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Articolo metodologico

Ganglio simpatico cervicale indotta da etanolo blocco applicazioni per promuovere la rigenerazione del nervo alveolare inferiore canini utilizzando un nervo artificiale

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DOI:

10.3791/58039

⸱

30 novembre 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dental Anesthesia, Nippon Dental University Hospital at Tokyo, 2Department of Dental Anesthesiology, Nippon Dental University School of Life Dentistry at Tokyo, 3Department of Bioartificial Organs, Institute for Frontier Medical Science, Kyoto University

In questo articolo

Sommario

Abbiamo valutato l'effetto del blocco ganglio simpatico cervicale su uso di guaine nervose artificiali la riparazione del nervo. Cani di razza beagle maschio sono stati ciascuno impiantati con un nervo artificiale attraverso un varco di 10 mm nel nervo alveolare inferiore sinistro; ganglio simpatico cervicale di sinistra è stato bloccato con l'iniezione di etanolo 99,5% via il thoracotomy laterale.

Abstract

Poliglicolico collagene acido (PGA-C) tubi sono nervo bioassorbibile riempito con collagene della struttura multicamera, che consistono in pellicole sottili di collagene. Risultati clinici favorevoli sono stati ottenuti quando usando questi tubi per il trattamento del nervo alveolare inferiore danneggiato (IAN). Un fattore critico per la rigenerazione del nervo successo utilizzando tubi di PGA-C è il rifornimento di sangue al tessuto circostante. Blocco ganglio simpatico cervicale (CSGB) crea un blocco simpatico della regione testa e collo, aumentando così il flusso di sangue nella zona. Per garantire un adeguato effetto, il blocco deve essere somministrato con anestetici locali una o due volte al giorno per diverse settimane consecutive; Questo pone una sfida durante la creazione di modelli animali per lo studio di questa tecnica. Per risolvere questa limitazione, abbiamo sviluppato un CSGB indotta da etanolo in un modello canino di lungo termine aumento del flusso sanguigno nella regione orofacciale. Abbiamo esaminato se la rigenerazione di IAN tramite l'impianto di tubo PGA-C può essere rafforzata da questo modello. Quattordici Beagles ciascuno sono stati impiantati con un tubo di PGA-C attraverso un varco di 10 mm a sinistro IAN. IAN si trova all'interno del canale mandibular intorno all'osso, quindi abbiamo scelto la chirurgia piezoelettrica, costituito da onde ultrasoniche, per la lavorazione dell'osso, al fine di ridurre al minimo il rischio di lesioni del nervo e la nave. Con questo approccio è stato ottenuto un buon risultato chirurgico. Una settimana dopo la chirurgia, sette di questi cani sono stati sottoposti a sinistra CSGB tramite l'iniezione di etanolo. CSGB indotta da etanolo è provocato da rigenerazione migliorata del nervo, suggerendo che il flusso sanguigno aumentato efficacemente promuove la rigenerazione del nervo in difetti di IAN. Questo modello canino può contribuire ad approfondire la ricerca sugli effetti a lungo termine di CSGB.

Introduzione

In molti casi, la lesione traumatica del nervo alveolare inferiore (IAN) è iatrogena, spesso causato dall'estrazione del terzo molare o il posizionamento di impianti dentali1,2,3. Lesioni dello IAN possono condurre ai deficit in termica e toccare sensazioni così come parestesia, disestesia, ipoestesia e allodinia. Lesione del nervo è trattato non solo tramite la terapia conservatrice, ma anche di altri metodi, compreso la suturazione e posizionamento dell'autoinnesto. Tuttavia, questi metodi sono inconvenienti, che spesso includono la mancanza di miglioramento di sintomo e difetti neurologici al donatore sito4,5,6.

