porta dovrebbe contenere le cellule marcate ed escludere il rumore e perline.
      5. Mescolare i campioni e misurare ad una velocità massima di 3.000 eventi s^-1 fino a 250.000 cellule (Comunità) o 50.000 (colture pure) vengono rilevati all'interno del cancello della cella.
         Nota: Questi conteggi delle cellule sono scelti sulla base dell'esperienza con il set di esempio. Numeri differenti possono essere utilizzati per spostare il compromesso tra l'efficienza di misurazione e la rilevazione di subcommunities abbondanza bassa in entrambe le direzioni.
         Risoluzione dei problemi: Improvvisa intra-misurazione turni del tallone e posizione della cella può essere causato da bolle d'aria intrappolate nell'ugello. Ciò richiede la rimozione e la pulizia dell'ugello e il risciacquo del sistema fluidico con buffer di guaina. Lo strumento deve essere riadattato dopo rimontando l'ugello (inizio con passo 3.1.2).
      6. Backflush lo strumento accuratamente con tampone di guaina prima dell'arresto e campioni di commutazione.
2. Comunità di biogas
   1. Avviare la strumento, laser, computer e software per la preparazione per l'analisi.
      1. Backflush almeno 6 mL di tampone di guaina (bi-distillata H₂O) attraverso la tubazione e pozzetto del campione in una provetta senza bloccare allegato utilizzando la funzione di "primo fluido guaina" del software dello strumento.
      2. Misurare bi-distillata H₂O alle 5 µ l s^-1 risciacquo del sistema fluidico fino a meno di 200 eventi s^-1 vengono rilevati presso il tasso di flusso regolare di 0,5 µ l s^-1.
   2. Calibrare il sistema.
      1. Preparare il mix di perle (0,5 μm e 1 μm blu fluorescenti). Diluire la sospensione tallone dalle soluzioni di riserva originale per ottenere concentrazioni uguali.
      2. Continuamente misurare il mix di perle nella gamma₄ log e le cime della perla al loro modello di calibrazione preimpostata in forma manipolando le posizioni di ottica laser e cuvetta flusso. Effettuare le regolazioni finali per la posizione del tallone con l'impostazione del guadagno della PMT.
   3. Controllare la taratura con lo standard biologico come descritto al punto 3.1.3.
   4. Acquisizione del campione.
      1. Diluire 400 µ l di campione macchiato in 1.600 µ l di PBS, misurare e monitorare il numero di eventi per eseguire un test di concentrazione.
         Nota: Tariffe regolato diluizione possono essere necessarie per altre fonti di campione. Il conteggio degli eventi non deve superare 1.200 eventi s^-1 in campioni ricchi di particelle per prevenire la perdita di risoluzione nel forward scatter (esempio negativo in File supplementari 1-S2). Colture pure possono essere misurate con fino a 2.000 eventi s^-1.
      2. Creare un cancello di cella nel software dello strumento durante queste prime misure di prova. Questa porta dovrebbe contenere le cellule marcate ed escludere rumore e perline.
      3. Diluire il campione in base ai risultati del test di concentrazione per eseguire al massimo 1.200 eventi totale s^-1 e aggiungere il mix di perle al campione per monitorare la stabilità dello strumento e fornire la possibilità per un controllo di calibrazione retrospettiva. I campioni devono contenere tra 1.000 e 2.500 eventi in ciascuna delle porte due perle.
      4. Mescolare e misurare il campione fino a 250.000 cellule (Comunità) o 50.000 (colture pure) vengono rilevati all'interno del cancello della cella.
      5. Sciacquare accuratamente con bi-distillata H₂O lo strumento prima di arresto e campioni di commutazione.

4. cella ordinamento

Nota: La cella ordinamento procedura richiede ulteriore strumento impostato e viene eseguita secondo protocolli pubblicati¹².

