Un protocollo di passo dopo passo per controlli non distruttivi e di lungo periodo monitoraggio del processo di rimodellamento vascolare e la degradazione di impalcatura nella cultura in tempo reale di biodegradabili polimerici basati su impalcatura tessutale vasi sanguigni con stimolazione pulsatile usando la tomografia ottica di coerenza è descritto qui.
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Articolo metodologico
Non distruttive monitoraggio dello sviluppo del vaso sanguigno tessutale basati su Scaffold degradabile usando la tomografia a coerenza ottica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli innesti vascolari ingegnerizzati con proprietà strutturali e meccaniche simili ai vasi sanguigni naturali sono tenuti a soddisfare la crescente domanda per bypass arterioso. Caratterizzazione della dinamica di crescita e il processo di rimodellamento dei polimeri biodegradabili basate su impalcatura tessutale vasi sanguigni (TEBVs) con stimolazione pulsatile è cruciale per l'ingegneria del tessuto vascolare. Tecniche di imaging ottici si distinguono come potenti strumenti per il monitoraggio di vascolarizzazione del tessuto ingegnerizzato abilitazione imaging ad alta risoluzione in tempo reale cultura. Questa carta dimostra un non distruttivo e veloce in tempo reale strategia per monitorare la crescita di imaging e rimodellamento del TEBVs in coltura a lungo termine mediante tomografia a coerenza ottica (OCT). Morfologia geometrica viene valutata, tra cui il processo di rimodellamento vascolare, spessore della parete e confronto di spessore TEBV in intervalli di tempo di diversa cultura e presenza di stimolazione pulsatile. Infine, OCT fornisce possibilità pratiche per l'osservazione in tempo reale della degradazione del polimero nei tessuti ricostruzione sotto stimolazione pulsatile o non e in ogni segmento di vaso, di rispetto con la valutazione dell'utilizzo di degradazione polimerica scanning electron microscopic(SEM) e microscopio polarizzato.
Introduzione
Tessutale di vasi sanguigni (TEBVs) è il materiale più promettenti come un innesto vascolare ideale1. Al fine di sviluppare gli innesti per essere clinicamente utile con le simili proprietà strutturali e funzionali come vasi nativi, tecniche multiple sono state progettate per mantenere la funzione vascolare2,3. Anche se ci sono stati derivati dal vasi con tassi di pervietà accettabile durante l'impianto e in studio clinico di fase III4, coltura a lungo termine e l'alto costo mostrano anche la necessità di monitoraggio dell'evoluzione della TEBVs. Comprensione dei processi di crescita, rimodellamento e adattamento matrix(ECM) extracellulare in TEBVs nell'ambiente di chemio-meccanica di biomimetica può fornire informazioni cruciali per lo sviluppo dell'ingegneria di tessuto vascolare.
La strategia ideale per seguire l'evoluzione delle navi derivati dal piccolo diametro5 dovrebbe essere non distruttivo, sterile, longitudinale, tridimensionale e quantitativa. Questa modalità di formazione immagine, tra cui anche cambiamenti prima e dopo trapianto vascolare potrebbe essere valutato TEBVs sotto differenti condizioni di coltura. Sono necessarie strategie per descrivere le caratteristiche dei vasi vivente ingegnerizzato. Tecniche di imaging ottici consentono la visualizzazione e quantificazione di deposizione tissutale e biomateriali. Altri vantaggi sono la possibilità di abilitare imaging dei tessuti profondi e privo di etichetta con alta risoluzione6,7. Tuttavia, immagine specifiche molecole e apparecchiature ottiche meno facilmente accessibile per il monitoraggio in tempo reale è un ostacolo pratico significativo, che ha limitato l'applicazione estesa della microscopia ottica non lineare. Tomografia a coerenza ottica (OCT) è un approccio ottico con modalità di formazione immagine intravascolare come strumento clinico ampiamente usato per guidare la terapia interventistica cardiaca8. Nella letteratura il metodo dell'OCT è stato segnalato come un modo per valutare lo spessore della parete di TEBVs9,10, accoppiato con modalità di imaging affermativa per ricerca di ingegneria del tessuto vascolare. Considerando che, le dinamiche di engineered vascolare crescita ed il ritocco non è stata osservata.