Il nervo artificiale — poliglicolico tubo di acido-collagene (PGA-C) è stato originariamente sviluppato in Giappone. È un tubo bioassorbibile con suo lume interno riempito con un spongiforme collagene7. Negli esperimenti sugli animali, questo tubo è stato usato per migliorare la rigenerazione del nervo in cani di razza beagle con difetto del nervo peroneo ed è stato indicato per promuovere il livello di recupero superiore nervoso autologo trapianto8. L'applicazione clinica del tubo PGA-C ha cominciato nel 2002 in pazienti con lesioni periferiche del nervo. Inoltre, sono stati raggiunti risultati clinici favorevoli nel trattamento della neuropatia del trigeminal (IAN e nervo linguale)9,10,11. Un fattore critico per la rigenerazione del nervo successo utilizzando tubi di PGA-C è il rifornimento di sangue al tessuto circostante8. Blocco ganglio simpatico cervicale (CSGB) crea un blocco simpatico nella regione testa e collo e aumenta il flusso sanguigno ai rispettivi zona innervata12; così, esso è stato utilizzato nel trattamento della sindrome da dolore regionale complesso e insufficienza circolatoria13,14,15. Tuttavia, ci sono stati solo pochi studi sperimentali sull'efficacia di CSGB in crescente sangue flusso16,17. Per garantire un'adeguata efficienza CSGB, il blocco deve essere applicato insieme ad anestetici locali una volta o due volte al giorno per diverse settimane, così che propone una sfida durante la generazione di modelli animali per studiare questa tecnica. Per risolvere questa limitazione, in uno studio precedente, abbiamo sviluppato un modello canino di flusso sanguigno aumentato a lungo termine nella regione orofacciale18. Il modello è stato generato eseguendo un CSGB iniettando etanolo 99,5%. Abbiamo valutato il flusso sanguigno mucoso orale e la temperatura della pelle nasale di flussometria del laser Doppler e termografia ad infrarossi una volta alla settimana per 12 settimane. Abbiamo trovato che il flusso di sangue della regione orofacial è stato aumentato per 7 – 10 settimane in questo modello.

Nello studio presente, abbiamo valutato gli effetti di CSGB indotta da etanolo sulla rigenerazione del nervo.
Il tubo di PGA-C è stato impiantato in cani beagle attraverso un varco di 10 mm a sinistro IAN. Una settimana più tardi, CSGB è stato effettuato iniettando etanolo. Tre mesi dopo la chirurgia, abbiamo effettuato una varietà di studi elettrofisiologici, istologici e morfologici per valutare gli effetti di CSGB sulla rigenerazione del nervo. Forniamo un protocollo dettagliato per la ricostruzione di IAN utilizzando un tubo di PGA-C e CSGB indotta da etanolo.

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Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con i principi guida per la cura e l'uso di animali e approvato dal Comitato per la ricerca animale dell'Università di Kyoto (Kyoto, Giappone; numero di autorizzazione: R-16-16). Tutti gli sforzi sono stati fatti per minimizzare la sofferenza animale, e tutte le sezioni della presente relazione rispettano l'arrivo (Animal Research: Reporting di esperimenti in Vivo ) linee guida.

1. fabbricazione del tubo PGA-C

  1. Per fabbricare il condotto artificiale del nervo per mezzo di un tubo (PGA) acido poliglicolico assorbibile, utilizzare una macchina dell'intrecciatura tubolare con 48 fusi e cinque fibre di PGA, costituiti da fasci di 26 filamenti (Figura 1)18.
  2. Per rendere la superficie del tubo di PGA idrofila, esporlo alla scarica di plasma.
  3. Utilizzare 1% v/w atelocollagen in cloridrato soluzione7.
    Nota: Atelocollagen è estratto dalla pelle porcina tramite trattamento enzimatico e sottoposti ad un controllo antivirus. Principalmente si compone di tipo I (70 – 80%) e collagene III, il cui coefficiente è descritto dettagliatamente altrove tipo7. Preparare la soluzione di collagene sciogliendo collagene 1 g in 100 mL di soluzione di cloridrato (pH = 3,0). Poiché la densità della soluzione cloridrato è circa 1.0, la concentrazione di collagene w/w è quasi l'1%.
  4. Rivestire il tubo con gli strati di collagene immergendo ripetutamente nella soluzione di cloridrato di collagene 1% per 5 s ogni volta.
    1. Dopo l'immersione, asciugare il tubo su un banco pulito a temperatura ambiente. Eseguire la successiva immersione dopo aver verificato che il tubo è completamente asciutto (circa 6 h per essiccamento ad aria).
    2. Ripetere il processo di rivestimento 10 volte.
  5. Sottoporre il tubo PGA-C a 140 ° C per 24 h sotto vuoto (trattamento dehydrothermal), al fine di controllo bio-assorbimento e reticolazione delle molecole del collagene. Eseguire l'intero processo in condizioni asettiche.
    Nota: Questa procedura genera un tubo della lunghezza finale 14 mm, diametro interno di 3 mm e spessore di 50 μm.