1. Avviamento e calibrare l'apparecchio come descritto nella procedura 3.1.1-3.1.3, ma utilizzare un 0,5 x soluzione di lavoro del buffer guaina.
2. Impostare la frequenza DD e ampiezza DD per trovare la rottura della gocciolina.
3. Montare le piastre di deflessione, li carica e decidere di modalità di ordinamento per 2 o 4 vie.
4. Eseguire la calibrazione di ritardo goccia interno con 2 μm perline di colore giallo-verde per definire l'intervallo di tempo che prende una particella o una cella di viaggiare dall'interrogatorio punto (cella di colpi laser) fino all'ultima goccia collegato al flusso.
5. Ordina 6 volte 20 perle su un vetrino e contarli con un microscopio per verificare la calibrazione del ritardo di goccia.
6. Preparare il modello di cancello ordinamento.
7. Uso la "modalità singola e one-drop: massima purezza 99%" ad un tasso non superiore a 2.500 totale eventi s^-1 per ordinare 500.000 cellule in massimi 4 cancelli alla volta (4-Way Sort Mode).
8. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione (20.000 x g, 6 ° C, 25 min) e congelare il pellet a-20 ° C per il sequenziamento e successivo isolamento del DNA.
   Nota: Evitare l'ordinamento celle alle porte della città con meno di 5% relativa abbondanza, come il tempo di ordinamento è inversamente proporzionata all'abbondanza relativa. I singoli passaggi sono descritti in dettaglio nel manuale del selezionatore delle cellule. I numeri di cellulare necessari dipendono fortemente i casi di uso rispettivo e protocolli di estrazione. Numerosi metodi sono stati applicati: ddPCR (1.000 cellule^17,19) del rDNA 16S o mcrA amplicone sequenziamento (500.000 cellule^6,10,15) e proteomica (fino a 1,1 x 10⁷ cellule ^16,17). L'ordinamento delle cellule sarà particolarmente vantaggiosa quando combinato con un approccio di metagenomica a causa della più bassa diversità nel subcommunities ordinato.
   Attenzione: Non toccare le piastre di deflettore durante la procedura di ordinamento per alta tensione.

5. analisi dei dati

Nota: La misurazione cytometric produce file di dati di FCS "citometria a flusso standard" con una struttura di dati generalmente uniforme. Tuttavia, citometro a diversi produttori utilizza versioni leggermente adattate e vecchi strumenti potrebbero retrodatare l'introduzione del 2010 del FCS più recenti standard 3.1. Questo può portare a trama puntino le questioni, che impediscono il confronto diretto dei risultati raccolti con strumenti diversi di graduazione. Tuttavia, i singoli punti dati vengono sempre archiviati nelle righe di una matrice, con i rispettivi scatter e i valori di intensità di fluorescenza in diverse colonne. Le pipeline di analisi presentato microbiome utilizzano la dimensione cella distintivo e il contenuto di DNA per descrivere subcommunities microbica. Questi parametri sono correlati con l'intensità di canali di fluorescenza FSC e DAPI (Classificatore celle: FL-4, analizzatore: FL-1) e risultato nei cluster di subcommunity quando visualizzati in appezzamenti di fluorescenza FSC vs DAPI bidimensionale. Queste trame dot consentono l'interpretazione e l'analisi dei dati del flusso cytometry e solitamente logaritmicamente vengono ridimensionate. Essi possono essere visualizzati dai file. FCS utilizzando soluzioni software o terze parti proprietarie citometro e sono la base per la (Cytometric istogramma immagine raffronto automatizzato, CHIC) e semi-automatico (Cytometric Barcoding, CyBar) analisi di comunità.