In questo manoscritto, dettagliamo la preparazione del TEBVs basato su scaffold polimerici biodegradabili per la cultura di quattro settimane. Cellule muscolari lisce vascolari arterie ombelicali umane (HUASMCs) sono espanse e teste di serie un impalcature di acido (PGA) poroso poliglicolico degradabile nel bioreattore. Polimeri biodegradabili il ruolo in un substrato temporaneo per l'ingegneria tissutale e hanno un certo degrado tasso11. Al fine di garantire una corrispondenza appropriata tra degrado dell'impalcatura e formazione di neo-tessuto, ECM e PGA ponteggi sono fattori cruciali per il rimodellamento vascolare efficace. Il sistema di perfusione simula il microambiente biomeccanico dei vasi nativi e mantiene una deformazione costante sotto stimolazione di pressione.
L'obiettivo del protocollo presentato è quello di descrivere una strategia relativamente semplice e non distruttiva per TEBVs di imaging e monitoraggio a lungo termine della cultura. Questo protocollo può essere utilizzato per la visualizzazione dei cambiamenti morfologici e misure di spessore dei derivati dal vasi sotto differenti condizioni di coltura. Inoltre, l'analisi del degrado di materiali polimerici nel tessuto impalcature di ingegneria possono essere eseguite per l'identificazione. Combinando metodi di scansione elettrone microscopio polarizzato utilizzati in questo protocollo, la correlazione e la quantificazione di distribuzione di matrice extracellulare e la degradazione di PGA e microscopic(SEM) può essere fatto, che può facilitare la valutazione dell'impalcatura degradazione combinato con formazione immagine OCT.
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Protocollo
1. degradabile PGA impalcatura basato tessutale vasi cultura
- Fabbricazione di Scaffold PGA
- Cucire le maglie di PGA (diametro 19 mm e 1 mm di spessore) nei dintorni di tubazione del silicone sterilizzata con ossido di etilene (17 centimetri di lunghezza, diametro 5,0 mm e 0,3 mm di spessore) usando il 5-0 suturare.
- Cucire il politetrafluoroetilene (ePTFE, 1cm di lunghezza) con il 4-0 suturare su ciascuna estremità della maglia di PGA e sovrapposta da 2 mm.
- Immergere ponteggi PGA con la mano in 1 mol/L di NaOH per 1 min per regolare la struttura spaziale della mesh e bagnare con acqua di grado di coltura del tessuto tre volte per 2 minuti ciascuno. Delicatamente asciugare il patibolo con una velina ogni volta. Quindi asciugare impalcature in un cappuccio con un soffiatore per 1 h.
- Assemblea del bioreattore e Y-bivio per formazione immagine OCT
- Immergere il vetro self-developed bioreattore cilindrici (diametro di 10 cm e 11,7 cm di altezza con quattro labbra all'interno e quattro bracci laterali di fuori del reattore come mostrato nella Figura 1), PGA impalcature, tubo in silicone (diametro esterno 5mm, spessore 0.3 mm), biocompatibile tubi, connettori, ancoretta e attrezzature per il montaggio in un serbatoio di etanolo 95% per 2 h.
- Impalcatura di PGA di tirare attraverso bracci laterali del bioreattore collegato ad un lato con un connettore come pure un altro lato con la Y-giunzione usati per fornire filo guida OCT. Montare un'altra impalcatura PGA nel bioreattore nello stesso modo. Fare riferimento alla Figura 1.
- Montare in ePTFE per labbra bioreattore serrando con suture 4-0.
- Mettete il bioreattore nel serbatoio dell'etanolo ancora per 1 h e asciugare durante la notte in cappa con ventilatore su.