2. intervento chirurgico set-up

  1. Utilizzare i Beagle maschi adulti 9.0 a 13,0 kg di peso.
    1. Animali di casa in gabbie separate, in condizioni controllate della fossa di scolo (ciclo di chiaro e scuro 12-h).
    2. Fornire cibo solido e acqua ad libitum.
  2. Pesare i Beagle.
  3. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici.
  4. Indossare guanti sterilizzati e disinfettare tutte le superfici dell'impostazione del funzionamento con una soluzione di etanolo di 80%. Scartare i guanti usati.
  5. Eseguire handwashing chirurgica.
  6. Mettere su una maschera fresca, camice e guanti sterili.

3. l'anestesia e la preparazione della pelle

  1. Anestetizzare il cane con una miscela di 5 mg/kg ketamina cloridrato e 1 mg/kg xylazina tramite un'iniezione intramuscolare.
  2. Intubare da un tubo trachea di 7,5 mm di diametro e 25 cm di lunghezza.
  3. Riportare il cane nella posizione laterale di destra. Mantenere l'anestesia generale con sevoflurane 3,2% con ossigeno (1,0 L/min).
  4. Utilizzare un dissipatore di calore per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C.
  5. Applicare un gel oftalmico sopra la superficie anteriore degli occhi per evitare l'abrasione corneale.
  6. Attentamente la barba del campo chirurgico (zona del torace lato sinistro) utilizzando i clippers chirurgica. Spruzzare una quantità notevole di soluzione alcolica sopra il sito operatorio. Attendere almeno 15 secondi, ripetere l'applicazione 3 volte.
  7. Registrare la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno durante l'intervento chirurgico.

4. inferiore alveolare nervo ricostruzione utilizzando PGA-C del tubo: sviluppo del modello sola ricostruzione

  1. Iniettare 3 mL di lidocaina 1% utilizzando un ago 27 G al gingiva mandibular di sinistro come un analgesico e anestetico locale.
  2. Eseguire un'incisione trasversale di 5 cm con una lama per bisturi numero 15 nella gengiva mandibola sinistra, per esporre le mandibole dell'animale.
  3. Utilizzare le vibrazioni ad ultrasuoni piezoelettriche per macinare l'aspetto prossimale della mandibola in un rettangolo di 8 mm × 3 cm attraverso l'orifizio mentale posteriore.
    Nota: La frequenza di vibrazione è stato \u2012 28 32 kHz.
  4. Rimuovere la parte frontale della piastra dell'osso mandibolare (dimensioni, 3 cm × 8 mm) per esporre la sinistra di IAN (Figura 2A)18.
    Nota: Il sito di ricostruzione corrisponde all'apice della radice del primo molare
  5. Transetto IAN con un bisturi per rimuovere un segmento di 10 mm.
  6. Inserire i monconi prossimali e distali del nervo reciso il tubo del nervo ad una profondità di 2 mm.
  7. Utilizzare suture in nylon 8-0 e un microscopio chirurgico all'ingrandimento 8x per suturare il tubo prossimale e distale del nervo termina (Figura 2B)18.
  8. Restituire la piastra dell'osso al suo posto nella mandibola.
  9. Chiudere la ferita con suture in nylon 4-0.
  10. Un giorno dopo l'intervento chirurgico, confermare che la piastra ossea della mandibola è in posizione corretta.
    1. 4.10.1 eseguire formazione immagine di tomografia computata (CT) dell'osso facciale nell'ambito dell'anestesia. Impostare parametri di CT come segue: 120 kVp, 200 mAs, 0,5 mm/s, spessore 0,5 mm.
      1. Amministrare l'anestesia usando una miscela di 5 mg/kg ketamina cloridrato e 1 mg/kg xylazina (Figura 3).
  11. Somministrare ampicillina (100 mg/giorno) come un antibiotico e paracetamolo (100 mg/giorno) come un analgesico per una settimana dopo l'intervento chirurgico.