1. Confronto delle immagini cytometric istogramma
   Nota: Il codice, documentazione dettagliata e un manuale per questo pacchetto sono disponibili presso http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. Sono stati anche pubblicati²⁰.
   1. Installare e caricare il pacchetto R, impostate la directory contenente i file. FCS e impostare un elenco di file eseguendo:
      > fonte ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # Impostare la directory di lavoro sul percorso dove si trovano i file di FCS
      > # Digitare il percorso in virgolette
      > setwd("")
      > N # ottenere un elenco dei nomi di file dei file FCS situati nella directory di lavoro
      > file <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > N # ottenere un elenco dei nomi di file dei file FCS inclusi nel pacchetto
      > file <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + full = TRUE, modello = "*.fcs")
      > N # leggere il primo file FCS come flowFrame
      > telaio < - leggere. FCS(Files[1],ALTER.Names=true,Transformation=false)
      > N # ottenere un elenco dei nomi di parametro/canale
      > unname(frame@parameters@data$name)
   2. Creare immagini per i dati grezzi cytometric eseguendo la funzione del pacchetto "fcs_to_img":
      > N # creare le immagini di istogramma utilizzando i parametri predefiniti
      > fcs_to_img(files)
   3. Definire sottoinsiemi delle immagini istogramma eseguendo la funzione del pacchetto "img_sub":
      > N # creare l'istogramma sottoinsiemi di immagine utilizzando i parametri predefiniti
      > img_sub (archivi, ch1 = "FS. Log",CH2="FL.4.log")
   4. Calcolare i valori di sovrapposizione e XOR per condurre l'analisi di immagine eseguendo la funzione del pacchetto "calculate_overlaps_xor":
      > N # salvare i nomi di tutte le immagini di sottoinsieme come elenco
      > sottoinsiemi <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > N # calcolare la sovrapposizione e XOR immagini e scrivere i valori in due nuovi file
      > risultati <-calculate_overlaps_xor(subsets)
   5. Creare non metriche scaling multidimensionale (mNm) Plot per analisi di somiglianza eseguendo la funzione del pacchetto "plot_nmds":
      > N # visualizzare un grafico di MNM dei campioni
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
2. Cytometric Barcoding
   Nota: Il codice, documentazione dettagliata e un manuale per questo pacchetto sono disponibili presso http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. Sono stati anche pubblicati^11,12.
   1. Sviluppare un modello di cancello principale per l'utilizzo su tutti i campioni.
      1. Caricare i file. FCS nel software analisi utilizzando la funzionalità di trascinamento della selezione.
      2. Fare doppio clic su una misura e scegliere i parametri di assi x e y da elenchi a discesa corrispondente per aprire una trama di fluorescenza FSC vs DAPI.
      3. Utilizzare il poligono strumento di disegno per riprodurre il cancello di cella precedentemente utilizzato per controllare il numero di cellule analizzate nei passaggi 3.1.4.5 e 3.2.4.4 e nome di conseguenza. Trascinare la voce di cancello di cella nell'elenco campione sul gruppo tutti i campioni per piscina.
      4. Fare doppio clic la porta cellula e correggere l'assegnazione di asse per visualizzare gli eventi del cancello di cella.
      5. Definire la subcommunities prevalente a campionario con lo strumento di gates ellittica seguendo le linee guida pubblicate¹² e utilizzare la scansione di CSD o un altro terzo parametro²¹ per garantire l'integrità del modello cancello. Piscina, controllare e regolare l'allocazione di subcommunity sugli altri campioni.
   2. Esportare le abbondanze relative subcommunity in un file. txt da utilizzare nello script R.
      1. Aprire l'editor della tabella con la scheda Modifica.
      2. Aggiungere colonne per ogni subcommunity che è stato definito nel passaggio 5.2.1.5 e impostare la statistica di uscita per "frequenza del genitore" e assegnare loro un nome.
      3. Creare la tabella nell'editor di"tabella" dopo aver scelto il formato e la destinazione di risparmio.
         Nota: Il software di analisi fornisce direttamente abbondanze subcommunity relativo. Possono anche essere ottenuti attraverso la divisione del conteggio eventi nel cancello subcommunity individuali dal conteggio degli eventi nella porta della cella. I valori devono essere salvati in una matrice di delimitato da tabulazione in un file txt che non può contenere tutti i campi n.a. e deve soddisfare alcuni requisiti aggiuntivi per essere letto dal codice R (Vedi manuale e FAQ per istruzioni specifiche).
   3. Installare e caricare il pacchetto di R e caricare i dati eseguendo:
      > fonte ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Digitare il percorso in virgolette
      > setwd("")
      > # Load dataset
      > data(Cell_number_sample)
      > # Visualizza dati
      > Cell_number_sample [, -1]
   4. Normalizzare le abbondanze relative eseguendo la funzione di "normalizzare il" pacchetto:
      # Normalizzare i dati, stampare 2 cifre
      Normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
   5. Creare un codice a barre del normalizzato e un boxplot dell'abbondanza relativa originale eseguendo la funzione del pacchetto "cybar_plot":
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # Plot con parametri predefiniti
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
   6. Creare una trama di MNM dell'abbondanza relativa originale.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > N # MNM trama del numeri di cel normalizzato
      > nmds(Normalized_mean)
   7. Creare l'analisi di correlazione delle abbondanze relative normalizzate e altri parametri eseguendo la funzione di "correlazione" pacchetto:
      > # Load dataset
      > data(Corr_data_sample)
      > Valori di correlazione Visualizza n.
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Esegui analisi di correlazione
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      Nota: CHIC e CyBar si basano su abundances relativo. Tuttavia, citometria a flusso può anche determinare i numeri di cella assoluto, che potrebbero essere di grande interesse per applicazioni biotecnologiche. Per determinare il numero di cella assoluto, il numero di cellule nel cancello di interesse viene diviso per il volume di campione analizzato. Il volume del campione analizzato può essere determinato aggiungendo sospensione tallone con una concentrazione nota nel campione (formula nel File supplementari 1-S7). L'analizzatore di panca superiore è inoltre dotato di una vera caratteristica di conteggio volumetrica che quantifica direttamente il volume nella provetta del campione durante la misurazione. Si consiglia di utilizzare un SYBR Green ho protocollo per il conteggio delle cellule di colorazione.