- La semina del HUASMCs e statico bioreattore condizionata
- Isolare HUASMCs da arterie ombelicali umane mediante tecniche di espianto standard.
- Espandere e mantenere le cellule nel mezzo di crescita delle cellule di muscolo liscio è composto da mezzo DMEM, 20% siero bovino fetale, 2,36 mg/mL HEPES, 100 U/mL di penicillina G, prolina di 50 µ g/mL, 20 µ g/mL alanina, glicina di 50 µ g/mL, 1,5 µ g/mL CuSO4, 50 µ g/mL di acido ascorbico , fattore di crescita del fibroblasto base ng/mL 10 e 10 ng/mL piastrina-derivato di fattore di crescita.
- Semi HUASMCs ad una concentrazione di 5 × 106 cellule/mL nel terreno di coltura sopra su impalcature PGA.
- Mettere un ancoretta (1,5 cm di lunghezza) nel bioreattore. Inserire un tubo per l'alimentazione (diametro 5 mm, lunghezza 15 cm) e tre segmenti di tubo corto (diametro 5 mm, lunghezza 7 cm) per lo scambio di gas attraverso il coperchio tappo in silicone.
- Collegare filtri in PTFE da 0,22 µm ad ogni cambiamento per l'aria e tappo di uno eparina a tubo per l'alimentazione. Regolare l'ancoretta con una velocità dell'agitatore di 13 colpi al minuto. Montare il vetro bioreattore, coperchio tappo in silicone e impalcatura PGA nel sistema cultura.
- Consentire HUASMCs di aderire per 45 min di pendente del bioreattore ogni 15min con stand, a sinistra e a destra. I porti di reattore e le articolazioni sono tutti sigillati con film di paraffina.
- Collegare il Luo-Ye pompa, sacchetto di PBS, il driver con tubi biocompatibili come il sistema di perfusione. Aprire l'unità per riempire i tubi con PBS.
- Posto del bioreattore complessivo in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C. Riempire la camera di cultura con 450 mL di terreno di coltura di HUASMCs.
- Premere il tasto stop e spegnere l'alimentazione del dispositivo in auto. Crescere i ponteggi seminati sotto coltura statica per una settimana.
- Cambiare il terreno di coltura ogni 3-4 giorni aspirando la metà del mezzo vecchio attraverso il tubo di alimentazione e ricarica il reattore con una quantità equivalente di terreno di coltura fresco.
- Preparazione del sistema di perfusione per imaging OCT
- Pompare liquidi nella borsa PBS a circolare attraverso tubi biocompatibile e torna alla borsa.
- Aprire l'alimentazione del driver e regolare la taratura della pompa con una frequenza di 60 battiti al minuto e uscita pressione sistolica di 120 mmHg. Regolare i parametri meccanici secondo le esigenze della coltura vascolare ingegneria del tessuto.
- Fare clic sul pulsante eseguire per far funzionare il sistema di perfusione. Forniscono la stimolazione pulsatile fissa sopra ai vasi per 3 settimane di pressurizzazione in modo iterativo biocompatibile tubi10,12 dopo 1 settimana di coltura statica.
2. esecuzione di Imaging ottico con OCT
- Utilizzare una fonte di luce per assicurare la risoluzione assiale del 10-20 µm e la profondità di immagine di 1-2 mm per identificare la struttura del TEBV basato sul dominio della frequenza OCT intravascolare imaging sistema9.
- Accendere l'interruttore di alimentazione e aprire il software di acquisizione immagine.
- Collegare il catetere di imaging ottico di fibra al controllore motore di azionamento e ottico (DOC) con funzione di ritiro automatico del catetere.
- Impostare i parametri di velocità di acquisizione di immagini a 10 frame al secondo con una velocità di ritiro automatico di 10 mm/s.
- Fissare catetere imaging Y-giunzione tramite tappo di eparina con un ago da 18G.