5. indotto da etanolo CSGB: sviluppo della ricostruzione + modello CSGB

  1. Eseguire la ricostruzione di IAN come descritto nella sezione 4 e consentire una settimana per il recupero.
  2. Anestetizzare l'animale con 1,5% sevoflurane in ossigeno (4 L/min) e aria (6 L/min). Rasatura e pulire il campo chirurgico previsto, come descritto nella sezione 3.
  3. Segna la linea di incisione con un pennarello pelle chirurgica tracciando una linea sul petto lato sinistro (Figura 4, la linea di incisione è di 20 cm di lunghezza).
  4. Iniettare 5 mL di lidocaina 1% utilizzando un ago 21 G per la zona del torace lato sinistro come un anestetico locale e analgesico.
  5. Incidere la pelle del torace lato sinistro con una lama per bisturi numero 10.
  6. Incidere lo strato di grasso con un bisturi elettrico per esporre la fascia muscolare.
  7. Esporre il serratus ventralis muscolo e Muscolo scaleno.
  8. Aumentare il muscolo di serratus ventralis e Muscolo scaleno dal ventrale alla dorsale per esporre le costole di seconda e terza (Figura 5).
  9. Eseguire un thoracotomy laterale di sinistra presso il secondo e il terzo spazio intercostale per esporre il ganglio simpatico cervicale di sinistra (Figura 6).
  10. Iniettare 0,2 mL di etanolo 99,5% il ganglio simpatico cervicale usando un ago 30g sotto visualizzazione diretta (Figura 7).
  11. Chiudere lo spazio intercostale con punti assorbibili interrotto 1-0.
  12. Chiudere la pelle con punti in nylon 3-0 interrotto.
  13. Somministrare ampicillina (100 mg/giorno) come un antibiotico e paracetamolo (100 mg/giorno) come un analgesico per una settimana dopo l'intervento chirurgico.
  14. A 1 settimana dopo CSGB, misurare la temperatura della pelle del viso con termografia ad infrarossi per confermare il CSGB.

6. elettrofisiologiche registrazioni

  1. Per misurare il potenziale di azione del nervo sensoriale (SNAP) e velocità di conduzione del nervo sensoriale (SCV) dello IAN tre mesi dopo la ricostruzione, anestetizzare gli animali come descritto nella sezione 3.
    Nota: SNAP e SCV dovrebbero essere misurati su entrambi i lati di controllo sperimentale e normale per ogni cane in entrambi i gruppi di trattamento.
  2. Fare un'incisione nella gengiva mandibola sinistra con un bisturi numero 10.
  3. Rimuovere con cautela la piastra ossea della mandibola per evitare di danneggiare fisicamente il nervo rigenerato.
  4. Stimolare il IAN utilizzando una coppia di elettrodi ad ago, per registrare gli SNAP e SCV.
    1. Inserire gli elettrodi prossimalmente al condotto del nervo.
    2. Applicare stimolo elettrico-10kHz 20 volte.
  5. Analizzare i risultati.
    1. Determinare gli SNAP calcolando l'ampiezza di risposta medio per la stimolazione elettrica.
    2. Misurare la latenza di punta e l'ampiezza di picco dalle registrazioni grafico.
    3. Calcolare l'indice di recupero con la seguente equazione: picco di ampiezza dello IAN sinistro della sola ricostruzione o ricostruzione + CSGB group / picco ampiezza del controllo normale (segmento centrale dello IAN giusto nel gruppo solo ricostruzione)19 ,20.