Results

I seguenti risultati rappresentativi sottolineano la necessità di repliche ed esemplificano tecniche di visualizzazione e l'analisi di diversi dati su ciascuno dei tre insiemi campione. Essi mostrano i risultati di dati possibili condotte di valutazione adatto a rispondere alle domande di ricerca standard circa il relativo set. Tuttavia, le tecniche proposte non sono esclusive per il campionario che si è presentati con. I dati grezzi di citometria a flusso è stato reso pubblicamente disponibili con ID FlowRepository FR-FCM-ZY46. Precedentemente caricato ASC dati sono disponibili sotto ID FR-FCM-ZYD7.

Replicati biologici e tecnici sono stati presi, preparati e analizzati secondo protocolli pubblicati¹¹. Replicati biologici dal PC e ASC sono state prese da tre boccette paralleli. Replicati biologici del A.C. sono stati presi come tre campionamenti successivi presso una località in un impianto su scala pilota. Tre aliquote di un campione erano fissi, macchiate e analizzate per garantire la riproducibilità tecnica. La riproducibilità di metodi è stata valutata secondo procedure pubblicate in precedenza¹¹. Un modello di cancello per tutti i campioni di un campionario (File supplementari 1-S6) è stato utilizzato per calcolare la deviazione standard (%) al cancello.

Per il PC, la massima deviazione standard dell'abbondanza relativa era 3,44%, mentre la deviazione standard media era 2.13% (Figura 1). Per l'ASC e il BC, le deviazioni standard massime dell'abbondanza relativa erano 1,27% e 0,88%, mentre le medie delle deviazioni standard erano 2.13% e 0,21% (File supplementari 1-S8).

Una procedura standard, quando si esamina una cultura di ceppo puro, è la preparazione di una curva di crescita per analizzare la fase di ritardo, i tempi di generazione e densità delle cellule in condizioni specifiche. Abbiamo combinato questa procedura con il workflow di analisi cytometric di flusso per raggiungere una più profonda comprensione del sistema (Figura 2). La FSC vs DAPI fluorescenza trame rivelano gli Stati del ciclo cellulare della cultura in punti diversi della cultura batch. Un modello di cancello principale (File supplementari 1-S6) è stato istituito per quantificare la percentuale di cellule con uno (c1n), due (c2n) e più cromosomi (cXn, Figura 2B). La quota predominante delle cellule inoculate ha avuto un solo cromosoma (93,7% a 0 h). Ciò è cambiato drasticamente durante la crescita esponenziale, dove quasi tutte le cellule hanno contenuto più di uno (99,6%, 4 h) e oltre la metà della popolazione (53,1%) conteneva anche più di due cromosomi. Ciò illustra putida del p.s la capacità di replicare i suoi cromosomi più veloce del suo tempo di generazione.

L'analisi cytometric di flusso ha dimostrato molto utile per monitorare l'evoluzione delle comunità microbiche. Può seguire dinamiche di comunità molto più stretta rispetto l'altro risorsa intensivo metodi molecolari^5,10. Abbiamo evidenziato queste dinamiche in un film e ha guadagnato una panoramica dei fanghi comunità spostamenti nel tempo. Ogni fotogramma di un secondo mostra un grafico di fluorescenza FSC vs DAPI di un punto di campionamento (complementare File 2). Un cambiamento molto distinto tra giorno 0 e 4 ° giorno è stato seguito dall'istituzione di una comunità di nucleo dopo giorno 7. Ulteriori subcommunities si avvicinò al giorno 21. Abbiamo stabilito un modello master cancello (File supplementari 1-S6) attivata la valutazione della dinamica microbica a livello subcommunity. La subcommunities dominante nelle diverse fasi dell'esperimento sono stati chiaramente identificati utilizzando lo strumento CyBar (Figura 3). Combinandolo con la distribuzione di frequenza dell'abbondanza relativa subcommunity ci ha aiutato a selezionare i cancelli che sono interessante (cambiamento significativo in abbondanza innescata in un punto chiave temporale) e vitale (oltre 5% relativa abbondanza) per l'ordinamento e ulteriormente analisi²².