- Inserire il catetere nel tubo di silicone e identificare la strettezza di sutura della mesh PGA prima del caricamento dell'impalcatura di PGA sul bioreattore.
- Posizionare la punta del catetere sopra la regione di interesse. Regolare il dispositivo di pullback e verificare per la qualità di immagine8.
- Acquisire immagini a 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 giorni nella cultura per ogni TEBV individuali e salvare in sequenza con l'osservazione in tempo reale della microstruttura TEBV, tra cui morfologia superficiale, la struttura interna e la composizione.
- Ripetere la misurazione per 3 volte ottenere la misura affidabile dei derivati dal vasi ogni volta. Acquisire una serie di immagini nel corso di test utilizzando il software di acquisizione immagine.
3. imaging analisi
- Utilizzare software di analisi di immagine per misurare lo spessore TEBV. Selezionare l'immagine da analizzare. Fare clic sullo strumento di rilevamento per identificare il lato interno del TEBV dal software automaticamente e manualmente schizzo sulla parte esterna. Un diagramma di spessore apparirà sullo schermo.
- Ripetere la misurazione per 5 volte ottenere misurazioni affidabili dei costrutti. L'analisi di OCT è stata effettuata da due ricercatori indipendenti accecati per le informazioni ottenute.
4. raccolta di TEBV e di processazione dei tessuti
- Aperto il coperchio del tappo in silicone posizionata sopra il bioreattore quando la cultura è finita e scartare il terreno di coltura. Allentare ePTFE dalle labbra di bioreattore e tagliare i tubi in silicone dal lato esterno del ePTFE con le forbici. Raccogliere TEBVs da bioreattore e tagliato in sezioni per la microscopia di scansione.
- Prendere il resto della TEBVs e tagliate in 4 sezioni di spessore µm. Estrarre il supporto tubo in silicone e difficoltà sezioni con paraformaldeide al 4%. Eseguire routine macchiatura istologica di Masson tricromica e Sirius rosso per esaminare la morfologia del collagene e PGA10,13,14.
- Per valutare il contenuto di PGA e componente di collagene, osservare i campioni istologici con Sirius rosso la colorazione di un microscopio polarizzato. Resti di PGA sono chiaramente delimitati attraverso birifrangenza e la zona di residuo può essere quantificata sulla base l' area della sezione trasversale10.
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Risultati
Il sistema tridimensionale cultura consisteva di una camera di coltura in bioreattore e il sistema di perfusione con un ciclo fluido chiuso10,13 (Figura 1). Il catetere di imaging OCT è stato inserito nell'estremità distale della Y-giunzione e tirato indietro nel tubo in silicone per l'imaging. Formazione immagine OCT fu usata per delineare la caratterizzazione strutturale di TEBVs basati su scaffold ...
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Discussione
Per generare ingegnerizzato vasi con strutturali e proprietà meccaniche simili a quelle dei vasi sanguigni nativi può condurre per accorciare i tempi per l'uso clinico ed è l'obiettivo finale di ingegneria vascolare. Tecniche di imaging ottici consentono la visualizzazione di tessuti ingegnerizzati vascolare componenti specifici, che non è possibile monitorare diversi costrutti in tutto gli innesti di cultura e l'esposizione a un ambiente di cultura senza compromettere la sterilità7. In questo art...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere la scienza e la tecnologia pianificazione progetto della provincia di Guangdong (2016B070701007) per sostenere questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Rete PGA | Tubo | ||
| Cole Parmer | |||
| connettore | Cole Parmer | ||
| sistema OCT intravascolare | St. Jude Medical, Inc | ILUMIEN™ OPTIS&commercio; SISTEMA | |
| microscopico elettronico a scansione | Philips | FEI Philips XL-30 | |
| microscopio polarizzato | suture Olympus | Olympus BX51 | |
| Johnson & | |||
| Pompa pulsatile | Johnson Guangdong Cardiovascular Institute | ||
| LightLab Software di imaging | St. Jude Medical, Inc |
Riferimenti
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