7. istologici

  1. Sezione preparazione
    1. Tre mesi dopo la ricostruzione, raccogliere il IAN sinistro, tra cui 1 cm del nervo su entrambi i lati del sito ricostruito.
    2. Raccogliere il giusto IAN al livello corrispondente al sito di raccolta sul lato sinistro.
    3. Prefisso i nervi raccolti mediante immersione in glutaraldeide al 2.5% in una soluzione di tampone cacodilato 0.1 M (pH 7.4, 48 ° C, 24h).
    4. Postfix con soluzione al 2% tetrossido di osmio (48 ° C, 4 h) e ferrocianuro di potassio in 0.1 M tampone fosfato (pH 7,4, 2h).
    5. Disidratare i nervi con una serie di soluzioni di etanolo graduato.
    6. Incorporare in resina epossidica (paraffina).
    7. Sezione i campioni ad uno spessore di 0,5 \u2012 1.0 μm.
  2. Analisi morfologica e colorazione blu di toluidina
    1. Macchia di sezioni con soluzione di blu di toluidina.
    2. Ottenere immagini di microscopia utilizzando un microscopio ottico, a 400 ingrandimenti alle seguenti regioni lungo i campioni: lasciato IAN, il centro del segmento rigenerata e 2 mm distalmente al ceppo; IAN di destro, al centro del segmento di IAN corrispondente al sito di raccolta sul lato sinistro.
    3. Selezionare le immagini di tutte le regioni con fibre nervose rigenerate.
      1. In modo casuale selezionare 8 \u2012 10 aree di 100 μm × 100 μm contenenti nervo fibre rigenerate.
      2. Eseguire analisi morfologica utilizzando un software appropriato per misurare i seguenti parametri: percentuale di tessuto e G-rapporto (assone myelinated diametro/myelinated fibre nervose diametro del nervo myelinated fibre nervose diametro (μm) e densità (Conte/zona), ).
  3. Immunostaining
    1. Seguire i protocolli standard per la colorazione di sezione di paraffina.
    2. Incubare con gli anticorpi primari per 30 min a 25 ° C.
    3. Lavare con soluzione salina tamponata con fosfato 3 volte a 25 ° C.
    4. Incubare con anticorpi secondari etichettati con perossidasi di rafano per 30 min a 25 ° C.
    5. Ottenere immagini utilizzando un microscopio ottico.
  4. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
    1. Preparare i nervi come descritto al punto 7.1.
    2. Nervi di sezione con uno spessore di 70 \u2012 90 μm utilizzando un ultramicrotomo.
    3. Macchia di sezioni con citrato di piombo e uranile di Reynold.
    4. Esaminare e l'immagine di microscopia elettronica di trasmissione.

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Risultati

Abbiamo osservato un aumento della temperatura della pelle del viso del lato bloccato 1 settimana dopo il sinistro CSGB (Figura 8).

Ricostruzione post-3 mesi, il tubo di PGA-C presso l'area di ricostruzione è stato assorbito e rigenerazione del nervo alveolare inferiore è stata osservata nella sola ricostruzione e ricostruzione + CSGB gruppi (Figura 9A, B

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Discussione

Presentiamo un metodo efficiente per la rigenerazione di IAN utilizzando un tubo di nervo bioassorbibile in combinazione con CSGB indotta da etanolo. Per questo studio abbiamo usato i cani, da altri modelli animali, come topi, ratti e conigli, hanno una breve aspettativa di vita e di piccola dimensione corporea e quindi non possono essere utilizzati per eseguire le procedure chirurgiche precise. Come IAN si trova all'interno del canale mandibular intorno all'osso, una tecnica chirurgica è necessaria per evitare danni ai ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal dipartimento di organi bioartificiali a Kyoto University Institute per la scienza medica di frontiera. Vorremmo ringraziare il personale veterinario dell'Istituto per la scienza medica di frontiera.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NMP Collagen PSNippon Meatpackers301-84621Atelocollagene estratto dalla pelle giovane dei suini mediante trattamento enzimatico
Tosatrici chirurgicheRoboz Surgical Instrument CompanyRC-5903
Bisturi monouso (No.15)Kai medical219ABBZX00073000
VarioSurg3NakanishiVS3-LED-HPSC, E1133Chirurgia piezoelettrica per le ossa lavorazione
4-0 suture in nylonEthicon8881H
8-0 suture in nylonEthicon2775G
Isepamicin solfatoNichi-Iko620005641
Bisturi monouso (No.10)Kai medical219ABBZX00073000
ago calibro 30Nipro1134
1-0 puntiassorbibiliEthiconJ347H
3-0 Punti in nylonEthicon8872H
Neo ThermoNEC AvioTVS-700Termografia a infrarossi 
Neuropack & Sigma;NIHON KOHDENMEB-5504Registratore ortodromico per registrazione elettrofisiologica
Toluidina BlueSigma-AldrichT3260-5G
Microscopio otticoKeyenceBZ-9000
Anticorpo monoclonale della proteina del neurofilamento umano del topoDAKON1591
Anticorpo policlonale anti-S100 del coniglioDAKOZ0311
Microscopia elettronica a trasmissioneHitachi High Technologies HitachiH-7000
Conteggio dinamico delle celluleKeyenceBZ-H1CSoftware per la valutazione morfologica

Riferimenti

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