Applicazioni di bioreattore su scala industriale in grado di affrontare potenziali eterogeneità spaziale a causa di limitazioni di agitazione. Sono anche frequentemente esposti a cambiare i parametri operativi, come alternanze nella qualità dei substrati non sintetici. Il BC rappresenta un sistema di questo tipo ed è stato campionato da diverse località in un reattore di flusso dinamico spina. La FSC vs DAPI fluorescenza grafici (Figura 4) dei punti campione esemplare mostrano solo poco spaziale, ma pronunciato eterogeneità temporale. Il BC è stato ulteriormente studiato usando entrambi, il CHIC fast-automatizzato e il modello master cancello più approfondito CyBar approccio basato.

La sua natura automatizzato, veloce e imparziale, rende la CHIC particolarmente interessante per il controllo in loco di bioprocessi in un ambiente industriale. Confronta dati raw FCS di tutti i campioni disponibili. Due di questi confronti vengono visualizzati nella Figura 5. I valori risultanti di dissimilarità confermano le osservazioni precedenti relativa eterogeneità spaziale e temporale. Le MNM trame generati forma la matrice di dissimilarità CHIC di strumenti (Figura 6) ulteriormente sostanzia questo risultato e visualizza di conseguenza.

Inoltre, abbiamo calcolato le abbondanze relative di 23 subcommunities del A.C. utilizzando un modello di cancello principale (File supplementari 1-S6). Stata condotta un'analisi di correlazione di 48 campioni da un periodo di un anno per capire le relazioni funzionali nella comunità microbica. Questo può aiutare a identificare i cancelli di interesse per ulteriori indagini (4 ordinamento delle cellule). Forti correlazioni positive o negative con parametri abiotici come prodotto titoli possono aiutare a capire e ottimizzare gli ecosistemi e processi biotecnologici. La percentuale di caricamento organica inclusa in questa correlazione (Figura 7) esemplifica tale parametro abiotico. G5, G4 e G10 presentano forti correlazioni positive e possibilmente potrebbe contenere specie fermentativo, mentre la correlazione negativa nel G8 potrebbe suggerimento verso methanogenic archaea.

Figura 1: riproducibilità dell'analisi cytometric della pura cultura. Fluorescenza FSC vs DAPI Piazzole con microsfere di controllo (A, B) e bar appezzamenti delle abbondanze di 3 subcommunity [%] con barre di errore che rappresentano ± una deviazione standard (C, D). Le abbondanze relative sono state determinate con il modello di cancello indicato nel File supplementari 1-S6. Tre replicati biologici A, B e C sono state scattate della curva di crescita a 4 h e tre replicati tecnici P1, P2, P3 erano preparati da campione A e misurato tre volte, rispettivamente: M1, M2, M3 e sono date con loro rispettive deviazioni standard. 50.000 eventi sono stati registrati nella porta della cella. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: analisi del ciclo cellulare della coltura pura scattata durante una curva di crescita sperimentare oltre 12 h. (A). Fluorescenza FSC vs DAPI trame delle campionature di bi-oraria che esibiscono un cambiamento del contenuto del DNA durante la fase di crescita esponenziale. Questa serie di misure non includono perline (Vedi File supplementari 1-S3). (B). curva di crescita basata sulla densità ottica con barre di errore che rappresenta una deviazione standard ± e relativo abundances nella subcommunities nel tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: evoluzione della struttura di comunità di fanghi attivi in 24 giorni. (A) la flowCyBar con sovrapposizione di distribuzioni di frequenza visualizzate in BoxPlot per i cancelli singoli disposti dalla somiglianza delle tendenze, il corrispondente colore chiave (B) e un'analisi di somiglianza in uno spirito di trama di MNM R < (0.001 C). le trame sottostanti vengono visualizzate nella sequenza di film in 2 File supplementari. Abbondanze relative sono state determinate utilizzando il modello di cancello in File supplementari 1 - S6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: eterogeneità spaziale e temporale della struttura comunità microbica in scala industriale spina reattore del biogas flusso. Campionamento (A) il confronto tra la struttura della comunità microbica dei quattro porti I-IV giorno 223. II (B), il confronto tra le variazioni di struttura di comunità dipendente tempo dal giorno 0 al giorno 384 in porto. Il rumore è stato tagliato, tardivamente, per migliorare la visualizzazione. 250.000 eventi sono stati misurati nella porta della cella (File supplementari 1-S6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: confronto delle immagini Cytometric istogramma — CHIC. Il principio dell'algoritmo CHIC è esemplificato dal confronto di due campioni che rappresentano eterogeneità spaziale e temporale, rispettivamente. (i) CHIC immagini vengono creati dai file. FCS dopo aver selezionato due parametri per visualizzare (fluorescenza FSC vs DAPI). La scala di grigi (0 – 255) codici il conteggio degli eventi in un pixel. (ii) CHIC sottoinsiemi vengono generati dopo specificando l'area che contiene le cellule (qui: 200 < < 4000, 200 < y < 2200). (iii) XOR combinazione immagine viene creata confrontando pixel tra i sottoinsiemi. Nessuna differenza è uguale a 0 e viene visualizzata come nero. Differenza massima è uguale a 200 e viene visualizzato come bianco. Il corrispondente valore XOR viene calcolato sommando i valori di scala di grigi di tutti i pixel dell'immagine di XOR. (iv) sovrapposizione combinazione immagine viene creata aggiungendo i valori di scala di grigio dei pixel dei sottoinsiemi. Il corrispondente valore di sovrapposizione viene calcolato contando i pixel di un'immagine sovrapposta che non uguale a zero e pertanto contenere informazioni. (v) dissomiglianza valori sono calcolati dividendo i valori XOR e sovrapposizione. Queste sono le basi per la trama di MNM nella Figura 6. Entrambi i valori di dissimilarità e lo spettacolo di trama MNM una quantità trascurabile di spaziale- e un'eterogeneità di comunità temporale pronunciate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: CHIC basato su analisi di somiglianza dei campioni comunità biogas. Il campione 0-day è stato escluso da questo complotto grazie alla sua struttura estremamente diverse comunità distorcere l'analisi (File supplementari 1-S11). La trama di MNM conferma le ipotesi sui basso spaziale- e maggiore eterogeneità temporale fatto utilizzando lo strumento CHIC e spiegato nella Figura 5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: analisi di correlazione sulla comunità biogas. La matrice è stata calcolata usando il coefficiente di Spearman rank ordine e si basa sulle abbondanze relative di 23 subcommunities che sono stati determinati con il modello master cancello in File supplementari 1-S6. Essi sono stati correlati con la percentuale di caricamento organica (OLR) per 48 campioni da un periodo di un anno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: analisi di somiglianza di planctonici (P) e fanghi basato comunità (S) nelle acque reflue. Campioni sono stati prelevati dal bacino di fanghi primari chiarificatore (PCL), attivato (AS) e serbatoio di digestore (DT) di un impianto di trattamento delle acque reflue su vasta scala (dot Parcelle in File supplementari 1-S10). Abbondanze relative sono state determinate utilizzando il modello di cancello indicato nel File supplementari 1-S6. Queste abbondanze subcommunity inoltre sono state analizzate con lo strumento flowCyBar per creare un CyBar (File supplementari 1-S10) e le MNM trama (R < 0.01). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: stabilità di fissazione della pura cultura. Campioni dall'esperimento di curva di crescita preso a 0 h erano conservati oltre 28 giorni a-80 ° C dopo la fissazione in glicerolo al 15%. Fluorescenza FSC vs DAPI Piazzole con controllo perline sono mostrati. Serie di misurazioni non include Perline (File supplementari 1-S3). 50.000 eventi sono stati registrati nel cancello cella (File supplementari 1-S6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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File complementare 2: per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Una riuscita analisi delle popolazioni microbiche e comunità richiede ben sintonizzato citometri, una scelta appropriata dei parametri di cella e un flusso di lavoro affidabile dal campionamento e fissazione verso la valutazione di dati e di misurazione. I parametri di cella selezionata devono consorte con le lunghezze d'onda di eccitazione disponibile. Usiamo e raccomandiamo DAPI, che è molto sensibile alle basse concentrazioni; ma ha bisogno di essere eccitato da un laser UV, che solitamente non è compresa nel set-up standard citometro. Altri coloranti, come ad esempio il SYBR Green I, anche macchia intere popolazioni o comunità ma generalmente forniscono risoluzioni inferiori. Consigliabile non utilizzare pesce procedure o test di vitalità in comunità microbiche. Questi approcci sono impossibili da quantificare, verificare e controllare perché i loro effetti su singole specie nella Comunità è incerto. Essi non possono essere testati in modo affidabile, come una parte sostanziale delle comunità tipico non è ancora disponibile come una coltura pura.

Fasi critiche nel protocollo includono procedure di campionamento e fissazione così come l'ordinamento delle cellule. Il campionamento può essere complicato dalla tendenza di talune colture pure e comunità microbiche di aggregare a flocculi o aderire alle particelle della matrice del campione. È essenziale per dissipare questi aggregati e separare le cellule in un campione prima di introdurli alla analisi cytometric di flusso per garantire risultati affidabili. I protocolli di preparazione presentati sono stati ottimizzati per consentire analisi unicellulare. Una filtrazione finale 50 µm viene eseguita prima della misurazione per rimuovere qualsiasi residui aggregati e impedire l'intasamento di 70 µm ugello del Classificatore celle e la cuvetta flusso dell'analizzatore. Flocculi di cella da impianti di trattamento delle acque reflue sono particolarmente abbondanti, robusto e vitale per la funzione del sistema. Abbiamo studiato la planctonici e fanghi basato comunità microbiche in vasche diverse di un impianto di trattamento delle acque reflue su vasta scala, per testare il protocollo stabilito. I fanghi formando cella aggregati erano chiaramente dissipati e la composizione della Comunità sono rimasti stabili. Inoltre, comunità planctoniche e basati su fanghi hanno esibito la notevole somiglianza tra di loro in tutte le tre vasche campionate (Figura 8, File supplementari 1-S10). Questi risultati sono stati verificati da comparativa 16S rDNA amplicone sequenziamento di un fresco-, un formaldeide trattati-, fissato un formaldeide ed etanolo-e un campione ordinato¹⁰. Tuttavia, straordinariamente impegnativo campioni ambientali, ad esempio forte biofilm o batteri che crescono in catene strettamente collegate, può essere Impossibile per dissipare. Campioni di terreno possono essere particolarmente problematici, come le particelle onnipresente visualizzati nell'istogramma e possono oscurare le cellule di abbondanza. In tali casi, è necessario applicare metodi di sequenziamento tradizionale.

La stabilità di fissazione di ogni nuovo set di esempio dovrebbe essere testata prima di progettare l'esperimento per garantire la validità del risultato. Stabilità di buon fissaggio consente inoltre la colorazione in pool e la misurazione di più punti di tempo campione in un solo giorno. Inoltre consente misurazioni di replica e ordinamento delle cellule retrospettiva dei punti decisivi di tempo dopo la conclusione e la valutazione finale dell'esperimento. La stabilità di fissazione della cultura pura è stata verificata per 28 giorni (Figura 9). Per esperimenti di in loco compreso il trasporto del campione, la stabilità di fissazione deve essere testata per un lungo periodo (in questo caso, 60 giorni per la comunità di fanghi, 195 per la comunità di biogas, File supplementari 1-S9).

La colorazione è di solito non problematica ma deve essere controllata con un biologico standard per consentire l'applicazione di strumenti di valutazione di bioinformatica. Abbiamo usato il finto ceppo di e. coli BL21 (DE3), che è stato fissato in base al protocollo ASC e stoccate per l'uso in ogni batch di colorazione.

DAPI, SYBR Green a parte è stato applicato con successo per risolvere le comunità microbiche per diversi anni^{14,23,24,25,26}. SYBR Green posso risolvere comunità in sottoinsiemi di alta e bassa dell'acido nucleico (HNA e LNA) utilizzando cellule vive in un modus online. DAPI, tuttavia, è più specifico nel suo legame al DNA e consente la distinzione di oltre 50 subcommunities nel set di un campione, ma richiede una fase di fissazione prima della colorazione.

Ordinamento delle cellule è una caratteristica importante di questo approccio e può essere applicato se alcuni subcommunities sono di ulteriore interesse. Deve essere sottolineato che né PFA-(condotta per solo 30 min) né trattamento dell'etanolo o DAPI macchiatura¹⁰ ha avuto un effetto negativo sul sequenziamento degli ampliconi 16S successivi. Potenziale influenza della fissazione e che macchia le procedure sul subcommunity metagenoma analisi ancora bisogno di essere testati.

Un sacco di informazioni sulle funzioni della community e dinamiche di tendenza può essere ottenuto in modo indipendente dall'approccio ordinamento quando che coinvolgono strumenti di bioinformatica che risolvere funzioni delle Comunità a livello di cella per cella virtuale e collegare queste funzionalità con abiotici parametri.

Recentemente, una serie di nuovi strumenti di valutazione di bioinformatica, tutti utili per entrambi il SYBR Green I e gli approcci DAPI, sono stati sviluppati per risolvere modelli di comunità cytometric. Questi sono FlowFP²⁷, i pacchetti utilizzati in questo studio (flowCHIC²⁰, flowCyBar²⁸), un modello di deconvoluzione stabilito con acqua fresca comunità²⁹ e uno strumento utilizzato per discriminare i ceppi secondo loro fisiologico caratteristiche³⁰. Inoltre, cytometric diversità può essere determinato²⁵ e stabilità anche proprietà delle comunità microbiche ora possono essere seguiti con un attrezzo in linea¹⁰.

Così, analisi cytometric di flusso hanno un enorme vantaggio quando si tratta di valutazione rapida dei parametri abiotici possibile correlazioni e comunità microbiche. Tuttavia, ci sono ancora limitazioni al metodo. Non può essere applicato veramente online con lo strumento di flowCyBar, a causa della procedura di impostazione di cancello con esperienza di base. Inoltre, lo sviluppo di citometri a flusso su misura, facile da usare avanzerebbe notevolmente la proliferazione dell'approccio di analisi di flusso cytometric microbioma. Primi passi in questa direzione sono intrapresi²⁸.

Future applicazioni della citometria a flusso microbica possono essere immaginate in ecologia microbica, come permette ad alta frequenza di monitoraggio all'interno della gamma di tempi di generazione batterica ed è stato dimostrato che paradigmi ecologici sono applicabili ai dati cytometric^{5 ,10}. Il metodo è molto utile per le proiezioni di routine degli ambienti naturali come i controlli obbligatori dell'acqua potabile in Svizzera³¹. Può anche essere uno strumento prezioso per le applicazioni mediche come umano¹⁵ o animale³² microbiome screening. Inoltre, gli sviluppi più recenti in bioinformatica potrebbero abilitare microbica flusso cytometry essere un sensore integrato nei controlli di processo dei sistemi microbici gestiti. Comunità microbica cytometry fornisce anche uno strumento di screening per l'ordinamento delle cellule, che permette maggiore risoluzione indagini genomiche dei sottoinsiemi di specifiche comunità.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema Milli-Q Sintesi A10	Merck, Darmstadt, (GER)
Cartuccia di ultrafiltrazione BioPak	Merck, Darmstadt, (GER)	CDUF BI0 01
MoFlo Selezionatore cellulare Legacy	Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150	Lumentum, Milpitas, California, USA		355 nm, 150 mW
Tubi fotomoltiplicatori R928 e R3896	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Giappone)
Software	Summit 4.3Beckman-Coulter, Brea, California (Stati Uniti)
1 & micro; m  FluoSpheres	Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)	F8815	350/440 blu fluorescente
2 μ m YG FluoSpheres	Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)	F-8827	505/515 perline fluorescenti giallo-verdi
0,5 μ m Fluoresbrite BB Microsfere carbossilate PolyScience	, Niles, Illinois (USA)	18339	360/407
1 μ m Fluoresbrite BB Microsfere carbossilate PolyScience	, Niles, Illinois (USA)	17458	360/407 blu fluorescente
1 µ Sonde molecolari mYG FluoSpheres	, Eugene, Oregon (USA)	F-13081	505/515 perline fluorescenti giallo-verdi
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	CAS n. 7778-77-0
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	CAS n. 7447-40-7
Cyflow Space	Sysmex Corporation, Kobe (Giappone)
UV Laser Genesis CX,Coherent	, Inc , Santa Clara (USA)		355 nm, 150 mW
serie H6779-32 PMT	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Giappone)
Software FloMax	Sysmex Partec GmbH, Gö rlitz, (GER)
tutti i filtri ottici	Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	CAS no. 7778-77-0
KCl	Carl Roth, Karlsruhe (GER)	6781.3
FlowJo 10.0.8r1	FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)		Numero di costruzione: 42398
R-software v.3.4.3	R Core Team
flowCHIC	a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar	http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html